Hydrogel

May 01, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 17781 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Mikrofluidische Geräte, die eine extrazelluläre Matrixumgebung, Zellen und physiologisch relevante Perfusion kombinieren, sind als Zellkulturplattformen vorteilhaft. Wir haben eine Hydrogel-basierte, mikrofluidische Zellkulturplattform entwickelt, indem wir mit Polyethylenglykol (PEG)-Hydrogel eingekapselte U87-Glioblastomzellen in membranverschlossene Vertiefungen in Polydimethylsiloxan (PDMS) geladen haben. Das mehrschichtige mikrofluidische Zellkultursystem kombiniert zuvor beschriebene Designmerkmale in einer Konfiguration, die eine 2D-Anordnung von Zellkulturkammern lädt und biomimetisch perfundiert. Eine Dimension des Arrays wird von einem mikrofluidischen Konzentrationsgradientengenerator (MCGG) gespeist, während die orthogonale Dimension Ladekanäle bereitstellt, die Reihen von Zellkulturkammern in einer separaten Schicht füllen. Im Gegensatz zu typischen baumartigen MCGG-Mischern wird eine fraktionierte serielle Verdünnung von 1, ½, ¼ und 0 der anfänglichen Konzentration gelöster Stoffe durch Anpassen der Eingangsmikrokanalbreiten erreicht. Hydrogele werden effizient und reproduzierbar in alle Vertiefungen geladen und die Zellen werden gleichmäßig im gesamten Hydrogel verteilt, wodurch eine Lebensfähigkeit von > 90 % für bis zu 4 Tage aufrechterhalten wird. In einem Arzneimittel-Screening-Assay wird die Diffusion von Temozolomid und Carmustin aus der Perfusionslösung in Hydrogel-verkapselte U87-Zellen gemessen und Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt, was die Nützlichkeit als In-vitro-Nachahmer der Glioblastom-Mikroumgebung zeigt.

Fast 97 % der für onkologische Interventionen entwickelten Medikamente scheitern in klinischen Studien, weil sie sich auf unzureichende Medikamentenmodelle verlassen, insbesondere auf zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle1. Obwohl In-vitro-2D-Zellkulturmodelle bequem zu verwenden sind, stellen sie die komplexe Mikroumgebung des Tumors nicht richtig dar, da das Zellverhalten durch die flache Morphologie des typischerweise verwendeten steifen, planaren Kunststoffs beeinflusst wird2,3. Um die Bedenken hinsichtlich 2D-Zellkulturmodellen auszuräumen, gab es eine Verlagerung hin zu dreidimensionalen (3D) Krebszellkulturmodellen als physiologisch relevanteren Nachahmern der Tumormikroumgebung4. Insgesamt können 3D-Tumormodelle viele Formen annehmen, beispielsweise Sphäroide, Organoide oder Matrix-basierte Kulturen und Co-Kulturen, um nur einige zu nennen5,6. Um die Komplexität zu erhöhen und die physiologische Relevanz zu erhöhen, können 3D-Tumormodelle mit mikrofluidischen Geräten kombiniert werden, um Perfusion zu ermöglichen oder die Vaskularisierung nachzuahmen7. Mikrofluidische Systeme, die Zellen, eine extrazelluläre Matrix und Perfusion kombinieren, ahmen die Tumormikroumgebung in vivo gut nach, sind kostengünstig und reproduzierbar, ermöglichen die Verwendung kleiner Kulturvolumina und verfügen über ein kontrollierbares Design, das für eine gewünschte Anwendung optimiert werden kann8, 9. Perfusionsbasierte Zellkultursysteme versorgen Zellen mit Nährstoffen und entfernen Stoffwechselabfälle auf eine Weise, die den Massentransport in vivo nachahmen und lösliche Faktoren in der Nähe biologischer Konzentrationen halten soll10. Darüber hinaus können innerhalb mikrofluidischer Systeme zeitliche und räumliche Gradienten erzeugt werden, was ihren Wert als Arzneimittel-Screening-Plattformen weiter steigert8. Der Entwurf und Betrieb eines robusten mikrofluidischen Perfusionssystems für die 3D-Kultur adhärenter Säugetierzellen ist jedoch eine Herausforderung3. Herausforderungen könnten mit dem Gerätedesign zusammenhängen, wie z. B. der Wahl der geeigneten Kulturkonfiguration, der Materialien oder der Herstellung eines mikrofluidischen Netzwerks, oder rein technischer Natur sein, wie z. B. Sterilisation, Zellaussaat im Gerät, Optimierung des Massentransports und der Strömungsscherspannungen zur Maximierung der Lebensfähigkeit der Zellen. und Vermeidung von Luftblasen in den Perfusionskanälen.

Für Mikrofluidiksysteme wurden Gradientenmischer entwickelt, die für die On-Chip-Mischung verwendet werden können, um Zellkultursystemen diskrete Konzentrationen löslicher Faktoren zuzuführen, die zur Zellerhaltung, Stammzellendifferenzierung oder Beantwortung verschiedener biologischer Fragen verwendet werden können11. Viele dieser mikrofluidischen Mischer verwenden baumartige Strukturen mit mehreren Stufen, die vor dem Ende jeder Stufe eine vollständige Durchmischung erfordern8,12,13, ähnlich dem hier verwendeten Design. Die On-Chip-Gradientenbildung eliminiert die Möglichkeit von Pipettierfehlern, verringert das Risiko einer Kontamination und ermöglicht weniger mikrofluidische Einlässe, was die Einrichtung im Vergleich zu mikrofluidischen Geräten mit extern erzeugten Gradienten vereinfacht14,15.

Angesichts der erhöhten physiologischen Relevanz von Perfusions-3D-Zellkultursystemen hat sich eine wachsende Zahl von Forschungsarbeiten auf mikrofluidische Zellkulturgeräte für Arzneimittelscreening-Anwendungen konzentriert, wobei der Schwerpunkt auf Leber- und Krebsgewebemodellen liegt16,17. Beispielsweise wurden Tumorsphäroidmodelle in Zellkultur-Mikrovertiefungen gezüchtet, die mit einem Konzentrationsgradientengenerator in Mikrofluidikchips verbunden waren, und in Arzneimittelscreening-Anwendungen verwendet18,19. Diese 3D-Systeme enthielten keine extrazelluläre Matrix-Nachahmung und verließen sich auf die Zelleinfangung, um die Zellkulturkammern zu füllen. Mithilfe eines cleveren Designs wurden in einem 3D-Mikrofluidik-Zellarray sowohl Krebszellen als auch Endothelzellen integriert, um die Tumorumgebung zu emulieren7. Die untere Schicht enthielt Mikrokammern mit in Hydrogel eingebetteten Krebszellen, die durch eine durchlässige Membran mit geclusterten Poren von einer oberen Mikrokanalschicht aus Endothelzellen getrennt waren, und das Gerät enthielt keinen Konzentrationsgradientengenerator. Anschließend verglichen die Autoren die Arzneimittelreaktionen in ihrem System mit den Arzneimittelreaktionen in einer statischen 3D-Kultur und stellten eine verzögerte Reaktion fest, die möglicherweise auf das in den oberen Mikrokanälen gebildete Endothel zurückzuführen ist, das als Barriere für die Arzneimittelpenetration dient. Ein weiteres auf Kapillarkräften basierendes Mikrofluidikgerät für 2D- und 3D-Zellkulturen unter Einbeziehung von Endothel- und Krebszellschichten wurde für Arzneimittelscreening-Anwendungen entwickelt, bei denen ein Gradient erzeugt werden konnte, ohne dass spezielle Geräte erforderlich waren20. Toh et al. entwickelte einen 3D-Mikrofluid-Zell-Array-Chip zum Testen der Hepatotoxizität von Arzneimitteln, bei dem Hepatozyten kultiviert und Gradienten-Arzneimitteldosen ausgesetzt wurden21. Die 3D-Mikroumgebung wurde durch Kollagen- und Terpolymer-Koazervation erzeugt und mit einem Mikropillar-Array aufrechterhalten. Insgesamt können mikrofluidische Zellkulturgeräte mehrere nützliche Funktionen kombinieren, wie z. B. eine extrazelluläre Matrix-Nachahmung, Zellen und Zell-Kokulturen, physiologisch relevante Perfusion, multiplexierte Zellkulturkammern und Konzentrationsgradienten- oder Verdünnungsgeneratoren, was sie für Anwendungen wie Arzneimittel attraktiv macht Vorführung22.

