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May 10, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3213 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind seltene Krebszellen, die sich selten von primären oder metastatischen Tumoren im Blutkreislauf des Patienten ausbreiten. Die Bestimmung der genetischen Eigenschaften dieser paranormalen Zellen liefert wichtige Daten zur Steuerung des Krebsstadiums und der Krebsbehandlung. Die Zellfokussierung mithilfe mikrofluidischer Chips wurde als wirksame Methode zur Anreicherung von CTCs implementiert. Die unterschiedlichen Gleichgewichtspositionen von Partikeln mit unterschiedlichen Durchmessern über die Breite des Mikrokanals in der Simulation zeigten, dass es möglich war, Brustkrebszellen (BCCs) aus WBCs bei einer moderaten Reynolds-Zahl zu isolieren und zu konzentrieren. Daher demonstrieren wir die Hochdurchsatzisolierung von BCCs mithilfe einer passiven, größenbasierten, markierungsfreien Mikrofluidikmethode, die auf hydrodynamischen Kräften basiert, und zwar durch ein unkonventionelles (Kombination aus langen Schleifen und U-Turn) spiralförmiges Mikrofluidikgerät zur Isolierung von CTCs und WBCs mit hoher Effizienz und Reinheit (mehr als 90 %) bei einer Flussrate von etwa 1,7 ml/min, was im Vergleich zu ähnlichen Geräten einen hohen Durchsatz darstellt. Bei dieser goldenen Flussrate wurden bis zu 92 % der CTCs aus der Zellsuspension abgetrennt. Die schnelle Verarbeitungszeit, die Einfachheit und die potenzielle Fähigkeit, CTCs aus großen Mengen Patientenblut zu sammeln, ermöglichen den praktischen Einsatz dieser Methode in vielen Anwendungen.

Krebs gilt als zweithäufigste Todesursache weltweit. Es wird geschätzt, dass die Zahl der krebsbedingten Todesfälle bis zum Jahr 2030 13 Millionen erreichen wird. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) geht davon aus, dass mindestens 30 Prozent dieser Todesfälle verhindert werden können, wenn Patienten diagnostiziert und behandelt werden, bevor Krebsmetastasen auftreten. Krebsmetastasen treten auf, nachdem sich zirkulierende Tumorzellen (CTCs) von primären oder sekundären Tumorstellen in den peripheren Blutkreislauf ausgebreitet haben1. Es ist unwahrscheinlich, dass Primärtumoren zum Tod führen, aber metastatische Zellen sind schließlich für 90 Prozent aller Todesfälle verantwortlich, während 0,01 Prozent zur Metastasierung führen und die meisten CTCs im Blutkreislauf sterben2. Aufgrund einer Mutation können Primärtumoren im Vergleich zu metastasierten CTCs andere genomische Informationen aufweisen. Onkologen verglichen CTCs und Primärtumoren und stellten fest, dass CTCs aussagekräftiger waren als Primärtumoren. CTCs wurden vor etwa einem halben Jahrhundert entdeckt, ihre Bedeutung für die Krebsbiologie wurde jedoch erst kürzlich deutlich. Diese Verzögerung wird hauptsächlich auf die Schwierigkeit bei der Isolierung von CTCs zurückgeführt (die mit einer Rate von etwa 1–100 in etwa 1000–5000 Leukozyten im Blut von Patienten vorkommen)3,4,5.

Es besteht große Motivation für eine Isolierungstechnik, die eine schnelle und effiziente Trennung von CTCs ermöglicht6. Gängige Diagnosestrategien für Primärtumoren basieren auf der Analyse klinischer Symptome und bildgebenden Verfahren. Diese Methoden können verwendet werden, wenn der Tumor eine bestimmte Größe erreicht hat, und können nicht verwendet werden, um die Existenz des Tumors in seinen frühen Stadien festzustellen7,8. Da Krebszellen, die aus primären soliden Tumoren stammen, größer sind als Blutzellen, haben Forscher ihre Ansätze von affinitätsbasierten Technologien auf eine größenbasierte Trennung umgestellt. Aufgrund dieser Änderung können sie Krebspatienten im Frühstadium leichter identifizieren9. Mikrofluidische Methoden wurden von size10,11 als effiziente und leistungsstarke Werkzeuge für die Zellfokussierung mit hohem Durchsatz hervorgehoben. Mikrofluidische Trennungen werden je nach Energieverbrauch in zwei Kategorien eingeteilt. Passive Methoden nutzen hauptsächlich hydrodynamische Kräfte, während aktive Methoden externe Kräfte oder Steuerungen erfordern, um Zellen zu trennen12. Aktive Methoden ermöglichen eine präzisere Trennung, verfügen jedoch über teure und komplexe Komponenten und einen geringeren Durchsatz; Es dauert länger, bis äußere Kräfte auf die Partikel einwirken und die hydrodynamischen Kräfte überwinden13,14.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Mikrofluidik-Methoden, bei denen die Trägheit aufgrund einer sehr niedrigen Reynolds-Zahl (Re ≪ 1) vernachlässigbar ist, liegt die Trägheits-Mikrofluidik im Bereich mittlerer Reynolds-Zahlen (1 < Re < 100). In diesem Bereich sind Trägheit und Flüssigkeitsviskosität endlich und erzeugen interessante Effekte, einschließlich (i) Trägheitsmigration und (ii) Sekundärströmung15,16. Trägheitsmikrofluidik in geraden, schlangenförmigen und insbesondere spiralförmigen Mustern ist eine der attraktivsten Methoden der größenbasierten Trennung. Aufgrund ihres hohen Durchsatzes, ihrer Einfachheit und geringeren Kosten ist die Trägheitsmikrofluidik ein aufstrebender Kandidat für ein breites Spektrum biomedizinischer Anwendungen17,18. Seo et al. führten 2006 erstmals eine Partikeltrennung mithilfe eines spiralförmigen Mikrokanals durch. Im Jahr 2008 führten Papautsky et al. nutzten diese Methode, um 1,9-um-Partikel von 7,32-um-Partikeln zu trennen19. Im Jahr 2009 haben Dicarlo et al. zeigten, dass diese Trennung auf das Gleichgewicht zwischen Auftriebs- und Widerstandskräften in einem krummlinigen spiralförmigen Mikrokanal zurückzuführen ist20. Seit 2010 wurden viele Anstrengungen unternommen, um die Effizienz und den Durchsatz dieser Methoden mithilfe einfacher, kostengünstiger Plattformen zu steigern21,22.

Im Jahr 2012 haben Sun et al. entwarf am Ende der ersten Phase einen spiralförmigen Mikrokanal mit einer S-Kurve. Obwohl der Mikrokanal eine hohe Effizienz und Reinheit aufwies, hatte er einige Nachteile. Das kritischste Problem war eine niedrige Trennrate, die etwa 0,5 ml/min betrug23. Die Abscheiderate für diesen Spiralmikrokanaltyp verdoppelte sich in den folgenden Jahren. Im Jahr 2017 haben Rossum et al. isolierte Zellen mit einem Wirkungsgrad von 88 % und einer Reinheit von 91 % bei einer Flussrate von mehr als 1 ml/min24. Im Jahr 2014 stellten Karabacak et al. verwendeten einen Serpentinen-Array-Mikrokanal zur Linearisierung und Trennung von Blutbestandteilen25. Im Jahr 2015 haben Sprenger et al. stellte einen speziellen spiralförmigen Mikrokanal her und separierte Zellen zwischen 2 und 18 µm, also das gesamte Spektrum der Blutzellen, mit hoher Durchflussrate und Genauigkeit26. Im Jahr 2017 haben Sonmez et al. kreativ integrierte Serpentinen- und Spiralmuster sowie getrennte Zellen mit hohem Durchsatz und Effizienz27. Im Jahr 2018 haben Ding et al. entwarf ein Gerät mit zwei Spiralkanälen und einem gewundenen Serpentinenkanal, um zirkulierende Krebszellen zu isolieren28.

