Mechanismen der Membranproteinkristallisation in „Bizellen“

Oct 16, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11109 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Trotz bemerkenswerter Fortschritte, die hauptsächlich auf die Entwicklung von LCP und der „Bicelle“-Kristallisation zurückzuführen sind, bleibt der Mangel an Strukturinformationen ein Engpass in der Forschung zu Membranproteinen (MP). Ein Hauptgrund ist das fehlende vollständige Verständnis des Kristallisationsmechanismus. Hier präsentieren wir Kleinwinkelstreuungsstudien zur Entwicklung der „Bicelle“-Kristallisationsmatrix im Verlauf des MP-Kristallwachstums. Die Matrix entspricht zunächst einem flüssigkeitsähnlichen Bizellenzustand. Nach Zugabe des Fällungsmittels geht die Kristallisationsmatrix jedoch in einen geleeartigen Zustand über. Die Daten legen nahe, dass diese letzte Phase aus miteinander verbundenen bandartigen Doppelschichten besteht, in denen Kristalle wachsen. Es erscheint eine kleine Menge multilamellarer Phase, deren Volumen gleichzeitig mit dem Volumen der wachsenden Kristalle zunimmt. Wir vermuten, dass die lamellare Phase die Kristalle umgibt und für das Kristallwachstum entscheidend ist, was auch bei der LCP-Kristallisation üblich ist. Die Studie offenbart Mechanismen der „Bicelle“-MP-Kristallisation und wird ein rationales Design der Kristallisation unterstützen.

Membranproteine ​​(MPs) spielen eine wesentliche Rolle in lebenden Zellprozessen wie dem Ionentransport durch die Membran, der Energieumwandlung und der Signalübertragung1,2. Ein Drittel des menschlichen Genoms kodiert Membranproteine. Aufgrund ihrer bedeutenden Rolle in der menschlichen Physiologie sind Membranproteine ​​das Ziel von etwa 60 % der derzeit verwendeten Medikamente3,4. Die bislang am weitesten verbreitete Methode zur Gewinnung hochauflösender Proteinstrukturen ist die Röntgenkristallographie, für die hochwertige Proteinkristalle erforderlich sind. Allerdings bleibt die Kristallisation von Membranproteinen eine große Herausforderung. Einzigartige Strukturen von Membranproteinen5 machen nur etwa 1 % aller verfügbaren einzigartigen hochauflösenden Proteinstrukturen6 aus. Eine der In-Meso-Methoden ist die Kristallisation in einer bizellaren Mischung7,8,9,10,11. Dennoch führt diese Methode zur Aufklärung mehrerer wichtiger MPs, deren Mechanismus noch unklar ist und nur auf umfassenden Versuchen und Irrtümern beruht. Der Begriff „Kristallisation aus Bizellen“ bezieht sich möglicherweise nur auf den Anfangszustand der Matrix, und die Entwicklung des Bizellenzustands zu einer Matrix, die das Kristallwachstum unterstützen kann, wurde nicht aufgeklärt.

Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um neue Methoden, Materialien und Werkzeuge zu entwickeln, die dabei helfen könnten, diese Stolpersteine ​​zu überwinden. Trotz früherer Versuche ist die Geschwindigkeit der Ablagerung von Membranproteinstrukturen (die erste Membranproteinstruktur wurde 1985 abgeschieden) jedoch immer noch weit von der Geschwindigkeit entfernt, die bei löslichen Proteinen erreicht wurde.

Um diese Herausforderung zu meistern, wurde 1996 eine neue Methode eingeführt, nämlich die MP-Kristallisation in der Lipid-Kubik-Phasenmatrix (LCP)12. Dieser Ansatz ermöglichte die Kristallisation anspruchsvoller MPs (z. B. Rhodopsine13,14,15 und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren). die der Kristallisation mit den Standard-Dampfdiffusionsmethoden jahrzehntelang widerstanden haben16,17,18.

Der In-Meso-Kristallisationsansatz wurde weiterentwickelt und mit anderen Methoden und Werkzeugen erweitert, z. B. der Nutzung von Lipiden mit unterschiedlichen Eigenschaften zur Schaffung der LCP-Matrix19, der Kristallisation aus MSP-basierten20 oder polymergebundenen21,22 Nanoscheiben und der Kristallisation aus Bizellen7,9 ,10.

Zuvor wurden Bizellen als membranähnliches Modell eingeführt, das Mizellen möglicherweise überlegen ist23. Es wurde gezeigt, dass einige Mischungen aus Lipiden und Detergenzien scheibenförmige Partikel bilden, mit einer Lipiddoppelschicht, einem Kern und einem durch Detergenzien stabilisierten Rand, der eine stabilisierende Umgebung für MPs bietet, indem er native Zellmembranen nachahmt. Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) wird häufig als langkettige Phospholipidkomponente von Bizellen verwendet und kann mit Phospholipiden mit ähnlicher Kettenlänge, aber unterschiedlichen Kopfgruppen dotiert werden. Andererseits kann der Rand durch ein kurzkettiges Gallensalzderivat wie 3-(Cholamidopropyl)-dimethylammonio-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO) stabilisiert werden. Da das langkettige Phospholipid in Bizellen in der planaren Kernregion gebunden ist, die kein kurzkettiges Phospholipid oder Detergenz enthält, ahmt die Kernregion einer Bizelle einen Abschnitt einer natürlichen Membran viel besser nach als herkömmliche Detergensmizellen. Die Größe und die Eigenschaften dieser Lipidpartikel können in Abhängigkeit vom Verhältnis eines langkettigen Lipids zu einem Detergens oder einem kurzkettigen Lipid (Q-Verhältnis) und der Lipidkonzentration variiert werden. Die Variation von Q bietet eine Vielzahl ähnlicher Bizellenphasen, die für verschiedene Arten biologischer Studien zugänglich sind. Im Allgemeinen werden bei einem hohen Lipidverhältnis (Q > 2) und einem weiten Konzentrationsbereich (Clp = 0,25–25 % (w/w)) Bizellen mit einem Durchmesser von etwa 100–500 Å gebildet24,25,26,27 ,28,29,30,31,32,33. Die Verringerung von Q führt zu kleineren Bizellen24,34,35,36.

Bizellare Mischungen zeigen strukturelle Plastizität in Abhängigkeit vom Verhältnis von Lipid zu Detergens (oder einem kurzkettigen Lipid) (Q), der Lipidkonzentration (Clp), der Temperatur (T) und der chemischen Zusammensetzung24,25,28,29,31,37,38 ,39,40,41,42,43,44,45.

Im Jahr 2002 präsentierten S. Faham und JU Bowie erstmals eine neue Methode zur Kristallisation von Membranproteinen auf Basis bizellenbildender Lipid-/Detergenssysteme7. Die mit diesem Ansatz erhaltenen Bakteriorhodopsin (BR)-Kristalle gehörten zur Raumgruppe P21 mit Elementarzellenabmessungen von a = 45,0 Å, b = 108,9 Å, c = 55,9 Å, β = 113,58° und einer dimeren asymmetrischen Einheit und wurden zu hoch gebeugt Auflösung. Man geht davon aus, dass es sich bei den BR-Kristallen um Typ 1 mit einer typischen membranartigen Sandwich-Packung von Proteinen handelte, wie dies bei allen durch den LCP-Ansatz gezüchteten Kristallen der Fall ist. Seitdem wurden mehrere wichtige Membranproteine ​​auf diese Weise kristallisiert7,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66,67,68,69,70,71,72 (siehe Tabelle 1 und die erweiterte Version, Tabelle S1).

Im Gegensatz zum vorherrschenden Paradigma zeigt unsere Analyse der Literaturdaten, dass die veröffentlichten Strukturen, die mit den mit dem „Bicelle“-Ansatz gezüchteten Kristallen erhalten wurden, beiden Typen angehörten (nicht nur Typ-I-Kristallen, die für die Mesokristallisation typisch sind). Während integrale Proteine ​​ohne wasserlösliche Domänen normalerweise schichtartige Typ-I-Kristalle bilden, neigen Proteine ​​mit relativ großen (50 Å und mehr) wasserlöslichen Bereichen dazu, Typ-II-Kristalle zu bilden. Abhängig von den Kristallisationsbedingungen können sich jedoch auch im letzteren Fall Typ-I-Kristalle bilden (siehe Tabelle S1). Insbesondere besteht keine sichere Abhängigkeit des Kristalltyps von der Zusammensetzung der Fälllösung. Dies kann bedeuten, dass der Membranproteinkristall, der aus dem anfänglichen Bizellenzustand wächst, grundsätzlich unterschiedliche Wege des Strukturzustands der Kristallisationsmatrix durchlaufen kann, was zu zwei grundsätzlich unterschiedlichen Arten von Kristallen führt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf dem Wachstum von Typ-I-Kristallen.

Die Morphologie von Bizellensystemen wurde mittels SAS, NMR, AFM und EM25,28,29,31,37,38,39,40,41,42,43,73 untersucht. Für für die Kristallisation geeignetes Q (ca. Q = 3) weist das zusammengefasste Phasendiagramm bestimmte Regionen auf, darunter Bizellen, nematische Phasen, wie verzweigte wurmartige Mizellen oder bandartige Strukturen, multilamellare Strukturen und perforierte Membranen (siehe ergänzende Abbildung S1). (A)). Es ist bekannt, dass der Phasenzustand von Lipidsystemen von der Temperatur abhängt, was sich auf die Proteinkristallisation auswirken kann74.