Hier beschreiben wir ein mikrofluidisches Gerät, das für 3D-Zellkulturen auf Hydrogelbasis entwickelt wurde, und demonstrieren seinen Nutzen mit zwei verschiedenen Hydrogelmatrizen und der Erstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven mit zwei Chemotherapeutika. Die 2D-Reihe von Zellkulturkammern wird von einem baumartigen MCGG durchströmt, das eine serielle fraktionierte Verdünnung erzeugt, die Verdünnungsverhältnisse von 1, ½, ¼ und 0 liefert. Die Zellen und die Gelvorläuferlösung lassen sich einfach in das Gerät und die Hydrogele laden bilden sich nach Photoinitiation oder Michael-Typ-Addition ohne Verschluss der Perfusionskanäle oder Druckaufbau, der die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen könnte. Mit diesem mikrofluidischen System kultivierten wir Glioblastomzellen in 3D-Hydrogelen auf Polyethylenglykol (PEG)-Basis und maßen die Arzneimittelabgabe über Perfusion und die Zelllebensfähigkeit nach Behandlung mit Temozolomid (TMZ) und Carmustin (BCNU).

Das Silikonelastomer-Kit Sylgard™ 184 (bezeichnet als Polydimethylsiloxan oder PDMS) wurde von Dow Silicones Corporation (Midland, MI) bezogen. Membranfilter aus Polyester (PETE) (transparent, 0,2 µm Porengröße, 12 µm Dicke, 2e6 Poren/cm2) stammten von Sterlitech Corporation (Kent, WA). Vorgereinigte 75 mm × 50 mm × 1 mm große Objektträger aus Normalglas stammten von Corning Incorporated (Corning, NY). INTRAMEDIC-Schläuche aus Polyethylen (PE) (Innendurchmesser 1,40 mm, Außendurchmesser 1,90 mm und Innendurchmesser 1,14 mm, Außendurchmesser 1,57 mm) stammten von Clay Adams. Siliziumwafer (SI) stammten von University Wafer Inc (Boston, MA). SU-8 2025-Fotolack und SU-8-Entwickler (98–100 % 1-Methoxy-2-propylacetat) stammten von Kayaku Advanced Materials Inc (Westborough, MA). MIL PRF 131k Klasse 1-Folie, 150 µm dick (MarvelSeal® 470) stammte von Berry Global (Evansville, IN). Der A1-Rahmen, ein dünner Polymerfilm (wasserfester A4-Tintenstrahlfilm), stammte von CisInks (South El Monte, CA). Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA; 5 kDa), 4-armiges Poly(ethylenglykol)acrylat (4-armiges PEG-Ac; 10 kDa) und Polyethylenglykoldithiol (PEG-diSH; 3,4 kDa) stammten von Laysan Bio Inc. (Araber, AL). Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 10 X, pH 7,4), Trypanblau (0,4 %), fluoreszierende Polystyrolkügelchen (Fluoro-Max™ Fluorescent Red, 542/612 nm, d = 2 µm) und Temozolomid (TMZ) stammten von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Irgacure 2959 stammte von der BASF Corporation (Florham Park, NJ). Fetales Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin (P/S) stammten von Hyclone (Logan, UT). Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-Medium und 0,05 % Trypsin/0,02 % Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) stammten von Coring (Coring, NY). Acridinorange (AO) und Carmustin (BCNU) stammten von Millipore Sigma (St. Louis, MO). Propidiumiodid (PI) stammte von MP Biomedical LLC (Solon, OH). Der Zellfarbstoff 3,3'-Dioctafecyloxacarbocyaninperchlorat (DiOC) stammte von Life Technologies (Carlsbad, CA). Brilliant Blue FCF (CAS-Nummer: 3844-45-9) wurde als blauer Lebensmittelfarbstoff in einem örtlichen Lebensmittelgeschäft gekauft. Homo sapiens-Hirn-Glioblastom-U87-Zellen stammten von ATCC (Manassas, VA). Glycin-Arginin-Cystein-Asparaginsäure-Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin (GRCD-RGDS), Glycin-Arginin-Cystein-Asparaginsäure-Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin-FITC (GRCD-RGDS-FITC), und Asparaginsäure-Arginin-Cystein-Glycin-Valin-Prolin-Methionin-Serin-Methionin-Arginin-Glycin-Cystein-Arginin-Asparaginsäure-Peptide (DRCG-VPMSMR-GCRD) stammten von Genic Bio (Shanghai, China).

Das mikrofluidische Gerät wurde durch Zusammenbau eines Trägerglas-Objektträgers (75 mm × 50 mm × 1 mm), zwei Schichten aus gemustertem PDMS (obere Perfusionsschicht und eine untere Zellkulturkammerschicht mit Zellladekanälen) und sechzehn PETE-Membranen (Abdeckung) hergestellt die sechzehn Zellkultur-Mikrowells) und drei Röhrchen – zwei Einlassschläuche (PE-Schlauch; ID 1,14 mm, AD 1,57 mm) und ein Auslassschlauch (PE-Schlauch; ID 1,40 mm, AD 1,90 mm) (Abb. 1, ergänzende Abb. S1). Die obere Perfusionsschicht war 3 mm dick und die untere Zellkultur-Mikrowellschicht war 250 µm dick. Die Höhe der Perfusions- und Zellladekanäle betrug 50 µm. Eine Vertiefungstiefe von 250 µm wurde gewählt, um größer als eine einzelne Zelle zu sein und dennoch eine Bildgebung durch die gesamte Probe zu ermöglichen. Die meisten Perfusionskanäle waren 150 µm breit, mit den wichtigsten Ausnahmen von 50 µm und 75 µm, die in das Design integriert wurden, um fraktionierte Verdünnungsreihen zu erreichen. Diese fraktionierten Verdünnungskanäle wurden verwendet, um einen Konzentrationsgradienten von 100 %, 50 %, 25 % und 0 % der anfänglichen Konzentration gelöster Stoffe zu erzeugen. Die Zellladekanäle auf der unteren Schicht waren ebenfalls 150 µm breit.

Mikrofluidisches Gerätedesign. (A) Foto des Mikrofluidikgeräts mit Einlass- (linke Seite des Bildes) und Auslassrohren (rechte Seite des Bildes). Der schwarze Maßstabsbalken stellt 1 cm dar. (B) Kanalbreiten der Mikrokanäle und die mit diesen Kanalbreiten erzeugten Konzentrationsverdünnungen. (C) Seitenansicht der hergestellten mikrofluidischen Geräte mit Einlassrohren (links), Mischkammern (rot), Zellkulturkammern (grün) und Auslassrohr (rechts).

Sowohl die obere als auch die untere PDMS-Schicht wurden durch Aushärten eines PDMS-Vorläufers auf strukturierten Si-Mastern hergestellt (hergestellt durch das Standard-Photolithographieverfahren SU-8 2025: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4-3). .pdf) bei 75 °C über Nacht. Kurz gesagt wurde ein 50 µm dicker SU-8 2025-Fotolack auf einen Si-Wafer bei 1700 U/min schleuderbeschichtet (SP-100-Schleuder, BidTec) und auf einer Heizplatte 3 Minuten lang bei 65 °C und dann 3 Minuten lang bei 95 °C weich gebacken 9 Min. Die Muster auf den vorgedruckten Masken wurden durch UV-Strahlung (160 mJ/cm2 mit Flood Exposure Model 60, ABM-USA, Inc., San Josa, Kalifornien, USA) auf die Fotolackschicht übertragen und nach der Belichtung eingebrannt (auf einem Heizplatte bei 65 ° C für 6 Minuten und dann bei 95 ° C für 7 Minuten) und nach einem Standardprozess entwickelt, der in der ergänzenden Abbildung S2 gezeigt ist. UV-Strahlung vernetzte das belichtete SU-8, und der SU-8-Entwickler löste das unvernetzte SU-8 auf, sodass nur die vernetzten SU-8-Muster zurückblieben.