Im Jahr 2017 haben Lin et al. entwarf einen spiralförmigen Mikrochip mit langen Schleifen, spitzen Winkeln und einem besonderen geometrischen Muster und schaffte es, alle Blutbestandteile mit einer Reinheit und Effizienz von über 90 % zu trennen29. Im Jahr 2019 haben Kosar et al. und Zhang et al. schuf mikrofluidische Chips, die Krebszellen präzise trennen konnten, indem sie Änderungen an den Abmessungen, dem Krümmungsradius und dem Serpentinenanordnungsmuster vornahmen. Der Wert der Arbeit dieser Gruppen liegt in der Einfachheit und den niedrigen Kosten ihrer Chips, die zwei wichtige Kriterien bei der Herstellung mikrofluidischer Chips sind2,30. Im Jahr 2017 haben Kim et al. verwendeten einen geraden Kanal mit einem einzigartigen Querschnitt, um Zellen zu isolieren31. Im Jahr 2021 haben Warkiani et al. verwendete trapezförmige Querschnitte mit verschiedenen geometrischen Mustern zur Zelltrennung und führte einen neuen Querschnitt ein. Im Jahr 2020 haben Bridle et al. untersuchten mithilfe experimenteller Methoden die Verformung der Zellen im spiralförmigen Mikrokanal im Detail. Im Allgemeinen wurden viele Anstrengungen unternommen, um die Effizienz und Geschwindigkeit von Experimenten zu erhöhen32,33,34.

Ziel dieser Studie ist es, die Leistung eines unkonventionellen spiralförmigen Mikrokanals zur Trennung von Krebszellen mit hoher Effizienz und hohem Durchsatz aufzuzeigen. Zu diesem Zweck wurden mehrere Muster simuliert und untersucht; Schließlich wurde durch die Kombination der Spiral- und Serpentinenanordnungsmuster und die gleichzeitige Nutzung ihrer Vorteile ein neuartiges Muster mit einer Kehrtwende entwickelt, um gleichzeitig die Vorteile von Trägheitskräften und Sekundärströmen zu nutzen, um eine effiziente Zelltrennung mit hohem Durchsatz zu erreichen. Durch das große Seitenverhältnis lässt sich die maximale Geschwindigkeit leichter bewegen, und ein hohes Krümmungsverhältnis erleichtert die Manipulation der Sekundärströmung.

Der Mikrokanal wurde unter Berücksichtigung aller Kriterien entwickelt, wie z. B. Verhinderung von Verstopfungen, Einfachheit der Chipherstellung und -prüfung, hohe Effizienz und Reinigung sowie hoher Durchsatz. Im nächsten Schritt wurde das Migrationsverhalten von Standardpartikeln untersucht und die Fähigkeit eines entwickelten Chips zur Trennung von CTCs basierend auf ihrer Größe und Form demonstriert. Schließlich wurden gemischte Kulturen von BCCs und WBCs als Modellsystem verwendet, und diese Zellen wurden erfolgreich mit einer Effizienz von mehr als 92 % bei einer Golden-Flow-Rate von 1,7 ml/min isoliert, was in hoher Übereinstimmung mit der Simulation und dem Experiment steht Ergebnisse. Ergebnisse für echte Krebszellen zeigen einen Rückgang der Trenneffizienz um etwa 2–3 % im Vergleich zu starren Standardpartikeln, was mit der Wirkung der Elasto-Trägheitskraft zusammenhängt.

In einem geraden Mikrokanal erfahren die Partikel Scherspannungen, die Widerstandskräfte und Normalspannungen erzeugen, wodurch Auftriebskräfte senkrecht zur Strömungsrichtung entstehen35. In der Trägheitsmikrofluidik hängt die Trennung von Partikeln vom Gleichgewicht zwischen Trägheitsauftriebskräften und Widerstandskräften ab36,37. Wenn in Newtonschen Flüssigkeiten Partikel zufällig im Mikrokanal mit rechteckigem Querschnitt freigesetzt werden, folgen die Partikel der Systemsymmetrie und konzentrieren sich auf zwei Gleichgewichtspositionen in der Mitte der Innen- und Außenwände38,39. Bei gängigen Anwendungen der Mikrofluidik verformen sich jedoch Partikel in einer nicht-Newtonschen Flüssigkeit mit viskosem und elastischem Verhalten und wandern zur Mittellinie der Kanäle. Wie in Abb. 1 dargestellt, konzentrieren sich Partikel unter dem Einfluss von sechs Hauptkräften in der Poiseuille-Strömung auf bestimmte seitliche Positionen40.

Dominante Kräfte, die an verschiedenen Quer- und Längspositionen auf Partikel im Mikrokanal ausgeübt werden. (A) Mikrokanallänge: Die grünen Pfeile zeigen die Flüssigkeitswiderstandskraft (Ff) an, die die Partikel entlang des Mikrokanals bewegt. Die blauen Pfeile zeigen die wandinduzierte Auftriebskraft (Fw), die die Partikel in Richtung der Mitte des Mikrokanals drückt. Die braunen Pfeile zeigen die Schergradientenauftriebskraft (Fs) an, die die Partikel in Richtung der Mikrokanalwand drückt. (B) Mikrokanalquerschnitt: Die orangefarbenen Pfeile zeigen die rotierende Auftriebskraft (Fr), die Partikel in der Mitte der Kanalwände sammelt. Lila Pfeile zeigen die Dean-Widerstandskraft (FD) an, die Partikel von der Innenwand zur Außenwand drückt. Schließlich zeigen die roten Pfeile die elasto-inertiale Auftriebskraft (Fe) an, die die Partikel in Richtung der Mittellinie des Kanals drückt.

Die erste Komponente, Schergradientenauftriebskraft (FS), ist auf den Geschwindigkeitsunterschied zwischen den Fluidelementen zurückzuführen und erzeugt die Schergeschwindigkeit in jedem Bereich. Dieser Schergradient treibt die Partikel in Regionen mit höheren Schergeschwindigkeiten. Daher werden Partikel nahe der Mitte des Mikrokanals in Richtung der Wände des Kanals geschleudert41. Wenn sich die Partikel jedoch in Wandnähe verschließen, stören sie die Stromlinien. Dadurch erhöht sich der Druck zwischen Partikeln und den Mikrokanalwänden42. Die zweite Komponente, die wandinduzierte Auftriebskraft (FW), ist auf einen Druckgradienten in der Nähe der Mikrokanalwand zurückzuführen, der der Auftriebskraft des Schergradienten entgegenwirkt und die Partikel zurück in Richtung Kanalmitte drückt. Schwimmende Zellen wandern zu Positionen, an denen diese Trägheitsauftriebskräfte im Gleichgewicht sind, wobei die Anzahl der Gleichgewichtspositionen mit dem Kanalquerschnitt zusammenhängt42.