Obwohl die Abhängigkeit des Systems von der Temperatur komplex ist, wurden die meisten mit der Bizellenmethode gezüchteten Kristalle interessanterweise bei Raumtemperatur erhalten. Im Allgemeinen handelt es sich bei dem System bei niedrigen Temperaturen und Lipidkonzentrationen um eine flüssige Suspension, die Bizellen enthält. Mit steigender Temperatur und Clp-Konzentration bildet das System wurm- und bandartige Strukturen28,30,37,38,39,75,76. Eine weitere Temperatur- oder Konzentrationserhöhung führt zu einem Übergang in eine Gelphase bestehend aus unilamellaren oder multilamellaren Strukturen und perforierten Membranen24,28,29,37,38,39,75,77,78. Ein ähnliches DMPC/CHAPSO-System wie das in dieser Studie verwendete wurde bereits zuvor beschrieben24. In einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 32 °C besteht dieses System aus bizellären und bandartigen Strukturen, wobei ein Teil des Diagramms nicht definiert wurde (Abbildung S1(B)).

Die meisten veröffentlichten Phasendiagramme wurden für reine wässrige Suspensionen der Bizellen erstellt. Bei einem Kristallisationsexperiment werden dem System ein Fällungsmittel und ein MP zugesetzt, und seine Morphologie kann sich ändern. Es wurde gezeigt, dass das Phasenverhalten der bizellaren Mischung durch eine Membranladung und einen Puffersalzgehalt beeinflusst wird. Beispielsweise fördert ein hoher Salzgehalt die Bläschenbildung und die Bildung von Aggregaten in geladenen DMPC/DHPC/DGPC-Systemen79. Das Vorhandensein einer Ladung auf der Membran kann wiederum eine Perforation der Lipiddoppelschicht induzieren24,30,80.

Daher bedeutet der häufig verwendete Begriff „Kristallisation aus Bizellen“ möglicherweise nur, dass die anfängliche Kristallisationsmatrix eine flüssige Phase ist, die aus Bizellen, Membranproteinen (umgeben von nativen Membranen oder membranähnlichen Systemen) und Puffer besteht. Es ist jedoch nicht bekannt, was mit der Kristallisationsmatrix nach dem Beginn der Kristallisation (nach Zugabe des Fällungsmittels) passiert und wie der Phasenzustand (die Struktur) beim Kristallwachstum ist.

Hier präsentieren wir die Ergebnisse der Kleinwinkel-Röntgen- und Neutronenstreuungsstudien (SAXS und SANS) zur strukturellen Entwicklung der Kristallisationsmatrix von der anfänglichen Bizelle bis zum endgültigen geleeartigen Zustand, in dem MP-Kristalle wachsen. Bei niedrigen Q-Werten bilden Amphiphile Mizellen81, wohingegen sie bei steigendem Q eher zur Bildung von Bizellen neigen. Für die Proteinkristallisation werden Mischungen mit Q = 2–3 verwendet, und die am häufigsten verwendeten Amphiphile sind DMPC und CHAPSO (oder DHPC) (siehe Liste in Tabelle S1)7,46,47,48,49,50,51 ,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70.

Das Wachstum der Membranproteinkristalle wurde in denselben Experimenten gleichzeitig überwacht. Der endgültige (geleeartige) Zustand der Matrix, in dem die Kristalle wuchsen, wurde durch miteinander verbundene bandartige Doppelschichten gebildet.

Für unsere Studie verwendeten wir ein gut getestetes Kristallisationssystem und Bedingungen, unter denen zuvor die Bildung von BR-Kristallen beobachtet wurde7,46. Die Experimente waren in die folgenden vier Schritte unterteilt (Abb. 1A): (1) Vorbereitung des Kristallisationssystems auf Eis; (2) Laden des Kristallisationssystems in eine Glaskapillare; (3) Zugabe eines Fällungsmittels und Echtzeitüberwachung der Strukturentwicklung der Kristallisationsmatrix; (4) Echtzeitüberwachung der Bildung von Bakteriorhodopsin-Kristallen in der Kristallisationsmatrix.

Reihenfolge der Versuchsschritte. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Phasen der Kristallisation von Bakteriorhodopsin in Bizellen innerhalb von Kapillaren. Schritt 1 – Vorbereitung des Kristallisationssystems auf Eis (Mischung aus Bizellen und violetten Membranen); Schritt 2 – Laden der bizellaren/violetten Membranmischung in eine Kapillare; Schritt 3 – Zugabe eines Fällungsmittels und Überwachung nachfolgender Veränderungen der Kristallisationsmatrix; Schritt 4 – Überwachung der Bildung der BR-Kristalle. Während der Schritte 2–4 erfolgte die Überwachung der Struktur des Kristallisationssystems und des Kristallwachstums mithilfe von Echtzeit-SAXS. (B) – Fotos des Kristallisationssystems in verschiedenen Schritten der Experimente (vertikal an A ausgerichtet), entsprechend den Schritten 1 (Tag 0), 2 (Tag 4), 3 (Tag 8 und 17); Das Kristallisationssystem stellt eine transparente/halbtransparente homogene Phase dar. In Schritt 4 (Tag 24, 25 und 65) erschienen kleine Kristalle, die dann ihre maximale Größe erreichten.

In den Schritten 2–4 erfolgte die Überwachung des Kristallisationssystems und des Kristallwachstums mit SAXS (Abb. 2, 3). Parallel dazu wurde das System auch mit einem optischen Mikroskop (Olympus SZX-ILLK200) beobachtet (Abb. 1B).

Entwicklung der Kristallisationsmatrix während des Kristallisationsprozesses. Die SAXS-Kurven für die reine DMPC/CHAPSO-Mischung ohne PM (links) und das Kristallisationssystem DMPC/CHAPSO/PM (rechts). Experimentelle Daten für Kristallisationssysteme mit und ohne PM sind entsprechend als hellviolette und orangefarbene Hohlkreise dargestellt. SAXS-Kurven für PM werden als dunkelviolette Quadrate dargestellt. Die Annäherungen durch Formfaktoren der Bizellen und Bänder werden als blaue Linien dargestellt. Die grafischen Darstellungen der strukturellen Organisation der Kristallisationsmatrix werden neben den entsprechenden SAXS-Kurven angezeigt.

Transformation der SAXS-Kurven für das Kristallisationssystem während der verschiedenen Schritte des Kristallisationsprozesses. (A) Die SAXS-Kurven beziehen sich auf verschiedene Schritte des Kristallisationsprozesses. Die roten Pfeile im Kleinwinkelbereich zeigen die Interferenzpeaks aus der Lipid-/Detergens-smektischen Phase an (Kurvenbezeichnungen sind in der Legende angegeben; die Nummerierung der Schritte ist in Abb. 1 beschrieben). (B) Die aus den SAXS-Kurven (Teil A) durch Subtraktion der Grundlinie extrahierten Spitzen. Die Kurven sind skaliert, um sie zur besseren Visualisierung vertikal zu trennen. Die schwarzen Pfeile „Lα1“ und „Lα2“ (in beiden A,B gezeigt) zeigen die lamellaren Peaks erster und zweiter Ordnung an; Der andere schwarze Pfeil „Lcryst 64 Å“ zeigt den Peak der lokalen lamellaren Phase an, die mit der Proteinoberfläche verbunden ist. Der Abstand dieses Lcryst beträgt 64 Å. Der Pfeil „68 Å“ zeigt den Vorläufer der Lcryst-Phase an.

Zusätzlich zum Kristallisationssystem, das Protein enthielt, untersuchten wir (als Referenz) auch dasselbe System unter denselben Bedingungen, jedoch ohne Protein. Die Daten und Berechnungen zeigen, dass die Anwesenheit von Protein die Morphologie der Kristallisationsmatrix nicht beeinflusst. Das berechnete Verhältnis von BR zu DMPC in unserem System (das Molverhältnis 1:200; das Querschnittsflächenverhältnis in einer Membran 1:17; das Volumen 1:6) stützt unsere Schlussfolgerungen.

Die Vorbereitung des Kristallisationssystems (Protein/Bizellen-Gemisch) erfolgte auf Eis gemäß dem im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschriebenen Standardverfahren. Es ist erwähnenswert, dass wir anstelle des durch Detergens solubilisierten BR violette Membranen verwendet haben. Es wurde angenommen, dass das System eine Bizellenstruktur aufweist, da die Mischung DMPC/CHAPSO bei niedrigen Konzentrationen und niedrigen Temperaturen Bizellen bildet46. Um dies zu überprüfen, haben wir alle unsere SAXS-Experimente bei Raumtemperatur durchgeführt; Zwischen den SAXS-Messungen wurden die Kapillaren in einer temperaturkontrollierten Box bei 32 °C aufbewahrt. Die anfängliche Konzentration der DMPC/CHAPSO-Mischung betrug 5,6 %, was auch für die Bizellen bei Raumtemperatur niedrig genug ist. Mithilfe der Streumethode beobachteten wir die Bildung der Bizellen sowohl in unserem reinen System (kein Protein) in einem geeigneten Puffer (Abb. 2A) als auch im Kristallisationssystem in Schritt 1, Schritt 2 (Abb. 2B).