Die untere PDMS-Schicht der Zellkultur wurde auf ähnliche Weise mit einer Modifikation der Kontrolldicke hergestellt (ergänzende Abbildung S3). Um eine Dicke von 250 µm für die untere PDMS-Schicht zu erreichen, wurde ein 150 µm starker Al-Folienrahmen-Abstandshalter verwendet. Nach dem Aufgießen des PDMS-Vorläufers auf den Si-Master und den Al-Rahmen wurden ein dünner Polymerfilm und ein starrer Glasobjektträger darauf gelegt. Der flexible Polymerfilm wurde hinzugefügt, um den Kontakt von PDMS-Vorläufer und Glasobjektträger zu vermeiden, da der starre Glasobjektträger sonst nach dem Aushärten von PDMS nicht entfernt werden könnte. Auf der Oberseite wurde ein Gewicht von 5 Pfund angebracht, um eine gleichmäßige Dicke der PDMS-Schicht sicherzustellen, und das PDMS wurde über Nacht bei 80 °C ausgehärtet. Die Dicke wurde mit einem Alpha-Step IQ-Profilometer (KLA-TENCOR Alpha D500, KLA Corp., Milpitas, Kalifornien, USA) gemessen. Beachten Sie, dass die PDMS-Schicht dicker war als der Abstandshalter, da aufgrund der hohen Viskosität des PDMS-Vorläufers nicht das gesamte überschüssige PDMS vor der Polymerisation durch die Kanten extrudiert wurde.

Nachdem die PDMS-Schichten ausgehärtet waren, wurden 16 Zellkammern (2 mm ID), 2 Einlässe (1,5 mm ID) und 1 Auslass (2 mm ID) mit Biopsiestanzen geschnitten. Sechzehn kreisförmige PETE-Membranen (Porengröße 0,2 µm), geschnitten mit einer Biopsiestanze mit 3 mm Durchmesser, wurden einzeln über jede der Zellkultur-Mikrovertiefungen mit 2 mm Innendurchmesser gelegt, um die beiden PDMS-Schichten zu trennen und zu verhindern, dass Zellen und Material in den Kulturkammern entweichen die Perfusionskanäle. Um eine bessere Haftung zwischen den beiden PDMS-Schichten (obere und untere Schicht des Geräts) zu ermöglichen, Leckagen zu vermeiden und die Stabilität über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten, wurden einzelne Membranstücke anstelle eines einzelnen Stücks ausgewählt. Einzelne Stücke verhindern auch den Crosstalk zwischen Wells, der bei einer einteiligen Membranschicht auftreten könnte. Die Membranen mit 3 mm Durchmesser sind etwas größer als die Vertiefungen mit 2 mm Innendurchmesser, sodass die Kanten der Membranen die glatten Oberflächen des PDMS berühren, spontan daran haften und während des folgenden Sauerstoffplasmas und der Ausrichtung stabil bleiben. Anschließend wurden die beiden PDMS-Oberflächen mit einem Labor-Corona-Behandlungsgerät (Modell BD-20AC, Electro-Technic Products, Chicago, IL, USA) 1 Minute lang mit Plasma behandelt, um sie zu oxidieren. Die beiden PDMS-Schichten wurden nach Augenmaß mit vier Passmarken an den Ecken ausgerichtet. Nachdem die beiden PDMS-Schichten mit dazwischen liegenden PETE-Membranen zusammengepresst wurden, wurden die Glasobjektträgeroberflächen und die PDMS-Anordnung eine Minute lang weiter mit Plasma oxidiert, um die Befestigung zu verbessern. Einlass- und Auslassschläuche wurden in die Einlass- und Auslassstellen eingeführt und mit ungehärtetem PDMS abgedichtet. Die Geräte wurden mindestens 2 Stunden lang auf 75 °C erhitzt, um die Abdichtung zu verbessern und das PDMS auszuhärten. Ein detailliertes Schema der Gerätemontage ist in der ergänzenden Abbildung S4 dargestellt.

Zur Perfusion wurden Perfusionsflüssigkeiten in 3-ml-Spritzen in einer Doppelspritzenpumpe (New Era Pump Systems Inc, Farmingdale, NY) gegeben, sodass die Eingänge auf beiden Seiten der Mischer die gleiche Durchflussrate hatten. Die Spritzen wurden mit Nadeln (21 G) und Schläuchen (PE-Schlauch ID 1,14 mm, AD 1,57 mm) an die Einlassanschlüsse des Geräts angeschlossen. Die getesteten Volumenströme betrugen 1, 1,5, 2, 5 und 10 µL/min. Um die Mischeffizienz zu untersuchen, wurde eine Lösung von Brilliant Blue FCF (zur Unterstützung der Visualisierung) in PBS auf eine Endkonzentration von 25 μM (gemessen nach dem Lambert-Beer-Gesetz)23 gelöst und in Kombination mit reinem PBS verwendet, um die Leistung des zu bestimmen Mikromischer. Mit einem inversen Mikroskop (Zeiss, Axiovert 200 M, Oberkochen Deutschland) bei 5-facher Vergrößerung wurden Bilder in drei Bereichen – Eingang, Mitte und Ausgang – der Mikromischer während der Perfusion aufgenommen (Abb. 2B). Anschließend wurde die ImageJ-Software24 verwendet, um RGB-Kanäle aufzuteilen und die Intensität des blauen RGB-Kanals innerhalb der Mikromischer (als Funktion der Mikromischerbreite) mithilfe der Funktion „Plot Profile“ zu messen. Die Werte wurden für jeden Bildsatz von 0–1 normalisiert, wobei der blauen Farbe ein Grauwert von 1 und der Hintergrundfarbe des Mikrofluidikchips ein Grauwert von 0 zugewiesen wurde. Der absolute Mischungsindex (AMI) wurde wie folgt berechnet:

Dabei ist Ii die lokale Pixelintensität, < I > die mittlere Pixelintensität im Querschnitt und NI die Gesamtzahl der Pixel25.

Beladungs- und Perfusionsaufbau. (A) Schematische Darstellung des Ladens der Hydrogel-Vorläuferlösung in die membranverschlossenen Mikrowells der unteren Ladeschicht des Geräts über die Ladeanschlüsse mithilfe einer Insulinnadel. (B) Schematische Darstellung des Perfusionsaufbaus, bei dem Schläuche die 3-ml-Spritzen mit den Perfusionsflüssigkeiten mit den Einlassanschlüssen des Mikrofluidikgeräts verbinden. Rote Kreise zeigen an, wo im Mikromischer Bilder zur Mischanalyse aufgenommen wurden (Eingang, Mitte und Ausgang). Blaue Kreise zeigen an, wo Bilder am Ende des Mikromischers für die Konzentrationsgradientenanalyse aufgenommen wurden.

Um außerdem den vom Mikrofluidikgerät bei den eingestellten Volumenströmen erzeugten Konzentrationsgradienten zu bestimmen, wurden auch am Ende jedes Mikromischers Bilder aufgenommen und anschließend mithilfe der ImageJ-Software die durchschnittliche Intensität des von den Mikromischern erzeugten Farbstoffs verglichen.

Wir modellierten Moleküle als harte Kugeln und verwendeten die Stokes-Einstein-Gleichung, um den Diffusionskoeffizienten für Moleküle zu berechnen:

Dabei ist D der Diffusionskoeffizient, \(k\) die Boltzmann-Konstante, \(\mu\) die dynamische Viskosität von Wasser bei 37 °C und \(r\) der hydrodynamische Radius des Partikels. Unter der Annahme, dass das Molekülvolumen des Partikels einer Kugelform entspricht, wurde der hydrodynamische Radius jedes Moleküls wie folgt berechnet:

Dabei ist MW das Molekulargewicht des Partikels (bereitgestellt von der Royal Society of Chemistry), NA die Avogadro-Zahl und \(\rho\) die Dichte des Partikels (bereitgestellt von der Royal Society of Chemistry). Die Zeit, die ein Molekül benötigt, um über die Breite des Kanals zu diffundieren, wurde dann wie folgt berechnet:

Dabei ist \(t\) die Zeit, die für die Diffusion benötigt wird, und \(x\) die Diffusionsstrecke.

Menschliche Glioblastom-U87-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, kultiviert und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang Trypsin/EDTA ausgesetzt, sobald eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht war, und das Medium wurde alle 2 Tage gewechselt. Für Experimente wurden die Zellpassagen 10–20 verwendet. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit DiOC (20 μM) kultiviert, um alle Zellen vor allen weiteren Experimenten anzufärben.