Die dritte Komponente ist eine kleinere Kraft, die Rotationsauftriebskraft (Fr) genannt wird. Diese Kraft entsteht durch die Rotation der Teilchen. Sobald die Gleichgewichtspositionen der Partikel in einem Mikrokanal identifiziert sind, dominiert die Rotationsauftriebskraft und zieht die Partikel allmählich zum Mittelpunkt aller vier Kanalwände43,44. Wenn der Durchmesser der Partikel im Vergleich zum hydraulischen Durchmesser des Mikrokanals klein ist (Partikeleinschlussverhältnis (λ = a/Dh, λ > 0,07)), wird die Größe der Netto-Trägheitsauftriebskraft (FL) von Asmolov45 angegeben:

wobei Rec und Rep (Rep = Rec λ2 > 1) die Reynolds-Zahl des Mikrokanals bzw. des Partikels sind (Es wird akzeptiert, dass die Trägheitsfokussierung von dimensionslosen Parametern wie λ, Rec und Rep abhängt). ρ ist die Dichte der Flüssigkeit, μ ist die Flüssigkeitsviskosität und CL (Rec, xc) ist der Auftriebskoeffizient der Netto-Trägheitsauftriebskraft, die eine unbestimmte Funktion der Position der normalisierten Partikel am Mikrokanalquerschnitt ist, und die Kanal-Reynolds-Zahl. Dieser Koeffizient kann aus numerischen Simulationen oder experimentellen Messungen ermittelt werden, in typischen mikrofluidischen Anwendungen kann jedoch von einem Wert von 0,5 ausgegangen werden. Bei den Partikeln in der Nähe der Mittellinie des Kanals dominiert die Auftriebskraft des Schergradienten. Ab etwa 2,0 DH von der Mitte des Mikrokanals ändert sich das Vorzeichen des Auftriebskoeffizienten, was auf die Überlegenheit der durch die Wand induzierten Auftriebskraft gegenüber dem Schergradienten hinweist Auftriebskraft20,36,43,46.

Durch die Krümmung eines geraden Mikrokanals entsteht eine Sekundärströmung, die die Partikel aufgrund der Zentrifugalwirkung von der Innenwand zur Außenwand des Mikrokanals drückt. Dieser Sekundärfluss kehrt sich durch Bereiche in der Nähe der oberen und unteren Wände des Mikrokanals um. Auf diese Weise werden zwei hin- und hergehende Wirbel in einem krummlinigen Mikrokanal erzeugt, der als Dean-Wirbel bezeichnet wird. Der Dean-Flow fügt den Partikeln eine neue Kraft hinzu, die sogenannte Dean-Drag-Force (FD), die für die Manipulation der Fokuspositionen der Partikel im Mikrokanal nützlich sein kann. Das Gleichgewicht zwischen FD und FL führt zu einem größenbasierten Partikelsortierungsmechanismus im gesamten Mikrokanal. Die Geschwindigkeit dieser Sekundärströmung kann wie folgt geschätzt werden, wobei Um = 3/2 Uavg die maximale Geschwindigkeit des Mikrokanals ist, a der Partikeldurchmesser ist, Dh der hydraulische Durchmesser ist und r die Krümmung des Kanals ist47,48, 49,50,51.

Die Auftriebskräfte fixieren Partikel an Gleichgewichtspositionen, während die Dean-Widerstandskraft dafür sorgt, dass Partikel um den Querschnitt wandern. Eine neue Gleichgewichtslage kann aus dem Verhältnis von FL zu FD abgeschätzt werden, wobei δ das Krümmungsverhältnis29 ist. FD kann basierend auf verschiedenen Parametern wie dem Geschwindigkeitsfeld und dem Mikrokanalmuster gleich, größer oder kleiner als FL sein. Bei sehr geringen Durchflussraten sind FD und FL für die Partikelfokussierung zu klein und die Partikel bleiben im Kanal verstreut. Bei sehr hohen Strömungsgeschwindigkeiten dominiert FD und zwingt die Partikel, dem Dean-Sekundärstrom zu folgen, der die Partikel vermischt, anstatt sie zu fokussieren. Somit bildet ein goldener Durchflussratenbereich FL/FD = 1 nur eine scharfe Gleichgewichtsposition36,42.

Bei größeren Partikeln in der Nähe der oberen und unteren Wände des Kanals ist die inverse FD mit dem horizontalen Schergradienten verbunden, um die Partikel in Richtung der Innenwand zu drücken. Angenommen, größere Partikel erreichen den Bereich nahe der Innenwand. In diesem Fall folgen sie nicht mehr den Dean-Wirbeln, da größere Partikel mehr FL erfahren, was sie dazu zwingt, einer Stromlinie näher an der Innenwand zu folgen als kleinere Partikel. Der FL stellt sich ihnen entgegen und schafft ein Kräftegleichgewicht, in dem sich größere Partikel effektiv fokussieren können. Wie in Abb. 2 gezeigt, ist FL jedoch bei kleineren Partikeln schwächer und kann nicht mit FD konkurrieren. Somit folgen die kleineren Partikel der Dean-Sekundärströmung, bis sie an der Außenwand ankommen. In diesem Bereich sind die Kräfte aufgrund der Position des Partikels schwach und können kleinere Partikel nicht zirkulieren lassen, wodurch eine Fokussierungsposition für kleinere Partikel entsteht. Dieser Unterschied im Fokussierungsverhalten großer und kleiner Partikel, der hauptsächlich vom Geschwindigkeitsfeld und dem Krümmungsverhältnis abhängt, bietet die Möglichkeit, Partikel zu trennen. Daher trägt der Dean-Flow dazu bei, die Partikel nur in einer der potenziellen Gleichgewichtspositionen bei mittlerem FL/FD 2,19,36,42,52,53 zu fokussieren.

Die Auswirkung der Sekundärströmung auf die Zellisolation in einem gekrümmten Kanal, in dem sich größere Partikel in der Nähe der Innenwand und kleinere Partikel in der Nähe der Außenwand ansammeln. Zunächst wirken Auftriebskräfte auf die Partikel und diese sammeln sich in einer Gleichgewichtslage in der Mitte der Wände an. Schließlich wandern die kleineren Partikel aufgrund der Quersekundärströmung zur Außenwand. Die roten Pfeile geben die Auftriebskraft und die blauen Pfeile die Widerstandskraft an. Durch die Krümmung des Kanals wird die maximale Geschwindigkeit auf die äußere Hälfte des Kanals übertragen. Größere Partikel unterliegen einer größeren Auftriebskraft, sodass sie die äußere Hälfte nicht passieren können, und große Partikel, die sich zunächst in der äußeren Hälfte befinden, werden sowohl durch Auftriebs- als auch durch Widerstandskräfte in die Innenwand getrieben. Andererseits reicht die vertikale Auftriebskraft auf kleine Partikel nicht aus, um die Partikel im Kanal auf und ab zu befördern, um der Strömung zu folgen, und so in der Außenwand zu bleiben.

Unter Berücksichtigung der Strömungswiderstandskraft (Ff) und der Elasto-Trägheitskraft (Fe) sollten sechs Kräfte berücksichtigt werden, um die endgültige Position der Partikel im krummlinigen Mikrokanal zu ermitteln. Die Elasto-Trägheitskraft hängt hauptsächlich von den Reynolds- (Re) und Weissenberg- (Wi) Zahlen ab. Das Verhältnis zwischen diesen beiden dimensionslosen Zahlen entspricht der Elastizitätszahl (El), die nur von den Abmessungen des Kanals und den Eigenschaften der Flüssigkeit abhängt40,54,55. Verschiedene Bestandteile von Blutzellen sind verformbar und können aufgrund ihrer Größe in krummlinigen Mikrokanälen isoliert werden. Da FL proportional zur vierten Potenz des Partikeldurchmessers ist, ist es für Blutzellen aufgrund ihrer geringeren Größe im Vergleich zu CTCs schwieriger, sich in Mikrofluidikkanälen zu konzentrieren. Um die kleineren Partikel in die Gleichgewichtsposition zu bringen, sind größere Mischkräfte erforderlich, um eine bessere Fokussierung dieser Partikel zu erreichen2,56,57.