Das abgekühlte Kristallisationssystem wurde in die Kapillare überführt (siehe „Materialien und Methoden“ und Abbildung S2). Anschließend wurde das Kristallisationssystem mit SAXS bei Raumtemperatur untersucht. Zum Vergleich wurde die violette Membransuspension in eine andere Kapillare geladen. Diese Suspension enthielt die gleiche Proteinkonzentration wie das Kristallisationssystem (8,4 mg/ml). Die Streukurven für beide Proben sind in Abb. 2B dargestellt. Im Kleinwinkelbereich (bis 0,04 Å−1) folgen die Kurven einem linearen Verhalten mit einer Steigung von −1,8 für das Kristallisationssystem und −2,0 für die violetten Membranen. Diese Steigungen deuten auf große lamellare Strukturen in den Proben hin, in unserem Fall auf die violetten Membranen. Wir haben die Streuintensität der violetten Membranen von der Intensität des Kristallisationssystems abgezogen. Das Ergebnis ist in Abb. 2B dargestellt (die Kurve ist als „Differenzintensität“ gekennzeichnet). Die Differenzintensität kann durch einen Formfaktor für die Bizellen (Modell 1) mit einem Radius von 50 Å und einer Höhe von 45 Å angepasst werden (siehe Anpassung in Abb. 2B und Anpassungsparameter in Tabelle S2). Darüber hinaus untersuchen wir die Struktur der reinen bizellaren Kristallisationsmatrix in Abwesenheit von Purpurmembranen mithilfe von SAXS und SANS (Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“). Das Kristallisationssystem stellt eine bizellare Mischung mit ähnlichen Parametern dar, die in Tabelle S2 beschrieben sind, und die Anpassungskurven sind in Abb. 2A (für das SAXS-Experiment) und Abbildung S3 (für SANS) dargestellt. Die SAXS- und SANS-Daten für diese Systeme sind konsistent. Zur Anpassung der SAXS/SANS-Daten aus den Bizellen verwendeten wir Modell 1 eines Zylinders mit einem Kern-Schale-Streulängendichteprofil (SLD), das in „Materialien und Methoden“ beschrieben wird. Ein ähnliches Modell wurde erfolgreich in früheren SAS-Studien an Bizellen mit unterschiedlichen Lipid-/Detergenzgehalten44,82,83,84 eingesetzt (siehe auch Abschnitt „SAXS-Profile für Bizellen“ im Textdokument S2).

Im Durchschnitt betragen die Kernradien etwa 40 Å; Unter Berücksichtigung der Gürteldicke ergibt sich ein Gesamtdurchmesser der Bizellen von ~ 100 Å (siehe Abschnitt „Unterschiede in den Bizellenradien“ im Textdokument S2). Der Durchmesser der Bizellen, der in der Arbeit24 für das analoge System (DMPC/CHAPSO-Mischung, Q = 3) beobachtet und mittels Elektronenmikroskopie ermittelt wurde, lag im Bereich von 100–500 Å. Gemäß ihrer SANS-Modellanpassung betrug der Durchmesser etwa 420 Å. In der genannten Arbeit betrug die Gesamtkonzentration an Lipid/Detergens jedoch 0,25 Gew.-%, wohingegen sie in unseren Experimenten im Bereich von 5,6 bis 14 % lag. Wie in 38 gezeigt, hängt die durchschnittliche Größe von Bizellen entscheidend von der gesamten Lipid-/Detergenskonzentration ab: Der pseudohydrodynamische Radius nimmt um ein Vielfaches ab, wenn die gesamte Lipidkonzentration um ein Vielfaches ansteigt. Daher stimmt der in unserer Studie ermittelte Bizellendurchmesser von ~ 100 Å mit den aktuellen Daten zu Bizellen überein.

Die Datensätze, die der Mischung der Bizellen mit PMs (dh dem Kristallisationssystem) in den Schritten 1–2 entsprechen, könnten als Summe der Streudaten von PMs und reinen Bizellen beschrieben werden (siehe Abb. 2B und Abschnitt „Anpassung der Differenz“) Intensitäten“ im Textdokument S2). Somit können wir das Kristallisationssystem vor der Zugabe eines Fällungsmittels als eine einfache Mischung aus Bizellen und violetten Membranen beschreiben.

Nachdem das Kristallisationssystem (violette Membran/Bizellen-Mischung) in die Kapillare geladen wurde, wurde ein Fällungsmittel über der Kristallisationsmischung in dieselbe Kapillare gegeben, wobei zwischen dem Kristallisationssystem und dem Fällungsmittel ein Luftspalt bestand (siehe Abschnitt „Experimentell“). Von diesem Moment an begann das Volumen des Kristallisationssystems aufgrund der Diffusion von Wasser aus der Kristallisationsmatrix in die Fällungsmittellösung zu schrumpfen. Nach einer Woche verringerte sich das Volumen um 50–60 % und in der nächsten Woche entsprach es wieder 40 % des Ausgangsvolumens. Danach waren nur noch geringfügige Veränderungen zu beobachten. Das Diagramm der Volumenbewertungsabnahme ist in Abbildung S4 dargestellt.

Die Entwicklung der SAXS-Kurven während Schritt 3 ist in Abb. 3 dargestellt. Die Kurven erfuhren erhebliche Änderungen und die Kristallisationsmatrix nahm einen Übergangszustand ein. Dann stabilisierte sich die Matrix und veränderte ihre Morphologie nicht. Dieser letzte Zustand ist ein Schwerpunkt unserer gründlichen Untersuchung, da er zeigt, dass die Kristalle in diesem Zustand der Kristallisationsmatrix zu wachsen beginnen.

Es ist wichtig zu beachten, dass die entscheidenden Änderungen im SAXS-Profil in den frühen Stadien von Schritt 3 (Abb. 2C, D) hauptsächlich durch einen Anstieg der Salzkonzentration verursacht werden. Ein Puffer mit erhöhter Salzkonzentration hat eine höhere Elektronendichte (siehe Abschnitt „Puffer-SLD-Werte bei verschiedenen Schritten“ im Textdokument S2), weshalb sich das Verhältnis zwischen den Kontrasten Δρ = ρ – ρPuffer der Bizellenkomponenten dramatisch mit der Salzkonzentration ändert , was zu einer Variation des SAXS-Signals führt.

In diesem Stadium ist das Kristallisationssystem wie in Schritt 2 eine einfache Mischung aus Bizellen und Purpurmembranen (siehe Abb. 2D und Abschnitt „Anpassung unterschiedlicher Intensitäten“ im Textdokument S2), deren Konzentration jedoch aufgrund der Verdunstung des Wassers höher ist aus dem Kristallisationssystem. In der Zwischenzeit unterliegen die Strukturparameter der Bizellen geringfügigen Änderungen (siehe Tabelle S2 und Abschnitt „SLD-Änderungen in Bizellen“ im Textdokument S2).

Mit fortschreitender Trocknung erfährt das System morphologische Veränderungen. Für die Interpretation der SAXS-Kurve im späteren Stadium von Schritt 3 (Abb. 2E, F) haben wir uns an dem Phasendiagramm orientiert, das für die DMPC/CHAPSO-Mischung in24 erhalten wurde, wobei das Molverhältnis Q = 3 nahe bei Q = lag 2,7 in unseren Experimenten. Die Temperatur- und Konzentrationsbedingungen in unseren Experimenten sind im Diagramm in Abbildung S1 durch ein violettes Rechteck markiert. Zuvor wurde die Reorganisation von Bizellen in längliche band- und wurmartige Aggregate mit verschiedenen Methoden nachgewiesen (SAS, Elektronenmikroskopie, NMR, polarisierte optische Mikroskopie)24,38,75,85,86. Da das DMPC dazu neigt, eine Doppelschicht zu bilden, sollten diese länglichen „wurmartigen“ Objekte einen abgeflachten Querschnitt (bandartig) mit einer Dicke haben, die nahe an der Dicke der DMPC-Doppelschicht liegt. Daher wurde für die Approximation von SAXS auf den Bändern das Modell eines elliptischen Zylinders mit einem Kern-Schale-Streulängendichteprofil verwendet (siehe „Materialien und Methoden“, Modell 2). Das analoge Modell des elliptischen Zylinders wurde bereits in24 zur Anpassung der SANS-Daten verwendet; In der genannten Arbeit wurde jedoch davon ausgegangen, dass der Zylinder die gleiche Dichte aufweist, was für die Anpassung an die SANS-Daten ausreicht. Der Fall der SAXS-Daten erfordert ein Kern-Schale-Modell für theoretische Näherungen, da die hydrophoben und hydrophilen Teile von Mizellen und/oder Doppelschichten ein unterschiedliches Vorzeichen des Kontrasts Δρ = ρ – ρPuffer haben (siehe beispielsweise Tabelle S3). Tatsächlich wurde beobachtet, dass die Gesamtbanddicke sowohl in unseren Berechnungen (siehe Tabelle S3) als auch in der Arbeit etwas größer war als die erwartete Dicke der DMPC-Doppelschicht24.

Die Bildung von Bändern aus Bizellen ist mit der DMPC-Umverteilung und den CHAPSO-Molekülen zwischen dem Kopf- und Gürtelbereich der Bizellen verbunden, was entsprechend zur SLD-Vereinheitlichung und zur Dicke der hydrophilen Hülle des Bandes führt. Daher wird die Dicke der resultierenden hydrophilen Hülle des Bandes auf den Wert Tshell = Max (Hhead, ΔR) = ΔR = 11,4 Å festgelegt.