Nicht abbaubare, nicht klebende PEGDA-Hydrogele wurden durch UV-Photopolymerisation hergestellt. Kurz gesagt, um eine Stammlösung des Photoinitiators herzustellen, wurde 1 % w/v Irgacure 2959 in entionisiertem Wasser (DI-Wasser) gelöst, 90 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (Branson, Modell Nr. 2800, 40 kHz) und bei Raumtemperatur gelagert. Bis zu 2 Wochen vor Licht geschützt aufbewahren. PEGDA-Hydrogel-Vorläuferlösungen (250 µL) mit 20 % w/v und 0,1 % w/v in Irgacure wurden in PBS hergestellt und 30 s lang gevortext, um eine vollständige Durchmischung sicherzustellen. Die Hydrogel-Vorläuferlösung wurde mithilfe einer Insulinnadel über die Ladeöffnungen in die Zellkultur-Mikrowells des Mikrofluidikgeräts geladen (Abb. 2A). Jede Mikrovertiefung enthielt etwa 0,2 µL der Hydrogel-Vorläuferlösung; Daher wurden 3,14 µL Lösung benötigt, um alle 16 Mikrovertiefungen zu füllen. Die überschüssige Menge an Vorläuferlösung war notwendig, um sicherzustellen, dass die Lösung die Mikrovertiefungen erreichte und nicht in den Ladekanälen verblieb. In das Design der Ladeschicht des Geräts wurden Entlastungskanäle integriert, damit die überschüssige Vorläuferlösung aus dem Gerät austreten kann, anstatt gegen die Membran zu drücken, die die Mikrowells bedeckt. Die Hydrogele wurden dann unter einer UV-Lampe (4,81 mW cm2, 1 W, 365 nm; Blak-Ray® XX-15L UV-Tischlampe, UVP, Upland, CA) 10 Minuten lang polymerisiert26. Diese Gele werden durchgehend als PEGDA bezeichnet.

Abbaubare, klebende 4-armige PEG-Ac-Hydrogele wurden durch Michael-Addition hergestellt. Zunächst wurde 4-armiges PEG-RGDS nach einem zuvor entwickelten Protokoll27 hergestellt. Wir modifizierten durchschnittlich eine der Acrylatgruppen jedes 4-armigen PEG-Ac mit RGDS (80 % Modifikationseffizienz) und lagerten das lyophilisierte Produkt bis zu 6 Monate lang unter Argon in einem Trockenbehälter bei –20 °C. Anschließend wurden Hydrogele unter Verwendung einer Mischung aus 4-armigem PEG-Ac und 4-armigem PEG-RGDS (0,8 mM in RGDS) und einer 50:50-Vernetzermischung aus PEG-diSH und einem enzymatisch abbaubaren Peptid-Vernetzer DRCG-VPMS ↑ MR- gebildet. GCRD. Für alle Gele wurden unmittelbar vor der Verwendung 20 % w/v Stammlösungen von 4-armigem PEG-Ac, PEG-diSH und 4-armigem PEG-RGDS in TEA-Puffer pH 8 hergestellt. Stammlösungen wurden gemischt und der Peptidvernetzer wurde als Pulver zugegeben, um eine Hydrogelvorläuferlösung mit einem Acrylat-zu-Thiol-Molverhältnis von 1:1 und einer Endkonzentration des Polymers von 10 % w/v und einer Endkonzentration des Peptidvernetzers von 7,8 mM zu ergeben. Die Hydrogel-Vorläuferlösung wurde 30 Sekunden lang durch Pipettieren gemischt, wie oben beschrieben in das Mikrofluidikgerät injiziert und 20 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gelieren gelassen. Diese Gele werden durchgehend als 4-armiges PEG-Ac bezeichnet.

Um die Reproduzierbarkeit der Hydrogel- und Zellbeladung in den Zellkultur-Mikrowells des Mikrofluidikgeräts zu beurteilen, wurden DiOC-gefärbte U87-Zellen mit 106 Zellen/ml zur PEGDA-Hydrogel-Vorläuferlösung gegeben. Die Vorläuferlösung wurde dann mit einer Insulinnadel in die Mikrovertiefungen geladen und wie oben beschrieben unter UV geliert. Bilder jeder Vertiefung wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und ImageJ wurde verwendet, um die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung zu zählen. Die Verteilung der fluoreszierend markierten Zellen innerhalb des Hydrogels wurde mit einem konfokalen Mikroskop (Leica Confocal SP8, Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove, IL) bei 10-facher Vergrößerung abgebildet und mit Fidschi-Software (kostenloser Download http://fiji.sc) verarbeitet. . Für die konfokale Bildgebung wurde das Hydrogel auch durch kovalenten Einbau eines fluoreszierenden GRCD-RGDS-FITC-Peptids fluoreszierend gemacht, wie von uns zuvor beschrieben27.

Eine Hydrogel-Vorläuferlösung mit 20 % w/v PEGDA, 0,1 % v/v Irgacure und 106 Zellen/ml (DiOC-gefärbte U87-Zellen) wurde wie oben beschrieben in die Zellkultur-Mikrovertiefungen des Mikrofluidikgeräts injiziert und polymerisiert, um die nicht- abbaubare, nicht klebende PEGDA-Hydrogele. Unmittelbar nach der Gelierung wurde RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S, 48 Stunden lang durch das Gerät perfundiert. Nach 48 Stunden wurde das Perfusionsmedium durch ergänztes Medium ersetzt, das 0,2 μg/ml PI (färbende Kerne abgestorbener Zellen) in beiden Einlässen und 2 mM TMZ oder 10 μM BCNU in einem Einlass enthielt, und 48 Stunden lang durch das Gerät perfundiert. In ähnlicher Weise wurden abbaubare, klebende 4-armige PEG-Ac-Hydrogele, die 106 Zellen/ml DiOC-gefärbte U87-Zellen enthielten, wie oben beschrieben hergestellt, 48 Stunden lang kultiviert und 48 Stunden lang TMZ ausgesetzt. Eingekapselte Zellen wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200 M bei 10-facher Vergrößerung abgebildet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde wie folgt berechnet:

Dabei steht NL für die Anzahl lebender Zellen und ND für die Anzahl toter Zellen.

Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS; Zeiss LSM 510 Fluoreszenzmikroskop, Zeiss, Deutschland) wurde verwendet, um die In-situ-Diffusionsfähigkeit eines Modellfluorophors (Atto 655) in einer 20 % w/v PEGDA-Hydrogelplatte zu messen. Hydrogele wurden wie oben beschrieben gebildet, mit der Modifikation, dass Atto 655 (0,5 nM) zu den Hydrogel-Vorläuferlösungen hinzugefügt wurde. Für FCS-Messungen wurden Hydrogele (150 µL) in einem 8-Kammer-Deckglas mit deutschem Borosilikatboden Nr. 1 hergestellt. Anschließend wurden die Hydrogele über Nacht in DMEM-Medium ohne Phenolrot und mit 0,5 nM Atto 655 eingeweicht, um eine konzentrationsbedingte Diffusion von Atto 655 aus dem Hydrogel in das umgebende Medium zu verhindern. Atto 655 (0,5 nM) in entionisiertem Wasser wurde auch zur Kalibrierung des konfokalen Volumens des FCS-Instruments verwendet. Ein gepulster Laser mit 633 nm ps wurde für sechs Messungen von 300 s für jeden Probenort verwendet. Für jede Messung wurde eine Autokorrelationsfunktion G(τ) erhalten:

Dabei ist N die Anzahl der fluoreszierenden Partikel, p = ro/zo eine Instrumentenkonstante, ro der Radius und zo die axiale Länge des fokussierten Laserstrahlflecks, τd die Diffusionszeit des gelösten Stoffs, T die Triplettzustandsamplitude und τT ist die Triplett-Lebensdauer. Die Autokorrelationsfunktion wurde mithilfe eines Triplettmodells angepasst, um die mögliche Anregung molekularer Triplettzustände bei höheren Laserintensitäten zu berücksichtigen. Abschließend wurde die Autokorrelationsfunktion wie folgt normalisiert:

wobei G(τD) der Wert von Gl. ist. (6) zu jedem Zeitpunkt und G(τ0) ist der Wert von Gl. (6) zum Anfangszeitpunkt. Der effektive Tracerdiffusionskoeffizient für jedes Protein in Lösung wurde aus τD wie folgt berechnet:

Unter der Annahme, dass die Diffusionsfähigkeiten von TMZ und Atto 655 aufgrund ihrer relativ ähnlichen Molekulargewichte (194 g/mol bzw. 887 g/mol) ähnlich waren, haben wir dann die erwartete TMZ-Konzentration in den Gelen als Funktion der Geltiefe und -zeit modelliert. Die TMZ-Konzentration wurde über Ficks zweites Diffusionsgesetz für 1-D-Geometrie (eine dünne Platte) mit den folgenden Randbedingungen berechnet: c(x = 0) = 2 mM TMZ und c(x = ∞) = 0 mM TMZ bei t = 0 h, wobei c die TMZ-Konzentration, x der Gelort und t die Zeit ist:

Alle Daten werden als Mittelwerte (± SD) dargestellt, die aus 3 bis 4 unabhängigen Experimenten ermittelt wurden. Die statistische Analyse zur Analyse des Konzentrationsgradienten und zur Reproduzierbarkeit der Beladung wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit Holm-Sidak oder Dunns Mehrfachvergleichstests mit GraphPad Prism 6® durchgeführt. Die statistische Analyse der Steigung des Intensitätsprofils gegenüber der Volumenflussrate wurde mithilfe einer linearen Regressionsanalyse mit GraphPad Prism 6® durchgeführt. Ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Hier haben wir ein mikrofluidisches Gerät entworfen, das es uns ermöglichte, in Hydrogel eingekapselte Zellen in membranverschlossene Zellkultur-Mikrowells zu laden, um sie mit Flüssigkeiten zu durchströmen, die gewünschte Biomoleküle oder Medikamente unterschiedlicher Konzentration enthielten (Abb. 1, ergänzende Abb. S1). Das Gerät verfügt über eine Kombination mehrerer Merkmale, die es zu einer guten Wahl für 3D-Hydrogel-basierte Perfusionszellkulturen machen: (i) es handelt sich um eine geschlossene Struktur mit Zellladekanälen; (ii) es gibt eine 2D-Anordnung von Zellkulturkammern, die mit einer Membran abgedeckt sind, um eine Kontamination oder ein Entweichen von Zellen in die Perfusionsschichten zu verhindern; (iii) Zellen werden in ein Hydrogel für eine biomimetische 3D-Zellkultur geladen; (iv) das umgekehrte Design ermöglicht die Abbildung von unten; und (v) der MCGG nutzt die Kanalbreite statt der Länge, um die Mischungsverhältnisse zu variieren.

Das mikrofluidische Gerät wurde mit PDMS konstruiert, das häufig in mikrofluidischen Anwendungen verwendet wird, da es einfach herzustellen, inert, nicht zytotoxisch, gasdurchlässig und für die Fluoreszenzbildgebung geeignet ist3,28,29. PDMS ist wichtig für unser Design und ermöglicht die Verwendung einer Insulinnadel zum Laden von Zellen und Gelen in die Mikrovertiefungen. Das mikrofluidische System bestand aus zwei mikrofluidischen Kanalschichten, die durch Membranen getrennt waren, um die unteren Zellladekanäle abzudichten. Die obere Perfusionsschicht (Abb. 1, 2B) enthält die schlangenförmigen Mikromischer, die zu den Perfusionskanälen führen, die für einen Fluss über die Membran sorgen, um die Zellen in den Kulturkammern darunter zu versorgen. Die zweistufigen Mikromischer haben Zufuhrkanalbreiten von 150/75/150/150 μm vor der ersten Stufe und 150/50/150/50/150 μm vor der zweiten Stufe, um die fraktionierte Konzentrationsverdünnungsreihe von 1:½ zu erzeugen :¼:0 (Abb. 1B). Die Perfusionskanäle sprechen die Zellkulturkammern parallel fließend an, um Übersprechen zu vermeiden. Das Gerät bietet einen stabilen Betrieb über mehrere Tage hinweg, verbraucht < 1,5 ml/Tag und perfundiert die Zellen mit frischem Medium, um Zytotoxizität zu vermeiden. Bei einer volumetrischen Flussrate von 1 μL/min beträgt die lineare Geschwindigkeit innerhalb des Zufuhrkanals zur Perfusionsschicht über der Zellkulturkammer ~ 1,1 mm/s, was der In-vivo-Flussrate durch Kapillaren ähnelt30. Giulitti et al. haben gezeigt, dass bei zu langsamer Perfusion (z. B. 0,6 µL/h) stromabwärts gelegene Zellen aufgrund der heterogenen Verteilung von Nährstoffen (höhere Konzentration stromaufwärts) und Abfall (höhere Konzentration stromabwärts) Zytotoxizität erfahren können31. Höhere Flussraten (z. B. 30–60 μL/h, ähnlich den in dieser Studie verwendeten 1 μL/min) führen zu einer homogeneren Zellkultur innerhalb des gesamten Mikrofluidikgeräts. Abhängig vom Gerätedesign können zu hohe Flussraten (z. B. 40 μl/min) auch zu einer unvollständigen Durchmischung oder einer durch Scherbeanspruchung verursachten Zytotoxizität führen32.

In die untere Schicht wurden Mikrokanäle zum Laden von Zellen in Kulturkammern eingearbeitet. Jede Reihe von Zellkulturkammern wird über einen einzigen Einlass beschickt. Wenn die gleiche zellhaltige Lösung in jeden Einlass geladen wird, werden vier biologische Replikate erstellt, wie in dieser Studie durchgeführt. Die Beladung ist am gleichmäßigsten, wenn durch jede Zellkulturkammer die gleiche Länge des Mikrokanals verläuft (die Summe der Kanallänge vom Einlass zum Mikrowell und vom Mikrowell zum Ausgang), damit die Mikrowells gleichzeitig parallel gefüllt werden können ( Abb. 2A). Die Kanäle von jeder Zellkultur-Mikrovertiefung bis zum Ausgang fungierten als Probenentlastungskanal, um den Ladevorgang zu erleichtern und den Druck zu reduzieren, der beim Laden der Hydrogel-Vorläuferlösung in die Mikrovertiefungen erforderlich war. Die Entlastungskanäle verhindern, dass die in Hydrogel eingekapselten Zellen in die Perfusionsschicht entweichen und die Perfusion bei der Gelierung unter übermäßigem Belastungsdruck blockieren. Jede Zellkulturvertiefung war mit einer PETE-Membran (Porengröße 0,2 µm) abgedeckt, die den Austausch von Nährstoffen und Abfallstoffen zwischen den Zellen und den durchströmenden Flüssigkeiten ermöglichte, jedoch große Partikel, Bakterien und Zellen einschränkte und so eine Kontamination verhinderte entstehen durch Perfusion. Schließlich wurden die in der Gelmatrix enthaltenen Zellen vor der hydrodynamischen Scherbeanspruchung der zirkulierenden Perfusionsflüssigkeiten geschützt, um die Rekapitulation des In-vivo-Systems zu verbessern. Die Lage der Kulturkammern im Verhältnis zum Perfusionsstrom ist wichtig, da Zellen, die sich direkt im Strömungsweg befinden, einer hydrodynamischen Scherbeanspruchung ausgesetzt sind, die sich auf die Zellmorphologie, die Organisation des Zytoskeletts, die Proliferation, die zellulären Signalwege sowie Gene und Proteine ​​auswirken kann Ausdruck3.