In dieser Studie wurde eine Reihe umfassender Studien unter Verwendung von λ, Re und De entwickelt. Die Ergebnisse zeigten, dass, wenn das Geschwindigkeitsprofil für breitere Kanäle glatter wird, die Schergradientenrate in dieser Richtung abnimmt und der Dean-Widerstand auf die Partikel in den breiteren Kanälen dominiert. Die Hinzufügung einer Krümmung zum Mikrokanal ändert gleichzeitig Richtung und Größe der Schergradientenauftriebskräfte durch Umverteilung des Geschwindigkeitsprofils. Daher reicht ein einfaches Kräfteverhältnis nicht aus, um die Trägheitsfokussierung zu entwerfen, und es ist eine präzise Gestaltung der Krümmung erforderlich46,58. Der Hauptunterschied zwischen diesem Design und früheren spiralförmigen Mikrokanälen ist die Kehrtwende im Strömungsweg16. Diese Kurve hat eine stärkere Krümmung als die sanftere Krümmung der „Schleifen“ in herkömmlichen Spiralkanälen; Die Kombination aus langen Schleifen und scharfen Kurven erhöht die Fokussierung sowohl der großen Zellen (CTCs) als auch der kleinen Zellen (WBCs), während herkömmliche spiralförmige Mikrokanäle bei der Fokussierung kleinerer Zellen weniger erfolgreich sind. Diese Merkmale erhöhen zusammen mit einer hohen Durchflussrate und einem präzisen Design der Mikrokanalkurven die Fokussierung, was in den Simulationsergebnissen deutlich sichtbar ist2,29,59.

In dieser Studie wurde COMSOL Multiphysics 6.0 verwendet, um das Strömungsfeld im Mikrokanal zu analysieren und Querschnittsgeschwindigkeitsprofile zu erhalten. Die Strömung wurde als einphasig und inkompressibel betrachtet und die Navier-Stokes-Gleichungen wurden mithilfe eines laminaren Strömungsmoduls gelöst. Als Randbedingungen wurde eine konstante Durchflussrate am Eingang des Mikrokanals angenommen und am Ausgang des Mikrokanals ein Druck von Null eingestellt. Darüber hinaus wurden die Wände mit rutschfesten und sprungsicheren Bedingungen versehen. Für die Konstruktion des 3D-Modells wurde ein physikalisch gesteuertes, extrem feines Netz verwendet. Das vollständige Netz besteht aus etwa 500.000 Domänenelementen mit einer ungefähren Netzqualität von 0,9, und das GMRES-Lösungsmittel wurde unter anderen Standardlösern ausgewählt. Auf Partikel wirkende Auftriebs- und Widerstandskräfte wurden durch Codierung und das Partikelverfolgungsmodul angewendet. Schließlich wurden die Partikel in einer krummlinigen Koordinate bis zum Auslass verfolgt und beobachtet, dass die simulierten Ergebnisse mit der Theorie übereinstimmten und die Trends erklärten.

Die Gesamtlänge des Mikrokanals beträgt 187 mm; Diese Länge kann kleinen und großen Partikeln den notwendigen Weg bieten, um im Gleichgewichtszustand den maximalen Abstand voneinander zu erreichen. Eine weitere Verlängerung des Weges kann die Möglichkeit einer Kanalverstopfung und Partikelablagerung erhöhen60. Seine Breite beträgt 500 µm und seine Höhe 180 µm. Ein großes Seitenverhältnis kann es einfach machen, die maximale Geschwindigkeit im Mikrokanalquerschnitt zu verschieben und die Fähigkeit zur Manipulation der Partikel zu verbessern61. Die Mikrokanalbreite erhöht sich von 500 auf 900 µm, bevor der Fluss zu den Auslässen umgeleitet wird, und diese Erweiterung erleichtert die Gestaltung von Ausgängen und deren Abbildung62. Die Krümmung beeinflusst die Fokussierung erheblich, daher basiert das Mikrokanalmuster hauptsächlich auf dieser Funktion. Der Mikrokanal besteht aus 4 Schleifen und einer Kehrtwende, um eine geeignete Krümmung zum Trennen von BCCs von WBCs zu haben und die Fokussierung kleinerer Zellen zu verbessern29. Dieser Mikrofluidik-Chip wird mithilfe einer Soft-Lithographie-Methode mit PDMS und einem Glassubstrat63 hergestellt. Das Schema des entworfenen Mikrokanals ist in Abb. 3 dargestellt.

Geometrisches Muster des Mikrokanals mit allen Details und Schema des Aufbaus für experimentelle Experimente.

Das Lymphsystem ist ein ausgedehntes Gefäßnetzwerk, das als primärer Weg zur Ausbreitung metastatischer Brustkrebszellen (BCCs) angesehen werden kann. Die Dynamik, mit der BCCs zu entfernten Stellen in den Lymphknoten wandern, ist inzwischen gut verstanden. Mithilfe von Partikelverfolgungstechniken wurde das Verhalten von BCCs und Standard-Feststoffpartikeln unterschiedlicher Durchmesser analysiert, die zur Simulation des Zellflusses in der Lymphe verwendet wurden. Deutliche Unterschiede zwischen BCC und Partikelverhalten weisen darauf hin, dass Morphologie und Größe ihre Reaktion auf Lymphflussbedingungen beeinflussen64.

Die BCCs hafteten aneinander und bildeten Aggregatpartikel, deren Verhalten unregelmäßig war. Bei der Lymphflussrate waren die MCF-7 im Vergleich zu MDA-MB-231-Zellen, die sich im zentralen Bereich bewegten, gleichmäßig über den Kanal verteilt, was darauf hindeutet, dass metastatische MDA-MB-231-Zellen einem geringeren Bereich an Scherspannungen ausgesetzt sind vivo. Dies legt nahe, dass Größe und Verformbarkeit bei der Modellierung des BCC-Verhaltens in den Lymphgefäßen berücksichtigt werden müssen. In dieser Studie wurden die menschlichen Brustzelllinien MDA-MB-231 (11–22 μm), MCF-7 (11–19 μm) und WBCs (6–16 μm) verwendet64,65. Da etwa zwei Drittel der weißen Blutkörperchen im Bereich von 12–14 μm und etwa ein Drittel der weißen Blutkörperchen im Bereich von 6–9 μm liegen, wird ein durchschnittlicher Durchmesser von etwa 12 μm angenommen. Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften der in dieser Forschung verwendeten Zellen; Diese Zellen wurden vom Biotechnologiezentrum der Universität Tarbiat Modares erhalten.

Um die Leistung des experimentellen Systems zu bewerten, wurden 2–20 μm große polydisperse Mikropartikel (mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10 μm aus Hohlglas) zum Testen ausgewählt. Diese Partikelgrößen wurden so ausgewählt, dass sie der in vivo im Lymphgefäß beobachteten Zellgröße entsprechen. Daher werden monodisperse Partikel (mit Durchmessern von 5 bis 15,6 μm) verwendet, um das Verhalten von BCCs nachzuahmen. Die Partikel wurden in einem Anteil von 0,08 % in destilliertem Wasser mit 1 Vol. % gemischt. % des Tensids Tween-20 (Sigma-Aldrich, Dublin, Irland) wurden der Lösung zugesetzt, um eine Partikelaggregation zu verhindern. Die dynamische Viskosität des destillierten Wassers und der Lymphe beträgt 1 mPa·s und liegt im Bereich von 0,9–1,5 mPa·s, und die Dichten des destillierten Wassers und der Partikel betragen 1000 kg/m3 und liegen im Bereich von 1050–1090 kg/m3. Aufgrund des geringen Unterschieds zwischen ihnen und destilliertem Wasser wurde den Partikellösungen ein Prozentsatz Glycerin zugesetzt66.