Da Bänder aus der anfänglichen Bizellenphase stammen, erwarten wir die Existenz von Zwischenphasen, die durch Bizellen und Bänder dargestellt werden. Diese Annahme stimmt mit den entsprechenden Bereichen des Phasendiagramms der Bizellen überein (siehe Abbildung S1B). So beobachteten wir die Koexistenz von Bizellen und Bändern in einer reinen DMPC/CHAPSO-Mischung (ohne PMs). Die Streukurve für dieses System wird mit zwei Modellen angenähert: einem Band und einer Mischung aus Band und Bizellen. Die Ergebnisse beider Ansätze sind in Tabelle S3 und Abb. 2E dargestellt. Im Allgemeinen unterscheiden sich die erhaltenen Strukturparameter nicht dramatisch: Die Bandlänge (L) beträgt in beiden Fällen etwa 330 Å, die kleineren/großen Radien des hydrophoben Kerns der Bänder betragen 25 Å/47 Å für den Fall der Band/Bizellen-Mischung und 20 Å/43 Å nur für Bänder (siehe Tabelle S3). Im Fall der Band-Bizellen-Mischung ist der χ2-Wert jedoch viel niedriger (1,2 statt 3,5) und entspricht einer genaueren Näherung.

Entsprechend den Volumina der hydrophoben Kerne der Bänder und Bizellen im Fall der DMPC/CHAPSO-Mischung (ohne PM) im Stadium der Bildung der Bänder, für die die Streukurve in Abb. 2E erhalten wurde Ein Band besteht aus etwa zehn Bizellen.

Die in den letzten Stufen von Schritt 3 für das Kristallisationssystem (DMPC/CHAPSO/PMs) erhaltene SAXS-Kurve (siehe Abb. 2F) enthält Beugungspeaks der lamellaren Phasen Lα, Lcryst und der „Phase 500–700 Å“. Im Allgemeinen ähnelt die Hintergrundkurve hier der Streukurve von Bändern im Fall der DMPC/CHAPSO-Mischung (siehe Abb. 2E). Insbesondere stimmt der Hintergrund gut mit dem Formfaktor von Bändern überein (siehe durchgezogene Linie in Abb. 2F), und die erhaltenen Strukturparameter liegen nahe an denen, die für Bänder in einer „reinen“ DMPC/CHAPSO-Mischung erhalten wurden (siehe Tabelle S3). Daher sind die Bänder in dieser Phase des Kristallisationsprozesses der Hauptbestandteil des Kristallisationssystems.

Wichtig ist, dass die Streukurve in diesem Stadium keinem linearen Verhalten mit einer für abgeflachte Strukturen typischen Steigung von –2,0 folgt. Dies könnte bedeuten, dass PMs in ihrem ursprünglichen Zustand zu diesem Zeitpunkt nicht vorhanden sind. Zumindest reicht die Konzentration der verbleibenden Feinstaubpartikel nicht aus, um von SAXS erfasst zu werden. Dies weist darauf hin, dass ein Großteil der PMs synchron mit dem Übergang von Bizellen zu Bändern dissoziiert und BR-Moleküle direkt in Bänder eingebaut werden. Wenn man bedenkt, dass die Menge an violetten Membranen um eine Größenordnung geringer ist als bei der DMPS/CHAPSO-Mischung, gehen wir davon aus, dass sich alle violetten Membranen auflösen sollten.

In den späteren Kristallisationsschritten stabilisierte sich die Matrix und die SAXS-Kurven zeigten keine weiteren signifikanten Veränderungen. Zu diesem Zeitpunkt werden in den SAXS-Kurven mehrere Spitzen beobachtet (Abb. 2F und 3). Es gibt zwei Gruppen von Gipfeln unterschiedlicher Herkunft. Wir geben ihnen folgende Bezeichnungen: 500–700 Å und Lα. Die erste Gruppe weist breite Peaks in einem kleinen Winkelbereich q < 0,025 Å−1 auf (in Abb. 3A sind die Kurven als Schritte 3.3 und 4.1 angegeben; rote Pfeile zeigen die Peaks an). Diese Spitzenwerte wurden ein bis sieben Tage vor und einen Tag nach der Entdeckung der Kristalle beobachtet. Dann verschwanden diese Spitzen, als die Kristalle zu wachsen begannen. Diese Peaks wurden von der anderen Gruppe der Lamellenpeaks Lα für 70–80 Å begleitet (wird im nächsten Unterabschnitt beschrieben) oder wurden unmittelbar vor dem Erscheinen dieser Lα-Lamellenpeaks beobachtet (siehe Schritt 3.3 in Abb. 3A).

Die erste Peakposition entspricht dem Gitterparameter d = 2π / qmax 500–700 Å (Durchschnittswert für Probenserien beträgt 660 Å). Der zweite Peak, der d = 2π/qmax ~ 350 Å entspricht, könnte der Peak zweiter Ordnung des oben erwähnten Peaks (660 Å) sein; Das Spitzenpositionsverhältnis variiert zwischen 1:1,79 und 1:1,89. Oder diese beiden Peaks können unterschiedliche Ursprünge haben, da das Verhältnis der Peakpositionen nicht gleich 1:2 ist. Es ist erwähnenswert, dass ihr Aussehen synchronisiert ist (siehe Abschnitt „Diskussion“) und der Gitterparameter d ~ 350 Å möglicherweise sehr nahe an der Bandlänge liegt. Leider können wir keine Rückschlüsse auf den Ursprung dieses Peaks ziehen, da die Länge der Bänder aufgrund der Nichtverfügbarkeit der Daten im q-Bereich, der der Bedingung q L ≪ 1 entspricht, nicht genau geschätzt werden kann.

Da die kleinen Winkelspitzen vorübergehender Natur sind, war es schwierig, ihr Verhalten mit derselben Probe zu überwachen. Wir haben nur zwei aufeinanderfolgende Kurven, die darauf hinweisen, dass die Intensität des Peaks zunahm und sich sein Maximum in kleinere Winkel verschob (hervorgehoben durch das gestrichelte Rechteck in Abb. 4). Unsere Diskussion über die mögliche Natur dieser Spitzen finden Sie im Abschnitt „Diskussion“.

SAXS-Peaks stammen aus der Lipid-/Detergens-Kristallisationsphase vor oder zum Zeitpunkt der Kristallbildung. Die Positionen der Peaks entsprechen Abständen von 500–700 Å (diese Werte wurden aus den Positionen der Peaks 1. Ordnung berechnet). Die Diagramme werden nach Subtraktion der Grundlinie dargestellt. Die beobachteten Peaks verschwanden mehrere Tage nach ihrem Auftreten. Jede Kurve wird in einer anderen Kapillare gemessen. Die Kurven sind skaliert, um sie zur besseren Visualisierung vertikal zu trennen. Das gestrichelte Rechteck markiert zwei aufeinanderfolgende Kurven derselben Probe: Diese Kurven zeigen, dass die Spitzenintensität mit der Zeit zunimmt und sich zu kleineren Winkeln verschiebt. Die Pfeile geben die Position der Peaks 2. Ordnung an.

Die zweite Peakgruppe entspricht der lamellaren Phase Lα mit dem Gitterparameter d = 70–80 Å. Es gibt zwei lamellare Beugungspeaks im mittleren Bereich der Streuvektoren q (Abb. 3, angegeben als „Lα1“ und „Lα2“). Das Verhältnis zwischen den Maximalpositionen der Peaks beträgt 1:2. Diese Peaks traten vor der BR-Kristallbildung auf und blieben auch nach der Kristallbildung während unseres gesamten Beobachtungszeitraums (zwei Monate) in den Kurven. Ihre Intensität nahm zu und die Position des Maximums verschob sich im Laufe der Zeit zu einem größeren q (Abb. 3B und Abbildung S5). Darüber hinaus wurden diese Peaks in den Kurven der Proben beobachtet, bei denen wir keine BR-Kristalle fanden. Wir untersuchten das Strukturverhalten der reinen Lipidmatrix in Abwesenheit von BR unter Kristallisationsbedingungen und stellten fest, dass die lamellaren Peaks auch dort im letzten Schritt der Trocknung der Lipidmatrix beobachtet wurden (Abb. 2G), was darauf hinweist, dass die Natur von Diese Peaks stammen aus der Lipidmatrix.

Wir haben die Lamellenabstände d von der 1. Peakposition qm1 auf d = 2π / qm1 geschätzt. Als die lamellaren Peaks zunächst auftraten, entsprachen sie einem Abstand von etwa 84 Å und dann mit der Zeit einem Abstand von 73 Å. Diese Werte wurden für eine Reihe von Proben (13 Elemente) zusammengefasst. Der Wiederholungsabstand d für die Lipidmatrix ohne BR entspricht 74 Å. Der Übergang der bizellaren Mischung in die lamellare Phase wurde für die reinen DMPC/CHAPSO- und DMPC/DHPC-Systeme bei steigenden Temperaturen berichtet24,25,29,31,73,87. Die angegebenen Abstände für die reinen DMPC/CHAPSO- und DMPC/DHPC-Mischungen betragen dementsprechend etwa 62 Å und 65 Å24,29 und für die multilamellaren Vesikel des reinen DMPC etwa 62 Å44,88. Der größere Wert von 73 Å in unseren Experimenten kann durch die Anwesenheit eines hochkonzentrierten Puffers und BR-Molekülen verursacht werden.