Im Gegensatz zu einem typischen MCGG wird hier eine fraktionierte serielle Verdünnung durch Variation der Breite der Zufuhrkanäle erreicht. Mischer auf Diffusionsbasis haben eine maximale Geschwindigkeit, bei der eine vollständige Vermischung erreicht wird. Daher ermöglicht die Variation der Breite der Zufuhrkanäle im Gegensatz zur Länge eine kompaktere Mischstruktur. Zuvor wurde ein dimensionsloser Parameter erstellt, um die erforderliche Mischerlänge für verschiedene Geometrien zu bestimmen33. Die maximale Geschwindigkeit für die Gradientenmischung wird experimentell mit einem Mikroskop in unseren 18,5 mm langen Serpentinenkanälen mit quadratischen Ecken gemessen, wie in Abb. 2B dargestellt. Es werden Bilder gezeigt, die das Mischen am Eingang, in der Mitte und am Ende des Kanals bei Flussraten von 1, 5 und 10 μL/min messen (Abb. 3A). Insgesamt wurden fünf Volumenströme (1, 1,5, 2, 5 und 10 µL/min) verwendet, um das Ausmaß der Vermischung am Ausgang des Mischkanals zu bestimmen. Eine vollständige Vermischung wird durch eine homogene Lösungskonzentration über die Breite des Mikrokanals angezeigt, was eine Steigung von Null für ein Intensitäts-Distanz-Diagramm ergibt. In Abb. 3B zeigt ein AMI von 0 eine vollständige Durchmischung an. Bei einer Flussrate von 1 μL/min wurde der AMI-Wert mit 0,012 bei einer Flussrate von 1 μL/min berechnet. Bei größeren Durchflussraten nahm der AMI zu, was auf eine unvollständige Durchmischung hindeutet, wobei das Ausmaß der Durchmischung mit steigender Durchflussrate abnimmt. Insgesamt ist die Durchmischung linear vom Volumenstrom abhängig (R2 = 0,93). Angesichts dieser festen Mischlänge am Gerät wurde die Abhängigkeit der Mischung von der Durchflussrate gemessen, um eine ausreichende Mischung bei 1 μl/min sicherzustellen, wie in Abb. 3B dargestellt.

Mischeffizienz. (A) Repräsentative Mikroskopbilder, die den Fortschritt der Mischung von PBS und Brilliant Blue FCF in PBS in den interessierenden Eingangs-, Mittel- und Ausgangsbereichen innerhalb der Mischkanäle bei 10, 5, 2, 1,5 und 1 µL/min zeigen. (B) Die Steigung des Intensitätsprofils, um die Mischeffizienz am Austrittsbereich des Mischkanals als Funktion der Perfusionsvolumenstromrate anzuzeigen. Berechneter absoluter Mischindex (AMI) am Austrittsbereich des Mischkanals als Funktion der Perfusionsvolumenströmungsrate. Ein AMI-Wert von Null zeigt eine vollständige Durchmischung an.

Da das Mischen von der Diffusion abhängt, wird erwartet, dass die Mischeffizienz als Funktion der Durchflussrate von der Molekülgröße abhängt, wobei MW und Größe die molekulare Diffusionsfähigkeit bestimmen34. Wir verwendeten Brilliant Blue FCF mit einem Molekulargewicht (MW) von 792,9 g/mol, um die Mischung zu charakterisieren, was größer ist als bei den meisten Chemotherapeutika, wie in Tabelle 1 gezeigt. Eine vollständige Durchmischung von Brilliant Blue FCF gelöst in PBS wurde bei 1 erreicht µL/min und die für die Diffusion erforderliche Zeit betrug 34,0 s. Der Diffusionskoeffizient und die für die Diffusion über die Breite des Kanals erforderliche Zeit wurden auch für mehrere von der FDA zugelassene Chemotherapeutika berechnet: Temozolomid, Paclitaxel, Doxorubicin, Carmustin und Lomustin. Nach unseren Berechnungen würde beispielsweise Temozolomid, das einen kleineren Durchmesser und eine höhere Diffusionsfähigkeit als Brilliant Blue FCF hat, fast doppelt so schnell über die Kanalbreite diffundieren. Dieses Ergebnis impliziert, dass eine Volumenflussrate von mehr als 1 µL/min immer noch zu einer vollständigen Durchmischung führen könnte. Andererseits sollte Paclitaxel, das in Größe und Diffusionsfähigkeit dem Brilliant Blue FCF ähnelt, eine ähnliche Zeit benötigen, um über die Kanalbreite zu diffundieren (31,2 s). Daher sollte eine Volumenflussrate von 1 µL/min verwendet werden, um eine vollständige Durchmischung zu erreichen. Da alle berücksichtigten Moleküle kleiner als der verwendete Brillantblau-FCF waren, gehen wir insgesamt davon aus, dass die physiologische Volumenflussrate von 1 µL/min ausreichen würde, um eine vollständige Durchmischung für die meisten Experimente zu erreichen, die darauf abzielen, eine Konzentrationsverdünnung kleiner Moleküle wie Chemotherapeutika zu erzeugen .

Die vom MCGG erzeugten Konzentrationen wurden durch Perfusion von 25 μM Brilliant Blue FCF in PBS im „100 %-Einlass“ und PBS im „0 %-Einlass“ mit 1 µL/min gemessen (Abb. 4A), was Konzentrationen von 100 ergab %:51%:26%:0% (Abb. 4B), ähnlich der erwarteten Verdünnung von 100 %, 50 %, 25 % und 0 %. Die Verdünnungsfraktionen wurden unter Verwendung der Intensitäten der 100 %- und 0 %-Mikrokanäle vor der Aufteilung interpoliert (Abb. 4C). Die Intensität in Kanal A (am nächsten zum Einlass mit Brilliant Blue FCF in PBS) wurde auf 100 % eingestellt, während der Einlass mit PBS (Kanal D) auf 0 % eingestellt wurde. Die experimentell erzeugte Konzentrationsverdünnung entsprach der vorhergesagten theoretischen Konzentrationsverdünnung (Abb. 1B) mit einem R2-Wert von 0,99, was weiter zeigt, dass eine vollständige Vermischung der beiden Perfusionsflüssigkeiten bei 1 µL/min erreicht wurde.

Gradientenerzeugung. (A) Schematische Darstellung der Kanäle A–D, in denen der erzeugte Konzentrationsgradient gemessen wurde. (B) Gemessene Konzentrationen bei einer Durchflussrate von 1 µL/min, wobei Kanal A 100 % der Anfangskonzentration an Brilliant Blue FCF und Kanal D 0 % Brilliant Blue FCF enthält. (C) Repräsentative Bilder des Konzentrationsgradienten in jedem Kanal bei einer Durchflussrate von 1 µL/min.

Die Reproduzierbarkeit der Ladung von Hydrogelen in die Mikrovertiefungen sowie die Ähnlichkeit der Beladung in allen Vertiefungen innerhalb des Geräts wurden charakterisiert. Eine gleichmäßige Beladung der Zellen wird durch das Durchflussdesign der Ladekanäle erleichtert. Die Anzahldichte der Zellen und ihre Lage sollten stochastisch sein, wobei Schrotrauschen die Hauptquelle der Belastungsvariabilität sein sollte, ohne dass es zu einer systematischen Verzerrung kommt. Bei der Durchflusskonstruktion der Ladekanäle sollte die Konzentration der Zellen dieselbe sein wie in der ursprünglichen homogen gemischten Lösung, ohne dass es zu einer Zellansammlung oder -verarmung kommt. Um die Reproduzierbarkeit der Beladung zu messen, wurden PEGDA-Hydrogele mit eingekapselten DiOC-gefärbten Zellen mithilfe einer Insulinnadel in die Mikrovertiefungen geladen und dann zur Gelierung UV-Licht ausgesetzt. Da alle vier Mikrovertiefungen einer Säule gleichzeitig beladen wurden (Abb. 5A), wurde die durchschnittliche Dichte der Zellen in den Vertiefungen einer Säule verglichen (Abb. 5B). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Reproduzierbarkeit der Beladung zwischen den vier Säulen ähnlich war, da es keinen signifikanten Unterschied in der mittleren Zelldichte für jede Spalte gab (Abb. 5C).

Reproduzierbarkeit der Zellbeladung. (A) Geräteschema der Ladeöffnungen und -kanäle sowie der Zellkultur-Mikrowells, wobei jede Spalte der Zellkulturkammern farblich gekennzeichnet ist, beginnend mit Spalte 1 in Blau. (B) Fluoreszenzbilder der Zellkulturkammern, die mit Hydrogelen mit eingeschlossenen, mit DiOC gefärbten U87-Zellen beladen sind. Maßstabsbalken = 200 µm. (C) Dichte der Zellen innerhalb der Zellkultur-Mikrowells jeder Spalte. (D) Bilder von der Unterseite, einem Drittel, zwei Dritteln und der Oberseite eines Hydrogels, wenn es in eine Zellkultur-Mikrovertiefung geladen wird. Die Hydrogele werden durch Anbindung von FITC-modifizierten Liganden an das 4-armige PEG-Ac mit grüner Fluoreszenz markiert. Maßstabsbalken = 500 µm.