Um die Wirkung von Partikeln auf die Flüssigkeit oder andere Partikel zu verhindern (Einwegkopplung), sollte die Wechselwirkung der Partikel in der vorbereiteten Suspension minimiert werden, um eine homogene Suspension mit der entsprechenden Konzentration bereitzustellen, vorausgesetzt, dass die Partikelgröße und der Partikelabstand übereinstimmen Ebenso liegt die geometrische Position der Partikel in der Flüssigkeit in dreieckigen Prismen, deren Seiten gleich L sind. Die Partikelkonzentration wurde als L/D = 15 angenommen, um Partikel-Partikel-Wechselwirkungen zu vermeiden, wobei D der Durchmesser des Partikels und ist L ist der molekulare mittlere freie Weg67.

BCCs wurden in PBS mit 3 % FBS in einer Konzentration von 1.000.000 Zellen pro Milliliter suspendiert und die Zelllinien 20 Minuten lang inkubiert; Die endgültige Zellzahl wurde auf 150.000 Zellen pro ml eingestellt, indem sie in PBS mit 3 % FBS unter Verwendung von 0,05 % Trypsin und 1 mM EDTA resuspendiert wurden. Für Datenvisualisierungs- und Analysezwecke wurden BCC-Konzentrationen gewählt, die überwiegend höher waren als die tatsächlichen in der Literatur angegebenen Zahlen, die auf einer Skala von 1–100 CTC pro Milliliter Blut liegen42,60,64.

Die Probensuspensionen wurden mit einer 10-ml-Kunststoffspritze und einer Spritzenpumpe in den Mikrokanal injiziert. Die Experimente wurden mit einer minimalen Flussrate von 500 μL/min gestartet und bis zur letzten Flussrate von 2500 μL/min fortgesetzt. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit der Tests zu überprüfen. Zur Verbindung der Spritzenspitze mit dem Chip wurden TYGON-Röhrchen (Innendurchmesser: 250 μm, Länge: 15 cm) und Fittings verwendet. Vor der Injektion der Proben wurde der Mikrokanal zur Belüftung und Sterilisation mit 70 % Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen. Danach wurde PBS in den Mikrokanal gepumpt, um die Zelladhäsion an den Kanaloberflächen zu verhindern60,68.

Die Experimente wurden zunächst mit Standardpartikeln durchgeführt und die Flussratenoptimierung mit verschiedenen Flussraten durchgeführt. Die Leistung dieses mikrofluidischen Chips zur Zellfokussierung kann durch das Zählen von Zellen/Partikeln in jedem Experiment ausgedrückt werden. In den Zellproben ist die Effizienz der CTC-Trennung das Verhältnis der Anzahl der CTCs, die aus dem gewünschten Auslass kamen, zur Gesamtzahl der Krebszellen, die aus beiden Auslässen kamen. Dieser Prozentsatz entspricht der Gesamteffizienz der Mikrofluidik Gerät. Ebenso zeigt die Reinigung, wie viel Prozent aller Zellen, die aus dem gewünschten Ausgang für Krebszellen herausgekommen sind, Zielzellen sind.

Die Bildgebung erfolgte sowohl online als auch offline, die Online-Bildgebung diente zur Verfolgung der Partikel und die Offline-Bildgebung zur Partikelzählung. Die Offline-Bildgebung erfolgte im Auslass, sodass die aus jedem Auslass austretenden Partikel in einem separaten Behälter gesammelt wurden, die Suspension anschließend homogenisiert und ein Milliliter davon als Probe entnommen wurde. Mithilfe eines Objektträgers wurden fünf Bilder zufällig von der Probe aufgenommen und die Anzahl der Partikel mithilfe der ImageJ-Software gezählt sowie deren durchschnittlicher Durchmesser berechnet. Für eine bessere Interpretation der Daten wurde für jedes Bild ein geeigneter Schwellenwert gewählt, damit die Trümmer die Ergebnisse nicht beeinflussen und wir keine Zielzellen verlieren. Abbildung 3 zeigt das Schema des Versuchsaufbaus42,60.

Basierend auf Simulationsergebnissen beträgt die Pufferdurchflussrate 1150 μL/min und die Probendurchflussrate 550 μL/min, was im Vergleich zu ähnlichen Modellen von Bedeutung ist. Tests mit standardmäßigen polydispersen (2–20 μm) und monodispersen (5, 15,6 μm) Partikeln stimmen sehr gut mit den Simulationsergebnissen überein; Schließlich war die Isolierung realer Zellen (BCCs und WBC) eine Bestätigung der hervorragenden Leistung des Chips und seiner vollständigen Übereinstimmung mit Theorie, Simulation und Standardpartikeltests.

Um eine möglichst praxisnahe Simulation zu erreichen, wurden 12- und 18-μm-Partikel als Nachahmung des WBC- und BCC-Verhaltens verwendet. Zunächst wurde die Trennung der Partikel in einem geraden Mikrokanal simuliert. Dann wurde dem Kanal nach und nach eine Krümmung hinzugefügt, und es wurde beobachtet, dass sich die Partikel zunächst in Richtung der Innenwand bewegten. Dann wandern die kleineren Partikel aufgrund der Dean-Widerstandskraft zur Außenwand. Schließlich wurde eine Anordnung dieser gebogenen Teile gebildet und die Partikel wurden vom Eingang bis zum Ausgang verfolgt. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Mikrokanäle eine geringe Effizienz, Reinigung und Durchflussraten aufweisen. Die Simulationsergebnisse sind in Tabelle 2 und Abb. 4 dargestellt; jedes wird separat interpretiert und analysiert.

Die Ergebnisse wurden in der COMSOL-Software simuliert; Zuerst wurden die Partikel in einem geraden Mikrokanal verfolgt, dann wurde dem Mikrokanal nach und nach eine Krümmung hinzugefügt und es zeigte sich, dass aufgrund der sekundären Dean-Strömung kleinere Partikel begannen, in Richtung der Außenwand zu wandern. Schließlich wurde eine Reihe dieser gebogenen Stücke geformt. Rote Partikel haben einen Durchmesser von 18 µm und blaue Partikel einen Durchmesser von 12 µm. Diese Partikel ahmen das Verhalten von WBCs bzw. CTCs nach (COMSOL Multiphysics® Version 6.0 ist verfügbar: https://www.comsol.com/release/6.0).

Anschließend musste die Partikelflugbahn erhöht werden, um die Trennung abzuschließen. Zu diesem Zweck verläuft der Kanal spiralförmig weiter und der Krümmungsradius ändert sich nicht wesentlich. Eine annähernd konstante Krümmung kann sowohl ein Vorteil als auch ein Nachteil sein. Wenn diese Widerstandskraft, wie bereits erwähnt, einen bestimmten Grenzwert überschreitet, führt dies zu einer Vermischung der Partikel. Bei herkömmlichen Spiralen ist der Wirkungsgrad hingegen nicht sehr hoch. In serpentinenförmigen Mikrokanälen wird dieses Problem durch plötzliche und willkürliche Krümmungen gelöst. Die Merkmale dieser beiden Mikrokanäle können gleichzeitig genutzt werden, und ein unkonventioneller spiralförmiger Mikrokanal kann mit einem nahezu konstanten und langen Krümmungspfad mit gewünschten Krümmungen entworfen werden. Daher können U-förmige, L-förmige und S-förmige Windungen in den Partikelbewegungspfad eingebettet werden.