Es gibt Hinweise darauf, dass bizellare Gemische perforierte Membranen bilden können24,37,38,39,75,80,89,90, deren Poren von einem kurzkettigen Detergenz umrandet sind. SAXS ist nicht in der Lage, eine homogene Doppelschicht von einer perforierten zu unterscheiden. Dennoch nehmen wir an, dass mutmaßliche Perforationen vorhanden sein sollten, um lamellare Membranen zu verbinden und die Proteinmigration von Doppelschichten zum Ort des Kristallwachstums zu unterstützen, was notwendige Bedingungen für das Kristallwachstum darstellt. Weitere Arbeiten zur Erlangung von Beweisen zur Untermauerung dieser Hypothese sind geplant.

Somit beginnt nach der Zugabe des Niederschlags das Kristallisationssystem, das zunächst eine Mischung aus Bizellen und Purpurmembranen ist, zu schrumpfen: Die Konzentration an Bizellen und Purpurmembranen nimmt zu. Dann verschmelzen die Bizellen zu Bändern, dieser Vorgang geht mit der Auflösung violetter Membranen einher. Auch bei diesem Schritt wird die Bildung einer temporären Phase mit charakteristischen Parametern von 500–600 Å beobachtet. Es entsteht auch eine multilamellare Phase mit einem durchschnittlichen Gitterparameter von 73 Å. Diese Phase verbleibt bei Schritt 4, wenn Kristallwachstum beobachtet wird.

Als die Kristallisationsmatrix stabilisiert war, begannen die BR-Kristalle zu wachsen. Wir beobachteten das Auftreten der Kristalle mit einem Vis-Mikroskop (siehe „Materialien und Methoden“) in den bei 32 °C gelagerten Proben zwei bis drei Wochen nach der Kapillarfüllung und in fünf Wochen in den Proben, die vier Wochen lang gelagert wurden auf Raumtemperatur gebracht und dann in eine temperierte Box mit einer Temperatur von 32 °C verbracht. Bemerkenswerterweise beschleunigte die Bewegung der Proben auf 32 °C das Auftreten der Kristalle. Das Kristallwachstum wurde von Beugungspeaks begleitet, die in den Streukurven im Weitwinkelbereich (Abb. 3, Schritte Nr. 4) entsprechend dem Kristallgitter auftraten (siehe unten). Die Intensität der Kristallpeaks nahm mit dem Wachstum der Proteinkristalle zu (siehe Abbildung S5). Diese Kristallpeaks wurden immer in Gegenwart der Lamellenphasenpeaks Lα1, Lα2 beobachtet, wie oben im Abschnitt „Schritt 3“ erwähnt.

Bakteriorhodopsin-Kristalle der Raumgruppe P21 mit Elementarzellabmessungen von a = 45,0 Å, b = 108,9 Å, c = 55,9 Å, β = 113,58° wurden durch eine Methode zur Kristallisation von Membranproteinen in „Bizellen“-Systemen in den zuvor berichteten erhalten Arbeit7. In unseren Kristallisationsexperimenten wurden Kristalle mit derselben Raumgruppe gefunden. Unter Verwendung der Peakpositionen (siehe Tabelle S4), die aus den SAXS-Daten (siehe entsprechende anfängliche und subtrahierte Daten in Abb. 5A, B) für die Kristallisationsmatrix nach der Kristallbildung erhalten wurden, berechneten wir die Elementarzellenabmessungen als a = 43,91 Å, b = 109,33 Å, c = 53,4 Å, β = 104,63°, was sich als nahe an den zuvor gemeldeten Daten erwies7 (siehe Details zur Berechnung der Elementarzellenabmessungen in „Materialien und Methoden“).

SAXS-Daten aus der Kristallisationsmatrix nach der Kristallbildung (BM29, ESRF). (A) Die SAXS-Kurve für die Kristallisationsmatrix mit Kristallen (blaue Kurve) und die entsprechende Grundlinie (rote Kurve). (B) Die SAXS-Kurve aus der Kristallisationsmatrix nach Basisliniensubtraktion (orange). Zur besseren Beobachtung der Weitwinkelspitzen wird die Intensität mit q4 multipliziert. Die Gaußschen Näherungen der Peaks sind schwarz dargestellt. Die Miller-Indizes (für BR-Kristalle) und die Reflexzahlen (für die Lipid-Multischichten Lα oder Lcryst) sind über den entsprechenden Peaks markiert (weitere Einzelheiten siehe Tabelle S4).

Es gibt einen Beugungspeak bei 63,9 ± 0,4 Å (gemittelter Wert für sieben Proben, 21 Kurven), den wir nicht den BR-Kristallen zuordnen können, da die Position dieses Beugungspeaks außerhalb der Parameter des BR-Gitterabstands liegt. Auf 2D-SAXS-Mustern wird dieser Peak als Punktreflexe dargestellt (Abb. 6A). Daher gehen wir davon aus, dass dieser Peak einer quasikristallinen Lipidphase zugeschrieben werden kann. Dieser Peak wird immer in Gegenwart lamellarer Lα-Peaks und manchmal bevor die BR-Kristalle durch Vis-Mikroskopie und SAXS beobachtet werden können, beobachtet. Seine Amplitude ändert sich gleichzeitig mit der Intensität der BR-Kristallpeaks (Abbildung S5). Die Positionen des Lcryst-Peaks und der Kristallpeaks bleiben während der Beobachtungszeit innerhalb ihrer Fehlerbalken unverändert. Der beschriebene Peak kann einen „Vorläufer“ haben: Bei mehreren Proben konnten wir einen Peak bei 68 Å registrieren (Abb. 3B und 6B), der sich dann nach mehreren Tagen auf 64 Å verschob und diese Position beibehielt. Die gleiche Position bei 68 Å wurde für mehrere Proben beobachtet, in denen wir die BR-Kristalle weder durch Vis-Mikroskopie noch durch SAXS registrierten. In diesem Fall änderte sich die Peakposition während der Beobachtungszeit (60 Tage) nicht. Das Kristallisationssystem enthält in diesen Fällen ungeformte Proteinaggregate, wie durch Vis-Mikroskopie sichtbar (siehe Abbildung S6(A, B)). Wir gehen davon aus, dass zu Beginn der Kristallbildung eine Lipid-Protein-Keimbildung stattfindet; Dieser Kern hat einen charakteristischen Abstand von 68 Å, der sich im Auftreten eines „Vorläufer“-Peaks widerspiegelt. Dann beginnt ein Kristall mit festem Gitterabstand zu wachsen, und der beobachtete Peak verschiebt sich von 68 Å auf 64 Å und ändert diese Position während des Kristallwachstums nicht mehr. Wir schlagen vor, dass der 64-Å-Peak der lokalen lateralen Lipidphase entsprechen kann, die physikalisch durch einen BR-Kristall begrenzt ist. Es ähnelt dem für die LCP-Kristallisation beschriebenen Lamellensystem17,91,92,93. Die direkte Beobachtung der lokalen lamellaren Phase bei der Kristallisation in LCP wird für BR93 und das Transmembranpeptid DAP12-M94 beschrieben. Da diese lokale Lipidphase physikalisch an den Kristall gebunden ist, ist zu erwarten, dass sie relativ zum Kristall ausgerichtet ist. Darüber hinaus sind die Ebenen der Membranen wahrscheinlich parallel zu den Ebenen von „Typ I“-Kristallen. Die Ausrichtung dieser lokalen Phase impliziert, dass der „Vorläufer“-Peak im 2D-Streuungsbild durch eine Reihe separater Beugungspeaks dargestellt wird, die in unseren Daten beobachtet werden können (siehe Abb. 6A).

Verhalten des Peaks für die lokale lamellare Phase Lcryst. (A) 2D-Muster für die Probe, die die BR-Kristalle enthält (entspricht 1D-Kurve Schritt 4.3 in Abb. 3). Die der lokalen lamellaren Phase Lcryst entsprechenden Reflexe sind durch weiße Pfeile dargestellt. Der Streuring gehört zur multilamellaren Phase Lα mit einem Abstand von etwa 84 Å. (B) Verhalten des Peaks für die lokale lamellare Phase Lcryst auf den 1D-Kurven. Alle SAXS-Kurven gehören zu unterschiedlichen Zeitpunkten derselben Probe. Die Kristallisationsbedingungen sind die gleichen wie für die Probe in Abb. 3.

Somit beginnt nach der Gleichgewichtseinstellung des Kristallisationssystems die Bildung und das Wachstum von Kristallen. In diesem Stadium sind überwiegend Bänder vorhanden, die Proteinen dabei helfen könnten, aus einer multilamellaren Phase Lα mit dem Gitterparameter 73 Å zu den Zentren der Kristallbildung zu wandern. Wir beobachteten auch die Bildung der vermutlich direkt mit der Kristalloberfläche verbundenen lamellaren Phase (Lcryst) mit dem Gitterparameter 64 Å. Diese Phase könnte es Proteinen ermöglichen, zur Kristalloberfläche zu diffundieren.

Mithilfe von SAXS untersuchten wir die strukturelle Entwicklung der Kristallisationsmatrix während der Kristallisation von Bakteriorhodopsin in der DMPC/CHAPSO-Mischung, zunächst in bizellarer Form. Wir haben gezeigt, dass die Matrix im ersten Schritt eine Mischung aus Bizellen und violetten Membranen aufweist. Daher wird das Protein zunächst nicht in die Bizellen eingebaut, im Gegensatz zu anderen Kristallisationssystemen wie LCP und Vesikeln, bei denen in einem Detergens gelöstes Protein dem LCP zugesetzt wird.