In einem separaten Experiment verwendeten wir fluoreszierendes PEG (grün), beladen mit rot fluoreszierenden Kügelchen, um zu bestimmen, ob das Hydrogel die gesamte Vertiefung gleichmäßig einnahm und ob die Kügelchen gleichmäßig über die Tiefe des Hydrogels verteilt waren. Bilder, die in der gesamten Tiefe der Vertiefung aufgenommen wurden, zeigten, dass das Hydrogel die Mikrovertiefungen füllte und die fluoreszierenden Perlen im gesamten Hydrogel gut verteilt blieben (Abb. 5D). Allerdings scheint das grüne Gel in der Nähe der PDMS-Wand und der Membran, bei denen es sich um Bereiche mit hoher Sauerstoffexposition während der Polymerisation handelt, nicht polymerisiert zu sein. Es ist bekannt, dass Sauerstoff die UV-Polymerisation hemmt35 und dass er in PDMS in erhöhter Konzentration vorliegt36. Außerdem diffundieren kleine hydrophobe Moleküle wie der hier verwendete Photoinitiator leicht in PDMS und verringern möglicherweise ihre Konzentration in der Gelvorläuferlösung, was auch den „Lichthof“ erklären könnte, der in der Nähe der PDMS-Wände zu sehen ist. Diese Form der Hydrogelstruktur vergrößert die Oberfläche, über die der Austausch gelöster Stoffe stattfinden kann, verändert jedoch nicht die Gesamtmenge an gelösten Stoffen, die ausgetauscht werden kann, die durch den Volumenstrom durch die Perfusionsschicht bestimmt wird. Abhängig von der genauen Anwendung kann diese Hydrogelform entweder vorteilhaft oder schädlich sein. Zukünftige Arbeiten werden Methoden zur Senkung der Sauerstoffkonzentration im PDMS vor der Polymerisation mithilfe nicht-zytotoxischer Methoden untersuchen. Wir haben Methoden entwickelt, um Hydrogel-Plugs in PDMS-Mikrokanälen vollständig zu polymerisieren37, haben jedoch die Zytotoxizität dieses Protokolls nicht getestet. Beachten Sie, dass, wenn ein 4-armiges PEG-Ac-Gel, das durch Michael-Addition polymerisiert, in die Zellkulturvertiefungen geladen wurde, dieses aufgrund der Polymerisation vollständig polymerisierte, auch in unmittelbarer Nähe der PDMS-Wände (ergänzende Abbildung S5). Die Michael-Addition wird nicht durch Sauerstoff beeinflusst und ist nicht von einem kleinen Initiatormolekül abhängig. Diese Daten zeigten auch, dass mit dem aktuellen Gerät eine Vielzahl von Hydrogel-Matrizen verarbeitet werden können.

Eine Herausforderung beim Laden von Zellen in mikrofluidischen Geräten im Allgemeinen besteht darin, Luftblasen zu eliminieren, die während des Ladens in den Mikrovertiefungen eingeschlossen werden können. Um Luftblasen zu vermeiden, haben andere das System zunächst mit Wasser beladen und anschließend entgast38. Wir haben uns dafür entschieden, das Gerät trocken zu laden (nicht mit Wasser vorgefüllt), um eine Verdünnung der Gelvorläuferlösung mit Wasser zu vermeiden. Luftblasen kommen in mikrofluidischen Geräten routinemäßig vor39,40. Während wir zeigen, dass Blasen in unserem System die Lebensfähigkeit der Zellen nicht negativ beeinflussten (siehe ergänzende Abbildung S7), könnten sie zu Unterschieden zwischen replizierten Zellkulturkammern führen. Eine Verbesserung, die in Zukunft in Betracht gezogen werden könnte, wäre die Änderung der Geometrie der Mikrokanäle innerhalb des Geräts39, um die scharfe Ecke zwischen den Ladekanälen und den Reservoirs zu beseitigen. Die derzeitigen scharfen Ecken, die sowohl in der Beladungs- als auch in der Perfusionsschicht vorhanden sind, könnten Luft einschließen, da der Winkel der Ecke kleiner ist als der Kontaktwinkel der Füllflüssigkeit, was zu einer geringeren Benetzbarkeit führt.

Zuerst haben wir die Zeit bestimmt, die ein kleines Molekül (z. B. ein Chemotherapeutikum), das perfundiert wird, benötigen würde, um in das Hydrogel zu diffundieren und die gleiche Konzentration wie der Perfusionskanal zu erreichen. Um diese Diffusion zu messen, verwendeten wir einen Fluorophor Atto 655 (887 g/mol), um die Diffusionsfähigkeit eines niedermolekularen Arzneimittels wie TMZ (194 g/mol) oder BCNU (214 g/mol) zu modellieren, was uns die Messung der Diffusion ermöglichte Koeffizient vor Ort und in Echtzeit unter Verwendung von FCS (ergänzende Abbildung S6). Die Diffusionskoeffizienten für den Fluorophor Atto 655 in Medien sowie in PEGDA-Hydrogelen wurden mit 4,25 × 10–6 bzw. 2,55 × 10–6 cm2/s gemessen. Wie erwartet war der Diffusionskoeffizient in Medien deutlich höher als der im Hydrogel, was durch physikalische Hindernisse erklärt werden könnte, wie wir zuvor gezeigt haben41. Mit den gemessenen Diffusionskoeffizienten haben wir dann das Ficksche Diffusionsgesetz verwendet, um zu bestimmen, ob TMZ oder BCNU das Hydrogel durchdringen konnten und wie lange es dauern würde, bis die Medikamente die gewünschte Konzentration im Gel erreichen. Wir haben die TMZ-Konzentration (bei 2 mM Anfangskonzentration) und die BCNU-Konzentration (bei 10 µM Anfangskonzentration) als Funktion der Zeit (bis zu 48 Stunden) bei einer Hydrogeltiefe von 250 μm (der Dicke des Gels innerhalb der Mikrovertiefung) modelliert. Es wurde festgestellt, dass die Arzneimittelkonzentration innerhalb von 1 Stunde > 1,9 mM und innerhalb von 4 Stunden nach Zugabe von TMZ > 1,95 mM und nach Zugabe von BCNU innerhalb von 1 Stunde > 9,5 µM betrug, was darauf hindeutet, dass für eine 48-stündige Exposition alle Zellen gleichermaßen beiden Arzneimitteln ausgesetzt sein sollten .

Als nächstes testeten wir die Anfälligkeit von U87-Zellen gegenüber zwei verschiedenen Medikamenten, nämlich TMZ und BCNU, in zwei verschiedenen PEG-Hydrogelen. TMZ ist der aktuelle Behandlungsstandard und BCNU wird als Adjuvans oder in Kombination mit TMZ eingesetzt. Beide Medikamente sind für die Behandlung von Glioblastomen zugelassen und beide sind Alkylierungsmittel, von denen bekannt ist, dass sie einen Zellzyklusstopp und Apoptose induzieren42. Bei den beiden Gelen handelte es sich um PEGDA und das enzymatisch abbaubare, RGD-modifizierte 4-Arm-PEG-Ac-Gel. Das durch UV-Photopolymerisation gebildete PEGDA-Gel ist nicht abbaubar und inert, daher war nicht zu erwarten, dass Zellen damit interagieren. Es diente nur als Gerüst und darin eingekapselte Zellen behielten bis zu 4 Tage lang eine hohe Lebensfähigkeit (> 90 %) (ergänzende Abbildung S7A), blieben jedoch rund (ergänzende Abbildung S7B). Das 4-armige PEG-Ac-Gel ist abbaubar und zelladhäsiv, und Zellen konnten mit dem Hydrogel interagieren und es im Laufe der Zeit umgestalten, was durch Zellausbreitung am Tag 4 und eine Zelllebensfähigkeit von > 95 % belegt wurde (ergänzende Abbildung S7).