Um das Verhalten von Zellen in einem spiralförmigen Mikrokanal besser zu verstehen, wurde die Partikelfokussierung in mehreren konventionellen und unkonventionellen spiralförmigen Mikrokanälen bei unterschiedlichen Flussraten (500–2500 μL/min) simuliert. Die Bewegung von Partikeln mit den Größen 20 μm, 18 μm, 15 μm, 12 und 5 μm wurde untersucht und das Trennpotential in diesen Mikrokanälen untersucht. Durch diese Simulationen wurde das Trennverhalten von MCF-7 (11–18 μm), MDA-MB-231 (11–22 μm) und WBCs (6–16 μm) untersucht.

Es sind weitere wesentliche Faktoren zu berücksichtigen, beispielsweise die erforderliche Zeit für die Durchführung des Tests, die Einfachheit der Durchführung und Wiederholung des Tests sowie die Möglichkeit, den Chip mit Standardwerkzeugen herzustellen. Wenn andererseits der Weg zu lang ist und die Anzahl der Windungen mehr als ein paar beträgt, steigt die Möglichkeit einer Kanalverstopfung, Partikelablagerung und Blasenbildung. In diesem Design zeichnete sich der Chip durch eine hohe Effizienz, eine beeindruckende Durchflussrate, eine einfache Herstellung und gleichzeitig einfache Tests aus. Tabelle 3 und Abb. 5 fassen die Simulationsergebnisse zusammen. Die Gleichgewichtslage der Zellen, die am Auslass in zwei getrennten Teilen vorliegen, weist auf das Vorhandensein zweier Quereckpunkte hin, was die Theorie bestätigt.

Die Simulationsergebnisse der COMSOL-Software zeigten zunächst, dass Partikel in einem herkömmlichen Mikrokanal mit 0,9 ml/min verfolgt wurden, dann wurde der Weg der Partikel um eine Kehrtwende erweitert und es zeigte sich, dass aufgrund des höheren Krümmungsverhältnisses kleinere Partikel vollständig nach außen wandern Wand mit 1,7 ml/min. Die Gleichgewichtslage der Zellen, die am Auslass in zwei getrennten Teilen vorliegen, weist auf das Vorhandensein zweier Querecken hin. Rote Partikel haben einen Durchmesser von 18 µm und blaue Partikel einen Durchmesser von 12 µm. Diese Partikel ahmen das Verhalten von WBCs bzw. CTCs nach (COMSOL Multiphysics® Version 6.0 ist verfügbar: https://www.comsol.com/release/6.0).

In krummlinigen Mikrokanälen mit Windungen können plötzliche Änderungen im Krümmungsverhältnis die Richtung und Größe des Dean-Flusses ändern, anstatt konstant zu sein. Vor der Interpretation der Ergebnisse ist es hilfreich zu erwähnen, dass drei wesentliche Faktoren berücksichtigt werden sollten, um die auf die Zellen wirkenden Kräfte besser analysieren zu können: Die Richtung und Größe der Dean-Widerstandskraft, die von der vertikalen Position der Zellen im Mikrokanal abhängt, und die Verschiebung der Strömungsgeschwindigkeitsmaxima, die sich auf die Größe der Schergradientenauftriebskraft auswirkt. Da das Geschwindigkeitsprofil in geraden Mikrokanälen parabolisch ist, liegt die maximale Geschwindigkeit in der Mitte des Mikrokanals. Das Hinzufügen einer Krümmung zum Mikrokanalmuster führt nicht nur zur Entstehung des FD, sondern verändert auch den Ort der maximalen Geschwindigkeit, der von Re, Krümmungsverhältnis und Querschnitt abhängt. Die Richtung und das Vorhandensein der auf Zellen wirkenden Kräfte hängen von der Position der Zelle im Mikrokanal ab.

Ein Bild des mit der Soft-Lithographie-Methode hergestellten Chips ist in Abb. 6 dargestellt und die maximale Geschwindigkeitsverschiebung aufgrund der U-förmigen Drehung wird simuliert. Wenn sich kleinere Zellen in Region 1 befinden, wo die maximale Geschwindigkeit in der äußeren Hälfte des Mikrokanals liegt, werden diese Zellen durch den Einfluss von FD zur Außenwand gedrückt. Das Gleichgewicht von FL und FD führt zur Bildung einer konzentrierten Zelllinie nahe der Mittellinie des Mikrokanals und zur Außenwand geneigt. Allerdings kann diese Kraft größere Partikel nicht anschieben, da bei den größeren Partikeln die Auftriebskraft überwiegt. Wenn Zellen in Region 2 ankommen, beginnen sich kleinere Partikel, die sich in der vorherigen Position nahe an der Außenwand befanden, sowohl durch FL als auch durch FD in Richtung der Innenwand zu bewegen, da die maximale Geschwindigkeit nahe der Mittellinie des Querschnitts liegt. Wenn die Zellen Region 3 erreichen, liegt die maximale Geschwindigkeit in der Mittellinie wie bei einem geraden Mikrokanal, und verstärkte FD und FL drücken die kleineren Partikel in Richtung der Außenwand (die Innenwand wird zur Außenwand und umgekehrt).

Maximale Geschwindigkeitsverschiebung durch hohes Übersetzungsverhältnis. (A) Zeigt die Drehung des Mikrokanals, der durch Softlithographie unter dem Mikroskop hergestellt wird. (B) Veranschaulicht das Geschwindigkeitsfeld sowie die maximale Geschwindigkeitsverschiebung entlang des Mikrokanals. (C) Dieses Diagramm zeigt die Stromlinien des Strömungsfeldes innerhalb des Mikrokanals. Es ist klar, dass die Kompression dieser Stromlinien nach der Kehrtwende zunimmt, und (D( zeigt an, dass die maximale Geschwindigkeit von der Außenwand zur Innenwand verschoben wurde.

Wenn Partikel in Region 4 ankommen, können sich kleine Partikel aufgrund der erhöhten FD und FL nahe an die Außenwand bewegen. In diesem Bereich nahm die vertikale und horizontale Größe von FS zu, sodass größere Partikel, die sich bereits von der vorherigen Position in der Außenwand befanden, zum oberen und unteren Ende des Kanals wandern, da die Auftriebskraft direkt mit der vierten Potenz des Durchmessers zusammenhängt , Wie in Abb. 2 dargestellt, gelangen die größeren Partikel näher an die Ober- und Unterseite des Mikrokanals, und danach beginnen größere Partikel aufgrund der verbesserten FD und FL zur Innenwand zu wandern. Wenn Zellen in Region 5 ankommen, wandern immer noch größere Partikel zur Innenwand und bilden eine Gleichgewichtslinie in der Nähe der Innenwand. Andererseits befinden sich kleinere Partikel in der Gleichgewichtslinie nahe der anderen Wand, sodass der Abstand zwischen den kleineren und größeren Partikeln deutlich zunimmt.