Zu Beginn der Verdunstung zeigen die SAXS-Kurven signifikante Veränderungen. Die Veränderungen werden durch eine erhöhte Salzkonzentration und die damit verbundene Erhöhung der Elektronendichte des Puffers verursacht. DMPC und CHAPSO sind jedoch immer noch zu Bizellen zusammengesetzt.

In den nächsten Schritten wandelt sich diese in Gegenwart eines Fällungsmittels und Verdunstungswassers aus der Matrix in eine Phase aus bandartigen Strukturen um. In diesem Schritt zeigen die Streukurven keine dramatischen Veränderungen und danach wird Kristallwachstum beobachtet. Die Phase ist viskos, was auf eine Verzweigung und Vernetzung der Bänder hinweisen kann. Die Verbindung der Bänder in einem kontinuierlichen Netzwerk sollte die Lieferung von Proteinmolekülen an die Keimbildungsstelle und das Kristallwachstum erleichtern.

Es ist auch möglich, dass die Bänder in einer geordneten Packung aufgereiht sind. Daher können die in der Streukurve erscheinenden nichtkristallinen Peaks als Nahordnung zwischen den Bändern interpretiert werden. Im bandförmigen Stadium wurden die vorübergehenden Peaks also in einem Kleinwinkelbereich der Kurven beobachtet (q < 0,025 Å−1). Diese Peaks entsprechen den Abstandsparametern von 270–350 Å und 500–700 Å für zwei Ordnungsrichtungen. Es gibt zwei mögliche Interpretationen dieser „500–700 Å“-Phase. Die erste Interpretation ist, dass diese Peaks den Gitterparametern 270–350 Å und 500–700 Å entsprechen und mit der Bildung einer cholesterischen Phase aus bandartigen Strukturen verbunden sein können. Die Annahme basiert auf der Tatsache, dass der Gitterparameter viel größer ist als die Bandlänge (siehe Tabelle S3). In Bezug auf die cholesterische Phase entsprechen die Gitterparameter 500–700 Å der Rotationsperiode entlang der Direktorachse (der Distanz, über die eine vollständige Drehung von 360° abgeschlossen wird), die als Pitch95 bekannt ist. Der zweite Peak mit einem Gitterparameter von 270–350 Å entspricht der Länge der Bänder, die aus der Näherung der SAXS-Kurven erhalten wurden (siehe Tabelle S3 und Abb. 2F), was auf die zusätzliche Ausrichtung der Bänder innerhalb dieses hypothetischen Cholesterins hinweisen kann Lagen. Die zweite Interpretation ist, dass diese Peaks mit Gitterparametern von 270–350 Å und 500–700 Å mit der Bildung einer Smektik aus bandartigen Strukturen verbunden sein können. Smektik zeichnet sich durch zwei Ordnungsparameter aus – zwischen den Schichten und zwischen den Elementen in einer Schicht. In unserem Fall könnten die smektischen Schichten durch die Bänder gebildet werden. Der erste smektische Peak entspricht einem Abstand von 500–700 Å zwischen den Schichten. Der zweite Peak entspricht dem Abstand zwischen den Bändern in einer Schicht von 270–350 Å. Die Bildung der nematischen Strukturen und der orientiert geordneten wurmartigen Mizellen in den DMPC/DHPC-Mischungen wurde mithilfe polarisierter optischer Mikroskopie und Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS)28,75,89 gezeigt. Die Referenz28, die sich auf die reine DMPC/DHPC-Mischung bezieht, weist auf das Auftreten eines breiten Peaks bei q ~ 0,015 Å−1 in SANS-Kurven hin. Es entspricht etwa 450 Å, was nahe an unseren Parametern liegt. Auch die Bildung der orientiert geordneten wurmartigen Mizellen in den DMPC/DHPC-Mischungen wurde mit verschiedenen Methoden gezeigt28,31,73,75,89,90.

Eine eindeutige Interpretation dieser Peaks bei 270–350 Å und 500–700 Å ist unmöglich, wenn nur SANS und SAXS verwendet werden. Wir haben festgestellt, dass bandartige Strukturen die dominierende Komponente des Kristallisationssystems sind; Es bleibt jedoch unklar, wie die Bänder verbunden sind und wie genau sie zueinander ausgerichtet sind. Um die wichtigen Daten der Phase zu verstehen, sind zusätzliche Experimente, insbesondere eine ergänzende elektronenmikroskopische Untersuchung, wünschenswert. Unabhängig von der wahren Natur dieser Peaks vermuteten wir, dass die Bildung solcher geordneter Strukturen die Proteinordnung in der Kristallisationsmatrix induzieren und die Proteinkristallisation fördern könnte.

Dann beobachteten wir eine multilamellare Phase mit einem Abstandsparameter von 73 Å. Das Auftreten und Wachstum von Kristallen wurde durch SAXS und Vis-Mikroskopie in den Schritten nachgewiesen, in denen sich auch die multilamellare Phase Lα in der Matrix bildete. Dieser Beweis unterstreicht, dass das Vorhandensein ausgedehnter lamellarer Strukturen eine wichtige Voraussetzung für das Kristallwachstum ist. Vermutlich geht diese Phase mit einem Kristallwachstum einher, das dem ähnelt, das bei LCP-gezüchteten Kristallen beobachtet wird. Es wird angenommen, dass die bandartigen Strukturen die dominierende Komponente des Systems sind, da die SAXS-Kurven eine gute Näherung durch einen Formfaktor der Bänder darstellen.

Es scheint, dass das Vorhandensein einer lokalen lamellaren Phase (Lcryst), die an die Kristalloberfläche gebunden ist, das Kristallwachstum ermöglicht. Das Vorhandensein von Lcryst zeigt sich durch das Auftreten von Beugungspeaks in unseren Streukurven. Bei der Kristallkeimbildung hat der Lcryst einen Abstand von 68 Å. Während der Bildung und des Wachstums des Kristalls sinkt dieser Parameter dann auf 64 Å und behält diesen Wert bis zum Ende der Beobachtung (60 Tage) bei. Über diese Phase kann das Protein zur Kristalloberfläche diffundieren.

Im Gegensatz zum bestehenden Paradigma zeigt unsere Studie, dass der geleeartige Zustand der „Bicelle“-Kristallisationsmatrix und nicht die anfängliche Bizelle der Zustand ist, in dem Kristalle wachsen. Wir gehen davon aus, dass diese lamellaren Strukturen miteinander verbunden sein sollten, um die Migration von Proteinen aus Doppelschichten zum Ort der Kristallbildung zu unterstützen, was notwendige Bedingungen für das Wachstum von Kristallen darstellt. Weitere Arbeiten zur Erlangung von Beweisen zur Untermauerung dieser Hypothese sind geplant.

Wichtig ist, dass bei der Kristallbildung eine kleine Menge multilamellarer Phase auftritt und ihr Volumen gleichzeitig mit dem Volumen und der Anzahl der wachsenden Kristalle zunimmt. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die lamellare Phase die Kristalle umgibt und für das Kristallwachstum entscheidend ist, wie es auch bei der LCP-Kristallisation üblich ist17,91,92,93.

Wir fassen alle verfügbaren Informationen über die Entwicklung der Kristallisationsmatrix, die in unserer Arbeit erwähnt wurden, im folgenden Schema des sequentiellen Erscheinens/Verschwindens verschiedener Strukturelemente zusammen, das in Abb. 7 dargestellt ist. Der Prozess beginnt mit einer flüssigen Phase, die eine einfache Mischung von enthält Bizellen und violette Membranen. Zunächst steigt die Konzentration an Bizellen und PMs aufgrund einer Volumenabnahme der Kristallisationsmatrix beim Trocknen (siehe Abb. S4). Dann verschmelzen die Bizellen zu Bändern; Dieser Prozess wird von der PM-Auflösung begleitet. Bänder bilden eine gelartige Phase, die den Hauptbestandteil der Kristallisationsmatrix während des Auftretens und Wachstums von BR-Kristallen darstellt. Zwischen dem Auftreten von Bändern und Kristallen treten jedoch mehrere weitere Arten von Strukturelementen auf: die lamellare Lipidphase Lα, die „Phase 500–700 Å“ und die lokale lamellare Phase Lcryst. Lα entspricht multilamellaren Lipidmembranen, die durch die Verschmelzung von Bändern entstehen. Die Menge an Lα steigt (siehe Abb. S5A) gleichzeitig mit einer langsamen Abnahme der Bandkonzentration. Bänder können sich über einen Zeitraum, der viel länger dauert als die Kristalle gewachsen sind (~ 100 Tage), vollständig in die Lα-Phase umwandeln (siehe Abb. 2G). Nach Lα wurde die „Phase 500–700 Å“ nachgewiesen. Diese hochgeordnete Struktur hat einen Gitterparameter, der der Länge von Bändern entspricht oder sogar höher ist. Laut Literatur28,31,73,75,89,90 können solche Strukturen smektischen oder cholesterischen Strukturen (chiral nematischen Strukturen) entsprechen. Die genaue Rolle dieser hochgeordneten Struktur für den Proteinkristallisationsprozess ist fraglich. Die „Phase 500–700 Å“ erscheint etwa eine Woche lang und verschwindet dann. Lcryst entspricht mehrschichtigen Membranen, die sich auf der Oberfläche von Proteinkristallen befinden und es dem Protein ermöglichen, zur Kristalloberfläche zu diffundieren. In den Proben, in denen Kristallwachstum beobachtet wurde, geht das Auftreten von Lcryst dem Auftreten von Kristallen voraus, was darauf hindeutet, dass Lcryst auch den Proteinkeimbildungszonen entspricht. Dann wächst die Intensität der I(q)-Peaks von Lcryst und von Kristallen synchron (Abb. S5(A)). Schließlich erscheinen in der Kristallisationsprobe Membranproteinkristalle.