Bei der Behandlung mit 0, 0,5, 1 und 2 mM TMZ wurde festgestellt, dass PEGDA-verkapselte U87-Zellen eine Lebensfähigkeit von 86,4 ± 1,9 %, 75,0 ± 1,2 %, 34,0 ± 7,7 % bzw. 15,8 ± 5,7 % aufwiesen (Abb. 6A,B). Die EC50 (wirksame Konzentration, die erforderlich ist, um 50 % der Zellen abzutöten) wurde auf ~ 0,61 mM TMZ geschätzt, berechnet durch eine sigmoidale Kurvenanpassung (R2 = 0,983). Zellen waren weniger anfällig für TMZ, wenn sie in das abbaubare, klebende 4-armige PEG-Ac-Hydrogel eingekapselt waren (Abb. 6C, D). Die Lebensfähigkeit der Zellen betrug 95,6 ± 1,2 %, 83,9 ± 12,9 %, 59,1 ± 6,1 % und 44,0 ± 8,2 % für 0, 0,5, 1 bzw. 2 mM TMZ und der EC50-Wert betrug ~ 1,8 mM (R2 = 0,901). Dieses Ergebnis war nicht überraschend, da die Integrinbindung bereits zuvor mit der Arzneimittelresistenz von Glioblastomzellen in Zusammenhang gebracht wurde43,44,45 und wir haben zuvor ähnliche Ergebnisse für Glioblastom-Sphäroide gezeigt46. Der EC50-Wert für U87-Zellen, die in einem PEGDA-Hydrogel eingekapselt und mit BCNU behandelt waren, betrug ~ 8,2 µM (R2 = 0,952) (Abb. 6E,F). Wie für alle Bedingungen zu erwarten war, war der geschätzte EC50-Wert höher im Vergleich zur 2D-Monoschichtkultur, ähnelte jedoch dem, was andere für in Hydrogel eingekapselte GBM-Zellen berichteten2. Abgestorbene Zellen waren im gesamten Gel nach 48-stündiger Exposition unter allen Bedingungen sichtbar, was darauf hindeutet, dass die Mikroumgebung innerhalb der Gele homogen war (Abb. 6A, C, E).

Reaktionsfähigkeit auf Medikamente. (A) Repräsentative Bilder lebender/toter U87-Zellen nach TMZ-Behandlung und (B) Lebensfähigkeit der Zellen als Funktion der TMZ-Konzentration (n = 3) für Zellen, die in einem nicht abbaubaren, nicht klebenden PEGDA-Gel ausgesät sind. (C) Repräsentative Bilder lebender/toter U87-Zellen nach TMZ-Behandlung und (D) Lebensfähigkeit der Zellen als Funktion der TMZ-Konzentration (n = 3) für Zellen, die in einem abbaubaren, klebenden 4-Arm-PEG-Ac-Gel ausgesät sind. (E) Repräsentative Bilder lebender/toter U87-Zellen nach BCNU-Behandlung und (F) Zelllebensfähigkeit als Funktion der BCNU-Konzentration (n = 3) für Zellen, die in einem nicht abbaubaren, nicht klebenden PEGDA-Gel ausgesät sind. Alle Zellen wurden mit DiOC (grün) gefärbt und tote Zellen wurden mit PI (rot) gefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 200 µm.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass das Gerät zum Testen der Auswirkung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen auf die Zellreaktivität auf lösliche Faktoren wie Chemotherapeutika verwendet werden könnte, wobei das Therapeutikum leicht und homogen in die zellbesiedelten Hydrogele eindringen könnte. Obwohl dies hier nicht untersucht wird, könnte das Gerät für die Verwendung mit verschiedenen Zellen und Zell-Kokulturen angepasst werden und deren Reaktionen auf verschiedene lösliche Moleküle testen. Da das Design Hydrogel-verkapselte Zellen umfasst, könnte es verwendet werden, um die Wirkung von Zell-Matrix- und Zell-Zell-Wechselwirkungen auf die Zellreaktion auf lösliche Faktoren wie Therapeutika in einer physiologisch relevanten Umgebung zu untersuchen, die Perfusion einschließt und die Konzentrationsbildung ermöglicht Verdünnungen.

In dieser Studie haben wir ein mikrofluidisches Medikamentenscreening-Gerät entwickelt, das Mikrovertiefungen enthält, die mit in Hydrogel eingekapselten Zellen gefüllt sind. Das Gerät verfügt über Entlastungskanäle, die eine nahtlose Hydrogelbeladung ermöglichen, und membranverschlossene Vertiefungen, um Kontaminationen und Verstopfungen der Perfusionskanäle zu verhindern. Wir haben die Mischeffizienz des Geräts mit reinem PBS und Brilliant Blue FCF charakterisiert und festgestellt, dass eine physiologische Flussrate von 1 µL/min die optimale Flussrate ist, um eine vollständige Durchmischung zu erreichen. Mithilfe der Stokes-Gleichung und des zweiten Diffusionsgesetzes von Fick haben wir die Zeitspanne bestimmt, die für die Diffusion häufig verwendeter Chemotherapeutika über die Breite des Mischkanals erforderlich ist. Bei optimaler Durchflussrate war die erzeugte Konzentrationsverdünnung im Gerät vergleichbar mit der erwarteten Konzentrationsverdünnung. Wir stellten außerdem fest, dass die Ladevorgänge sehr gut reproduzierbar waren, da die mittlere Dichte der in Hydrogel eingekapselten Zellen für jede Spalte von Vertiefungen für alle vier Vertiefungen ähnlich war und die Zellen im gesamten Hydrogel gut verteilt blieben. Wir haben zwei Hydrogeltypen getestet, ein UV-vernetzbares PEGDA und ein durch Addition vernetzbares 4-Arm-PEG-Ac vom Michael-Typ, was darauf hindeutet, dass mit dem Gerät eine Vielzahl von Gelierungsmechanismen berücksichtigt werden können. Ein Arzneimittel-Screening-Assay wurde hervorgehoben, indem eine Dosis-Wirkungs-Kurve für U87-Glioblastomzellen erstellt wurde, die mit Temozolomid und Carmustin, Standard-Chemotherapeutika, behandelt wurden. Eine Einschränkung des aktuellen Geräts besteht darin, dass es eine 4 × 4-Anordnung von Zellkulturvertiefungen enthält, aber eine 8 × 8-Anordnung könnte in Zukunft verwendet werden, um mehrere Bedingungen gleichzeitig zu testen und 7 Verdünnungen zu erhalten (einschließlich einer medikamentenfreien/löslichen Verdünnung). Molekülkontrolle), um robuste Dosis-Wirkungs-Kurven zu erstellen. Mikrofluidische Geräte, wie das hier entwickelte, die Zellen, eine Matrix und Perfusion integrieren, sind eine weitgehende Nachahmung nativer Zellumgebungen und stellen eine einfache, kostengünstige Technik dar, die ein Multiplex-Wirkstoffscreening ermöglicht.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Allison Clancy, Joseph Bruns, Jahnavi Nadella, Samuel Stealey und Sylvia P. Zustiak

Abteilung für Bioingenieurwesen sowie Biochemie und Biophysik, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA

Dayi Chen, Yanjia Zhang und Aaron Timperman

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AT und SZ konzipierten die Idee, gestalteten das Projekt und überwachten und finanzierten die Forschung. AC und SZ haben den ersten Entwurf des Manuskripts geschrieben. Mikrofluidische Geräte wurden von DC unter der Anleitung von ATJB hergestellt und AC erstellte Abbildungen. 1, 5 und ergänzende Abbildung S5. DC, AC und YZ vorbereitet Abb. 2 und ergänzende Abbildungen. S1–S4. AC, JN und SS vorbereitete Abb. 3 und 4. SS vorbereitet Abb. S6. JB bereitete Abb. S7 vor. Alle Autoren haben zum Hauptmanuskripttext beigetragen und ihn überprüft.

Korrespondenz mit Aaron Timperman oder Silviya P. Zustiak.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Clancy, A., Chen, D., Bruns, J. et al. Hydrogelbasiertes Mikrofluidikgerät mit gemultiplexter 3D-In-vitro-Zellkultur. Sci Rep 12, 17781 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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Eingegangen: 01. Juni 2022

Angenommen: 14. Oktober 2022

Veröffentlicht: 22. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22439-y

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