Bei niedrigem Re konzentrieren sich kleinere Zellen aufgrund des relativ geringen Trägheitsauftriebs und der Dean-Widerstandskräfte in Kombination mit der geringen Strömungsgeschwindigkeit zunächst in einem breiten Band nahe der Mittellinie. Die Fokussierung wird mit einer Erhöhung des Re bzw. der Krümmung leicht verbessert. Auf den ersten Blick ist dieses Verhalten der Zellen ohne eine vollständige Bewertung unerwartet, da sich FS und FD mit ap3 bzw. ap ändern. Eine Erhöhung der Durchflussrate führt zu einer Erhöhung sowohl von FS als auch von FD. Allerdings steigt FS bei größeren Partikeln stärker an als FD, was zur Migration führt. Dieses Migrationsverhalten ist bei kleineren Partikeln aufgrund ihrer Größe nicht deutlich zu erkennen. Die horizontalen und vertikalen Komponenten von FS, die auf kleinere Partikel wirken, sind bei gleicher Strömungsgeschwindigkeit kleiner als bei größeren Partikeln. Abbildung 6 zeigt die Verschiebung der Maximalgeschwindigkeit in jedem der fünf genannten Bereiche.

In der Simulation wurden der Theorie zufolge 1000 weiße Blutkörperchen und 10 Krebszellen verwendet, um den Isolationsprozess und die Machbarkeit einer Trennung dieser Zellen möglichst realitätsnah zu simulieren. Im Experiment wurden zur Validierung dieser Simulation zunächst Standardpartikel mit Durchmessern von 2–20 µm verwendet. Obwohl die Trennung dieses Bereichs von den Zellen nicht das Hauptziel ist und in dieser Forschung weiße Blutkörperchen und Krebszellen voneinander getrennt werden, umfasst dieser Bereich des Partikeldurchmessers alle Zellen im Blut. Die Trennung dieses Bereichs wurde ebenfalls in der Simulation untersucht, und es ist zu beachten, dass es schwieriger wird, sie zu trennen, wenn die Durchmesser der Partikel näher beieinander liegen. Daher kann die Trennung von 12- und 18-μm-Partikeln sinnvoll sein Wahl unter Berücksichtigung des durchschnittlichen Durchmessers verschiedener Blutbestandteile. Schließlich wurden echte Zellproben isoliert, und bei einer Flussrate von 1,7 ml/min wurden Zellen mit einer Effizienz und Reinheit von über 90 % isoliert, was in sehr hoher Übereinstimmung mit den Simulationsergebnissen ist.

Eine Mischung aus monodispersen (5 und 15,6 μm) und polydispersen (2–20 μm) Mikropartikeln wurde auf Validierung und Durchführbarkeit der Trennung getestet. Die Partikel bleiben im Mikrokanal dispergiert, bis Q = 1 ml/min. Bei Q = 1,25 ml/min beginnen sich die Partikel ungefähr auf dem Mikrokanal zu konzentrieren. Bei 1,5 mL/min wird die Fokussierungslinie schmaler, sodass nahezu alle Partikel zum gewünschten Auslass geleitet werden. Durch Erhöhen der Durchflussrate auf Q = 1,7 ml/min werden die Partikel dann scharf fokussiert, und fast alle Partikel verlassen den gewünschten Auslass mit einer Fokussierungseffizienz von etwa 94 %. Bei höheren Durchflussraten beginnen sich die Partikel erneut zu vermischen, was zu einem deutlichen Effizienzabfall führt. Tabelle 4 zeigt die Details der experimentellen Tests mit Standardpartikeln.

Bei Flussraten zwischen Q = 1,4–1,7 ml/min betrug die Trenneffizienz mehr als 80 %. Wenn die Flussrate von Q = 1,4 ml/min auf 1,7 ml/min anstieg, stieg die Trenneffizienz von 81 auf 94 %. Eine übermäßige Erhöhung der Durchflussrate führte zu einem erheblichen Rückgang der Effizienz, sodass nur 65 % der Zielpartikel bei der gewünschten Leistung bei Q = 2 ml/min beobachtet wurden. Abbildung 7 zeigt die Ergebnisse experimenteller Tests bei Flussraten von 1,4, 1,55 und 1,7 ml/min. Das Verhalten der Partikel variierte erheblich mit der Durchflussrate, wie in Abb. 8 dargestellt. Um die Trennung zu optimieren, wurden 12- und 18-μm-Partikel für die Simulation und polydisperse Partikel für experimentelle Tests verwendet.

Das Balkendiagramm für die Partikelabscheidung ergibt sich bei verschiedenen Durchflussraten.

Simulations- und Versuchsergebnisse zur Partikeltrennung bei unterschiedlichen Flussraten. Um die optimale Flussrate zu finden, wird die Flussrate von 1 ml/min auf 2 ml/min erhöht, die Auslässe werden in jeder Phase abgebildet und analysiert. (A) Experimentelle Ergebnisse zur Partikeltrennung, (A) und (B) veranschaulichten die gewünschten Auslässe für kleinere bzw. größere Partikel bei 1,4 ml/min. (C–F) Zeigte das gleiche Ergebnis bei 1,55 ml/min bzw. 1,7. Das Ergebnis von 1,7 ml/min war besser als bei anderen Flussraten. (B) Geben Sie die Größenverteilungen von Standardpartikeln an. (C) Der optimale Fluss, der sowohl durch Simulation als auch durch experimentelle Methoden erzielt wurde, betrug etwa 1,7 ml/min. Bei dieser Durchflussrate werden mehr als 90 % der kleineren und größeren Partikel abgeschieden.

Da das Partikelverhalten maßgeblich von der Größe abhängt, legen wir zum besseren Verständnis bei der Analyse der Ergebnisse Wert auf die Größennähe zwischen den Zellen und den Partikeln. Die Größe der WBCs liegt zwischen 6 und 16 μm, ihr durchschnittlicher Durchmesser beträgt 12 μm. Der Fokussierungstrend von WBCs ähnelt eher dem der 10-μm-Partikel. Darüber hinaus liegt die Größenverteilung von MCF-7 zwischen 11 und 21 μm und der durchschnittliche Durchmesser von MCF-7-Zellen beträgt 15 μm, was eher bei 15,6 μm im Vergleich zu 20 μm liegt, und das Fokussierungsverhalten der MCF-7 7 Zellen ähneln den 15,6 μm großen Partikeln. Der durchschnittliche Durchmesser der MDA-MB-231-Zellen beträgt 18 μm zwischen 15 und 20 μm; Der Trennungstrend dieser Zelle ist eine Kombination aus den Trends der 15,6- und 20-μm-Partikel.

Die höchste Effizienz wird bei Q = 1,7 ml/min erreicht, was beweist, dass Standardpartikel das Verhalten von Zellen imitieren können. Ähnliche Tests wurden mit realen Zellen (Mischung aus WBC und BCCs) basierend auf der durch das Experiment und die Simulation erhaltenen Golden-Flow-Rate durchgeführt und die Trennleistung wurde anhand der Zellzahlen quantifiziert. Blutproben wurden mit einer Vorverarbeitung verarbeitet und vor der Injektion in den Mikrochip lysiert, um RBC-Interferenzen zu verhindern. Die Zahl der BCCs in diesen Proben wurde als viel höher angesehen als die 2 CTC-ähnlichen Zellen/ml, die in gesunden Blutströmen gefunden wurden. Dieses Experiment zeigte, dass der entwickelte Chip zur Isolierung von Krebszellen nützlich ist und mehr als 90 Prozent der Krebszellen mit einem hohen Durchsatz aus den Blutproben der Patienten isoliert werden können. Die Abbildungen 9, 10 und Tabelle 5 zeigen die Ergebnisse der BCCs- und WBC-Trennleistung. Jedes Experiment wurde dreimal mit einer Standardabweichung von 0,2 wiederholt, was darauf hinweist, dass die Experimente eine gute Reproduzierbarkeit aufweisen.