Das Schema zeigt die Entwicklung der Kristallisationsmatrix und das sequentielle Erscheinen/Verschwinden verschiedener Strukturelemente: eine Mischung aus Bizellen und PMs, Bändern, der lamellaren Phase Lα, der „Phase 500–700 Å“, der lokalen lamellaren Phase Lcryst und BR-Kristallen (siehe ausführlichere Beschreibung im Haupttext). In Anlehnung an Katsaras et al.31 präsentieren wir die „Phase 500–700 Å“ als chiral nematisch; Die wahre Natur dieser Phase ist jedoch noch unklar. Die Achsen entsprechen Zeit, Komplexität (dh Anzahl/Quantität des neu erschienenen Strukturelements) bzw. Konzentration. Die Konzentration wird in willkürlichen Einheiten angegeben (Strukturelemente haben unterschiedliche Konzentrationsbereiche; hier wird die Konzentration der Übersichtlichkeit halber im gleichen Maßstab dargestellt; Abhängigkeiten der Konzentrationen von der Zeit werden qualitativ dargestellt).

Unsere Ergebnisse tragen dazu bei, mehr Licht in die Meso-MP-Kristallisation zu bringen, und obwohl noch Fragen offen sind, unterstützen die hier berichteten Ergebnisse nachdrücklich die Verwendung dieser Art der Kristallisation unter Verwendung eines rationalen Designs, wodurch sie erheblich effizienter wird. Dieser Ansatz könnte auch bei der effizienten Kristallisation von MPs für das strukturbasierte Arzneimitteldesign, der Entwicklung von Impfstoffen auf der Grundlage von MPs verschiedener Krankheitserreger, z. B. SARS-CoV-2, und anderen biomedizinischen Anwendungen hilfreich sein.

Lipid 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) wurde von Avanti Polar Lipids Inc. gekauft; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO), 2,5-Hexandiol und Triethylenglykol wurden von Sigma-Aldrich bezogen.

Die Protein/Bizellen-Mischung wurde gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt96. CHAPSO und DMPC wurden in einem Molverhältnis von 1:2,69 (CHAPSO:DMPC) gemischt. Das entionisierte Wasser (18,2 MΩ·cm) wurde dieser Mischung zugesetzt, um eine Endkonzentration an Bizellen von 35 % (Gew./Vol.) zu erreichen. Die Mischung wurde durch zyklisches Abkühlen auf Eis, Vortexen und kurzes Erhitzen (bei 40 °C) homogenisiert. Die vorbereitete Mischung wurde bei –20 °C gelagert.

Purpurne Membranen, die Bakteriorhodopsin (BR) enthielten, wurden wie in 97 beschrieben aus Halobium Salinarum-Zellen gereinigt und auf eine BR-Konzentration von ~ 10 mg/ml konzentriert. Gekühlte violette Membranen und eine 35 %ige Bizellenlösung wurden im Verhältnis 4:1 (v/v) gemischt, vorsichtig resuspendiert und auf Eis gelegt. Die Fällungsmittellösung wurde der Membran/Bizellen-Mischung in einem Verhältnis von 1:4 (v/v) zugesetzt, sodass die Pufferzusammensetzung der Protein/Bizellen-Mischung 0,49 M NaH2PO4, 36 mM Hexandiol, 1,26 % Triethylenglykol betrug. Die Fällungsmittellösung enthielt 2,45 M NaH2PO4, 180 mM Hexandiol, 3,5 % Triethylenglykol, pH = 3,7. Die endgültige Protein-Bizellen-Lösung wurde 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und in Kapillaren gegeben. Die endgültige Protein/Bizellen-Mischung enthielt 5,6 % Bizellen (Gesamtkonzentration DMPC + CHAPSO) und 8–9 mg/ml BR (wir untersuchten mehrere Kapillarserien).

Da Standard-Kristallisationswerkzeuge (z. B. sitzender Tropfen oder hängender Tropfen) nicht für die gleichzeitige Durchführung von Kleinwinkelexperimenten geeignet sind, haben wir ein gleichwertiges Kristallisationsverfahren in Glaskapillaren entwickelt.

Das Schema einer Kapillare ist in Abbildung S1 dargestellt. Es wurden Borosilikatglaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einer Wandstärke von 0,01 mm verwendet; die Länge der Kapillaren betrug 80 mm. Der Transfer des Kristallisationssystems (BR/Bizellen-Gemisch) in die Kapillaren erfolgte mit einer Spinalnadel mit einem Außendurchmesser von 1,1 mm und einer Länge von 90 mm. Vor dem Befüllen der Kapillare wurden alle Materialien (Kapillaren, Nadeln und Lösungen) gekühlt, um eine flüssige Konsistenz der Protein-Bizellen-Suspension sicherzustellen.

Die Protein-Bizellen-Suspension wurde am Boden der Kapillare platziert. Die Fällungsmittellösung wurde oben platziert, so dass zwischen der Protein-Bizellen-Suspension und der Fällungsmittellösung ein Luftspalt von 6–8 mm entstand. Das Ende der Kapillare wurde mit Wachs versiegelt (Abbildung S2 und Abb. 1).

Eine Charge der Kapillaren wurde bei 32 °C gelagert, die andere bei Raumtemperatur. Wir stellten fest, dass Veränderungen im Kristallisationssystem bei Raumtemperatur aufgrund einer kleinen Verdunstungsfläche, die durch den Durchmesser der Kapillare begrenzt war, sehr langsam verliefen. Daher legten wir nach 4 Wochen alle Kapillaren in eine Inkubatorbox bei 32 °C. Die Kristallisation erfolgte bei 32 °C. Das Kristallwachstum wurde mit einem Vis-Mikroskop überwacht.

Die meisten SAXS-Experimente wurden an einem Rigaku-Instrument am Moskauer Institut für Physik und Technologie (Dolgoprudny, Russland)98 durchgeführt. Das Rigaku SAXS-Instrument war mit einer Lochkamera ausgestattet, die an einen rotierenden Anoden-Röntgen-Hochflussgenerator (MicroMax 007-HF) angeschlossen war, der bei 40 kV und 30 mA (1200 W) arbeitete. Die Röntgenwellenlänge λ betrug 1,54 Å. Ein gasgefüllter Mehrdrahtdetektor Rigaku ASM DTR Triton 200 (Durchmesser der aktiven Fläche beträgt 200 mm, Pixelgröße beträgt ~ 260 μm) wurde in einem Abstand von 2,0 m von den Proben platziert (der abgedeckte q-Bereich beträgt 0,006–0,19 Å). −1) und/oder 0,5 m (0,024 Å−1 ≤ q ≤ 0,8 Å−1). Die azimutale Integration der erhaltenen 2D-Bilder wurde mit der Saxsgui-Software (Rigaku Innovative Technologies, Inc. und JJ X-ray System Aps) durchgeführt. Ein zusätzliches SAXS-Experiment zur Charakterisierung von Elementarzellen von BR-Kristallen in einer Probe wurde an der bioSAXS-Beamline BM-29 am ESRF (Grenoble, Frankreich)99 durchgeführt. Die Arbeitsenergie von BM-29 (ESRF) betrug 12,5 keV, der Versuchsstall war mit einem Marmortisch ausgestattet, der ein Flugrohr mit modularer Länge enthielt (3,5 m Abstand zwischen Probe und Detektor für dieses Experiment), einem 2D-Detektor (Pilatus 1 M ) und einem automatischen Probenwechsler, und der erreichbare q-Wertebereich betrug 0,0025–0,5 Å−1. Die Datenerfassung, -verarbeitung und die anfängliche Analyse wurden automatisiert mithilfe von BsxCuBE und der speziellen Beamline-Software innerhalb des EDNA-Frameworks durchgeführt100.

SANS-Messungen wurden zur YuMO-Zeit eines Flugspektrometers (IBR-2, Dubna, Russland) mit einem Zwei-Detektor-System101,102 durchgeführt. Die Positionen der Detektoren waren 4,5 und 13 m von den Probenpositionen entfernt. Die verwendeten Neutronenwellenlängen λ von 0,5 bis 8 Å mit dem erreichbaren q-Bereich von 0,007–0,5 Å−1. Die Verarbeitung der Rohdaten erfolgte mit dem SAS-Programm103.

Für die Neuberechnung der Elementarzellendimensionen aus SAXS-Daten wurde die folgende Quadratsumme der zugehörigen Abweichungen minimiert:

Dabei ist qexpi die Position des i-ten experimentellen Peaks, qtheor ([hkl]i) die theoretische Peakposition, die den Miller-Indizes [hkl]i entspricht, die die Peakposition am nächsten zu qexpi angeben (siehe Tabelle S4). Die theoretischen Peakpositionen für einen Kristall mit einer monoklinen Elementarzelle werden durch den folgenden Ausdruck (2) angegeben:

Für die primäre Verarbeitung der SAXS- und SANS-1D-Profile I(q) wurde das Programm Primus aus der ATSAS-Software-Suite104 verwendet. SAXS-Daten für Wasserlösungen amphiphiler Moleküle (unilamellare Liposomen, Bizellen, Nanoscheiben, Detergensmizellen und solubilisierte Membranproteine) zeigen typischerweise das Intensitätsmaximum im Bereich von 0,1–0,2 Å-1 (siehe z. B. Abb. 2A). verursacht durch starke Inhomogenitäten in der Elektronendichte (hydrophobe Teile haben normalerweise einen negativen Kontrast zum Lösungsmittel, während hydrophile Teile einen positiven Kontrast haben). Bei Studien solcher Systeme durch SAXS können Fehler und Unklarheiten auftreten, wenn Modelle mit homogenen Elektronendichteprofilen verwendet werden, was für den Membranproteinkomplex NpSRII/NpHtrII gezeigt wurde, der in einem Detergenz gelöst wurde105,106. Daher erfordert die korrekte Interpretation der SAXS-Daten solcher Systeme Modelle mit unterschiedlichen Streulängendichten für verschiedene Teile der untersuchten Objekte (im Fall von Bizellen – ein Detergensgürtel, hydrophile Köpfe und hydrophobe Schwänze der Lipiddoppelschicht). Zu diesem Zweck wurden zwei Modelle verwendet.

Modell 1 (für die Bizellen verwendet) ist ein kreisförmiger Zylinder mit einem Kern-Schale-Streulängendichteprofil (siehe Abb. 8A, wir haben ein Plugin-Modell verwendet, das auf dem SasView-Modell des Zylinders und der core_shell_bicelle basiert). In Übereinstimmung mit den zuvor gemeldeten Daten für das 3S-Modell der DMPC-Doppelschicht107 (das analog zu unserem Fall ist) konnte die Dicke dieses Kerns (Htail) auf einen Wert von 28,8 Å festgelegt werden; In Übereinstimmung mit der bekannten Fläche pro Lipid, AL = 61,8 Å2, konnte die SLD des hydrophoben Kerns (ρtail) berechnet und festgelegt werden (siehe Tabelle S3). Der kleinere Radius des Kernzylinders beträgt R, das Verhältnis von großem zu kleinem Radius ε = 1. Die Kernflächen entsprechen den hydrophilen Polköpfen von DMPC und den an die Polköpfe gebundenen Wassermolekülen. Die Dicke dieser Deckschicht (Hhead) ist ein Anpassungsparameter. Wir gingen davon aus, dass der Gürtel des Zylinders durch CHAPSO gebildet wird. In Übereinstimmung mit dem Atommodell des CHAPSO-Moleküls108 wurde die Gürteldicke ΔR in unseren Berechnungen auf den Wert 11,4 Å festgelegt.

Zur Approximation der SAS-Daten verwendete Modelle. (A) Modell 1: Kreiszylinder mit einem Kern-Schale-Streulängendichteprofil (in unseren Berechnungen haben wir ε = 1 für die Bizellen verwendet). (B) Modell 2: Elliptischer Zylinder mit einem Kern-Schale-Streulängendichteprofil.

Modell 2 (für die Bänder verwendet) ist ein elliptischer Zylinder mit einem Kern-Schale-Streulängendichteprofil (siehe Abb. 8B, wir haben ein Plugin-Modell verwendet, das auf zwei SasView-Modellen aus der Kategorie „Zylinder“ basiert: einem core_shell_zylinder und einem elliptischen_Zylinder). .

Die Anpassung der SAS-Kurven an die Modelle von Bizellen und Bändern erfolgte mit dem Programm SasView 4.2.2109. Die Optimierung der Strukturparameter in den genannten Modellen erfolgte durch Minimierung des folgenden Ausdrucks:

wobei Nexp und Nparam die Nummern der experimentellen Punkte bzw. der angepassten Parameter sind; (qi, Ii, σi) ist ein Satz der experimentellen SAS-Daten. Gleichungen (4–7) für die Modellkurve Imodel(qi) sind im Textdokument S1 angegeben.

Die Berechnungen wurden unter der Annahme durchgeführt, dass der Strukturfaktor vernachlässigt werden kann (S(q) = 1). Obwohl die Probenkonzentrationen hoch sind (5,6–14 %) und ein gewisser Einfluss des Strukturfaktors auf die Streukurve unvermeidbar ist, ist dieser Einfluss für die Bestimmung des Objekttyps, insbesondere für die Unterscheidung der Bizellen, nicht so entscheidend und die Bänder, was in der Arbeit demonstriert wurde (19). Die bei der Montage ermittelten Strukturparameter können jedoch von den tatsächlichen abweichen. Tatsächlich gibt es keine Möglichkeit, S(q) korrekt zu berücksichtigen, da es keine geeigneten theoretischen Modelle gibt. Es ist eine große Herausforderung, die Wirkung des Strukturfaktors bei niedrigeren Konzentrationen durch Verdünnung und Befolgung der SAXS-Experimente zu berücksichtigen, da die Struktur der untersuchten Objekte von der Konzentration abhängt und sich mit der Zeit ändert. Experimente mit anderen Probenkonzentrationen erlauben es daher nicht, Informationen über die Zustände des Systems zu erhalten, die in realen Experimenten zur Membranproteinkristallisation auftreten und in dieser Arbeit untersucht werden.

Daten, die die Ergebnisse dieses Manuskripts stützen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken den Mitarbeitern von ESRF und EMBL-Grenoble für ihre Unterstützung und Unterstützung bei der Nutzung der Strahllinie BM29. Wir danken dem Frank Laboratory of Neutron Physics (FLNP), JINR in Dubna (Russland), für die Gewährung des Zugangs zum Kleinwinkel-Neutronenstreuspektrometer YuMO (IBR-2).

TNM erkennt die Gewährung des rumänischen Bevollmächtigten im JINR im Rahmen des JINR-Themas 04-4-1142-2021/2025 (Nr. 367/11.05.2021 Punkt 17) an. Yu.LR und AVV danken dem Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation für die Unterstützung (Vereinbarung 075-03-2022-107, Projekt FSMG-2021–0002). AVR dankt dem Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation (Vereinbarung Nr. 075-00958-21-05, Projekt Nr. 730000F.99.1.BV10AA00006). Die Proteinkristallisationsmethoden wurden im Rahmen der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (Projektnummer 19-29-12022) entwickelt. Die Verarbeitung der SAXS/SANS-Daten wurde von der Russian Science Foundation unterstützt (Projektnummer 21-64-00018).

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Tatiana N. Murugova, Oleksandr I. Ivankov und Yury L. Ryzhykau.

Frank Laboratory of Neutron Physics, Joint Institute for Nuclear Research, 141980, Dubna, Russland

Tatiana N. Murugova, Oleksandr I. Ivankov, Yury L. Ryzhykau, Dmytro V. Soloviov, Daria V. Skachkova, Andrey V. Rogachev, Alexey V. Vlasov und Alexander I. Kuklin

Forschungszentrum für Mechanismen des Alterns und altersbedingte Krankheiten, Moskauer Institut für Physik und Technologie, 141700, Dolgoprudny, Russland

Tatiana N. Murugova, Yury L. Ryzhykau, Dmytro V. Soloviov, Andrii V. Ishchenko, Andrey V. Rogachev, Alexey V. Vlasov und Alexander I. Kuklin

Taras-Schewtschenko-Nationaluniversität, Kiew, 01033, Ukraine

Oleksandr I. Iwankow

Institut für Sicherheitsprobleme von Kernkraftwerken der Ukrainischen NAS, Kiew, 03028, Ukraine

Oleksandr I. Ivankov und Dmytro V. Soloviov

EMBL Hamburg Outstation, 22607, Hamburg, Deutschland

Kirill V. Kovalev

Zuvor bei EMBL-Grenoble Outstation, 38000, Grenoble, Frankreich

Adam Round

Einzelpartikel, Cluster und Biomoleküle sowie serielles Femtosekundenkristallographie-Instrument (SPB/SFX), European XFEL GmbH, 22869, Schenefeld, Deutschland

Adam Round

Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich, 52425, Jülich, Germany

Christian Baeken & Oleksandr A. Volkov

JuStruct: Jülich Center for Structural Biology, Forschungszentrum Jülich, 52428, Jülich, Germany

Christian Baeken & Oleksandr A. Volkov

Institut für Strukturbiologie Jean-Pierre Ebel, Universität Grenoble Alpes – Kommissariat für Atomenergie und alternative Energien – CNRS, 38027, Grenoble, Frankreich

Valentin I. Gordely

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TNM, OII und YLR leisteten gleichermaßen Beiträge und jeder von ihnen hat das Recht, sich in bibliografischen Dokumenten an erster Stelle aufzuführen. Konzeptualisierung: VIG, AIK; Versuchsdesign: VIG, AIK, TNM, OII, AVI, OAV, AVR; Datenerfassung: TNM, OII, Dm.VS, Da.VS, AR, AIK; Datenanalyse und Interpretation: TNM, OII, YLR, Da.VS, VIG, AIK; PM-Extraktion: CB; Betreuung: VIG, AIK; Schreiben – Originalentwurf: TNM, OII, YLR, KVK, AVV, AVI, AIK, VIG; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: AR, VIG, AIK

Korrespondenz mit Tatiana N. Murugova, Alexander I. Kuklin oder Valentin I. Gordeliy.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Murugova, TN, Ivankov, OI, Ryzhykau, YL et al. Mechanismen der Membranproteinkristallisation in „Bizellen“. Sci Rep 12, 11109 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0

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Eingegangen: 01. März 2022

Angenommen: 31. Mai 2022

Veröffentlicht: 30. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0

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