Versuchsergebnisse zur Zelltrennung bei goldener Flussrate. (A) und (B) veranschaulichen die Reihenproben von weißen und Krebszellen ohne jegliche Vorverarbeitung, (C) zeigt den gewünschten Ausgang für weiße Blutkörperchen (kleinere Zellen) und (D) zeigt den gewünschten Ausgang für Krebszellen ( größere Zellen) mit 1,7 ml/min. Bei dieser Durchflussrate werden mehr als 90 % sowohl der CTCs als auch der WBCs abgetrennt und gereinigt.

Der Vergleich zwischen realen Zellen und starren Partikeln bei verschiedenen Durchflussraten.

Im Gegensatz zu starren Partikeln wirken aufgrund der Verformbarkeit der Zellen elasto-inertiale Auftriebskräfte auf die Zellen, was zu einer seitlichen Wanderung der Partikel führen kann. Somit ist die kombinierte Kraft auf die Zelle größer als die, die auf eine starre Kugel mit dem gleichen Volumen in der Poiseuille-Strömung wirkt. Es ist erwähnenswert, dass auch die Fokussierungsleistung erheblich erhöht wurde, ohne dass die Lebensfähigkeit der CTCs erheblich beeinträchtigt wurde. Abbildung 10 vergleicht die Ergebnisse für feste Partikel und verformbare Zellen. Sie zeigt einen leichten Rückgang der Ergebnisse für reale Zellen um etwa 2–3 %. Der Grund für diese Verringerung der Effizienz hängt mit den elasto-inertialen Auftriebskräften und der Verformung der Zellen zusammen Zellen, was darauf hinweist, dass die Verformung der Zellen auch in der Simulation berücksichtigt werden sollte.

Die aus den verarbeiteten Videos einer hochkonzentrierten Suspension starrer Partikel erhaltenen Partikelbahnen stimmten gut mit den Simulationsergebnissen überein, wie in Abb. 11 dargestellt. Während der Simulation waren die Fokussierungsbänder schmaler als das experimentelle Ergebnis. Die Tatsache, dass feste Partikel nicht vollständig kugelförmig sind, ist der Grund für diesen geringfügigen Unterschied in den Ergebnissen. Diese Ergebnisse zeigen jedoch auch, dass Q = 1,7 ml/min die optimale Flussrate zur Maximierung der Trenneffizienz ist, was in guter Übereinstimmung mit den Simulationsergebnissen steht.

(A) und (B) zeigen die Ausgaben, die mit größeren bzw. kleineren Partikeln verbunden sind. (C) Online-Trajektorie hochkonzentrierter Zellproben bei goldener Flussrate.

Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Physik von Mikroflüssen, Mikropartikelbewegungen und genomischen Charakterisierungsinstrumenten ist die Untersuchung der Tumorheterogenität zum besseren Verständnis des Tumorfortschritts und der Tumorbehandlungen durch den Einsatz der NGS-Methode zugänglicher denn je. Experten glauben, dass die Untersuchung der Genetik von aus dem Blut isolierten CTCs für die Diagnose und Behandlung der Krankheit sehr wichtig sein kann. Diese Methode kann in zukünftigen klinischen Studien verwendet werden, wobei die genomischen Informationen von CTCs, die durch Mikrofluidik-Chips isoliert werden, als Biomarker zur Überwachung der Behandlung solider Krebszellen verwendet werden.

Um Blutbestandteile in einer wirklich markierungsfreien Methode voneinander zu trennen, haben wir eine Strategie mit Trägheitsmikrofluidik entwickelt, die nicht nur das empfindliche Gleichgewicht von Trägheitskräften und Dean-Widerstandskraft nutzt, sondern auch eine starke Krümmungsdrehung kombiniert, um die Richtung der Flüssigkeit zu ändern rationalisiert. Das Verhalten von weißen Blutkörperchen mit einem mittleren Durchmesser von 12, MDA-MB-231 und MCF-7 mit einem mittleren Durchmesser von 18 bzw. 15 wurde in einem spiralförmigen Mikrokanal mit einer Kehrtwende auf dem Weg der Partikel beobachtet Bewegung in dieser Untersuchung.

Simulationsergebnisse zeigten, dass die Fokussierung der WBCs und CTCs aufgrund der maximalen Abstände zwischen den WBCs und CTCs bei Q = 1,7 ml/min möglich sein kann. Bei dieser goldenen Flussrate wurden etwa 93 % bzw. 92 % der CTCs und der WBCs aus der Mischung isoliert. Die Leistung des untersuchten Chips zeigte eine perfekte Übereinstimmung mit den Simulationsergebnissen und theoretischen Prinzipien.

Im Gegensatz zu anderen Trägheitsfokussierungsmethoden verbessert das Überqueren innerer Schleifen zu äußeren Schleifen durch Verwendung einer Drehung mit hohem Krümmungsverhältnis (U-Turn) in einem Spiralmuster das Fokussierungsverhalten sowohl von CTCs als auch WBCs, was zu einer hohen Reinheit bei deutlich hohem Durchsatz führt.

Eine größenbasierte Partikeltrennung wurde in diesem Test bei einem Hochdurchsatz von etwa 1,7 ml/min durchgeführt und verbessert, was im Vergleich zu anderen ähnlichen Mikrochips eine etwa doppelt so hohe Durchflussrate ergibt.

Der Vergleich zwischen der Gleichgewichtsposition von Zellen und Standardpartikeln zeigte, dass der Steifheits- und Elastizitätseffekt in zukünftigen Simulationen berücksichtigt werden sollte.

Jüngste Fortschritte in der Trägheitsmikrofluidik bieten ein breites Anwendungsspektrum. Den Ergebnissen dieser Forschung zufolge ist es möglich, die CTCs mithilfe eines unkonventionellen spiralförmigen Mikrokanals mit hohem Durchsatz aus dem Blutkreislauf des Patienten zu trennen. Es müssen jedoch noch weitere Studien durchgeführt werden, um diesen Chip in den klinischen Einsatz zu bringen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel enthalten. Weitere zusätzliche Datensätze, die während der aktuellen Studie verwendet wurden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Fakultät für Maschinenbau, Tarbiat-Modares-Universität, Teheran, Iran

Vahid Omrani und Mohammad Zabetian Targhi

Abteilung für medizinische Wissenschaften, Tarbiat-Modares-Universität, Teheran, Iran

Fatemeh Rahbarizadeh

Fakultät für Maschinenbau und Luft- und Raumfahrttechnik, Monash University, Melbourne, VIC, 3006, Australien

Bete Nosrati

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V. Omrani: Aufsicht, Untersuchung, Methodik, Projektverwaltung, Datenkuration, formale Analyse, Schreiben – Originalentwurf. M. Zabetian: Ressourcen, Konzeptualisierung, Finanzierungseinwerbung, Validierung, Manuskriptbearbeitung. F. Rahbarizadeh: Projektverwaltung, Manuskriptbearbeitung. R. Nosrati: Konzeptualisierung, Validierung, Visualisierung, Bearbeitung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Mohammad Zabetian Targhi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Omrani, V., Targhi, MZ, Rahbarizadeh, F. et al. Hochdurchsatz-Isolierung von Krebszellen in spiralförmigen Mikrokanälen durch Änderung der Richtung, Größe und Position der maximalen Geschwindigkeit. Sci Rep 13, 3213 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30275-x

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Eingegangen: 10. September 2022

Angenommen: 20. Februar 2023

Veröffentlicht: 24. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30275-x

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