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May 28, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 708 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ultralang wirkende Verabreichungsplattformen für die HIV-Präexpositionsprophylaxe (PrEP) können die Therapietreue erhöhen und den Nutzen für die öffentliche Gesundheit maximieren. Wir berichten über ein injizierbares, biologisch abbaubares und entfernbares in-situ-formendes Implantat (ISFI), das subkutan verabreicht wird und den Integrase-Inhibitor Cabotegravir (CAB) für mehr als 6 Monate über den Schutzmaßstäben hinaus freisetzen kann. CAB-ISFIs werden von weiblichen Mäusen und weiblichen Makaken gut vertragen und zeigen keine Anzeichen von Toxizität oder chronischer Entzündung. Bei Makaken übertreffen die mittleren CAB-Plasmakonzentrationen innerhalb von 3 Wochen die etablierten PrEP-Schutzrichtwerte und bieten vollständigen Schutz vor wiederholten rektalen SHIV-Provokationen. Die Implantatentfernung über einen kleinen Einschnitt bei 2 Makaken in Woche 12 führt zu einem 7- bis 48-fachen Rückgang der Plasma-CAB-Spiegel innerhalb von 72 Stunden. Eine Modellierung zur Übersetzung der CAB-ISFI-Dosierung legt nahe, dass eine 3-ml-Injektion die Schutzmaßstäbe beim Menschen für mehr als 5 Monate nach der Verabreichung überschreiten würde. Unsere Ergebnisse unterstützen den klinischen Fortschritt von CAB-ISFIs für ultralang wirkende PrEP beim Menschen.

Im Jahr 2021 leben derzeit 38,4 Millionen Menschen mit HIV und seit Beginn der Epidemie sind weltweit 40,1 Millionen Menschen an AIDS-bedingten Krankheiten gestorben1. Die Präexpositionsprophylaxe (PrEP) mit täglichen oralen Therapien, die Emtricitabin (FTC) in Kombination mit Tenofovirdisoproxilfumarat (TDF) oder Tenofoviralafenamid enthalten, hat sich bei hoher Therapietreue als äußerst wirksam bei der Verhinderung einer HIV-Infektion erwiesen2,3. Obwohl eine hohe Adhärenz zu einer hohen PrEP-Wirksamkeit führt, bleibt die Aufrechterhaltung einer hohen Adhärenz bei der täglichen oralen PrEP eine große Herausforderung4–6. Eine geringe Adhärenz und eine anschließende Infektion können auch zur Entwicklung arzneimittelresistenter Viren führen7. Darüber hinaus ist die Adhärenz vor allem bei jungen afrikanischen Frauen südlich der Sahara aufgrund der hohen Stigmatisierung, der geringen Produktakzeptanz und/oder der Unfähigkeit, die Produktnutzung gegenüber ihren Sexualpartnern offenzulegen, gering.5 Die Linderung von Adhärenzproblemen in Afrika südlich der Sahara, insbesondere bei Frauen, ist der Schlüssel zum Erfolg von PrEP, da Afrika südlich der Sahara über 60 % aller neuen HIV-Infektionen weltweit ausmacht1,5. Zu diesem Zweck geht die Pipeline für Optionen zur HIV-Prävention in Richtung der Entwicklung langwirksamer (LA) PrEP-Produkte, die keine häufige Dosierung erfordern und möglicherweise einige der mit der täglichen oralen PrEP verbundenen Herausforderungen bei der Einhaltung lösen. Tatsächlich haben Studien gezeigt, dass langwirksame Produkte eine größere Adhärenz und Akzeptanz gegenüber der täglichen oralen Einnahme haben5,8,9,10,11, insbesondere in Bevölkerungsgruppen, in denen die HIV-Prävalenz am höchsten ist. Somit kann eine erhöhte PrEP-Adhärenz und Akzeptanz einer langwirksamen HIV-PrEP letztendlich die HIV-Übertragungsraten senken.

Eine injizierbare, langwirksame Formulierung des Integrasehemmers Cabotegravir (CAB LA) wurde Ende 2021 von der FDA für PrEP bei Männern und Frauen zugelassen12. Die Zulassung von CAB LA folgte den Ergebnissen der HPTN 083- und 084-Studien, die zeigten, dass CAB LA sicher und wirksamer war als täglich orales FTC/TDF, was wahrscheinlich den Adhärenzvorteil von langwirksamem PrEP widerspiegelt13,14,15. In den Studien wurde außerdem festgelegt, dass die für den Schutz erforderlichen Plasma-CAB-Konzentrationen viermal über der proteinbereinigten 90-prozentigen Hemmkonzentration liegen (4× PA-IC90, 664 ng/ml16). CAB LA wird zunächst 2 Monate lang jeden Monat und danach alle zwei Monate in intramuskulären Injektionen von 3 ml verabreicht. Obwohl CAB LA einen großen Fortschritt in der HIV-PrEP und -Behandlung darstellt, sind die großen Injektionsvolumina (3 ml/Injektion), Reaktionen an der Injektionsstelle14,17 und die Unfähigkeit, es selbst zu verabreichen oder zu entfernen, um die Behandlung bei Bedarf zu beenden, noch zu bewältigende Herausforderungen angesprochen. Darüber hinaus weist CAB LA aufgrund seiner langen terminalen Halbwertszeit (>40 Tage)16 und der Unfähigkeit, nach der Verabreichung entfernt zu werden, einen langen pharmakologischen Schwanz mit geringen, aber nachweisbaren CAB-Spiegeln auf, die über 15 Monate nach Absetzen der Behandlung im Plasma verbleiben18 ,19. Diese suboptimalen CAB-Spiegel können zu Durchbruchinfektionen und der Entwicklung arzneimittelresistenter HIV-Infektionen führen und erfordern daher eine zusätzliche orale PrEP zur Abdeckung des Schwanzes, um zukünftige Infektionen zu verhindern19. Um diese Einschränkungen zu überwinden, verlagern sich die Bemühungen nun auf die Entwicklung von entfernbaren, selbst zu verabreichenden (z. B. subkutanen Verabreichung) CAB-Formulierungen mit ultralanger Wirkung, die schützende Plasma-CAB-Spiegel über längere Dosierungsintervalle, beispielsweise alle 6 Monate oder länger, aufrechterhalten. Solche Formulierungen können die Umsetzung in großem Maßstab erleichtern und die Kostenwirksamkeit sowie den Nutzen für die öffentliche Gesundheit sowohl in ressourcenarmen als auch in reichen Ländern maximieren.

In-situ-bildende Implantate (ISFIs) können wünschenswerte Eigenschaften für eine CAB-Formulierung mit extrem langer Wirkung bieten, einschließlich langer Dosierungsintervalle, kleiner Injektionsvolumina und Rückholbarkeit20,21. ISFIs bestehen aus einem hydrophoben und biologisch abbaubaren Polymer (z. B. Poly(milch-co-glykolsäure) (PLGA)), biokompatiblen wassermischbaren organischen Lösungsmitteln (z. B. N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) oder Dimethylsulfoxid (DMSO)) ) und pharmazeutische Wirkstoffe (APIs)22,23,24, die gemeinsam formuliert werden, um eine homogene und spritzbare flüssige Lösung oder Suspension zu erzeugen. Bei der Injektion in den intramuskulären oder subkutanen Raum diffundiert das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel in die wässrige Umgebung, was zu einer Phaseninversion führt und ein festes oder halbfestes Depot erzeugt, das den Wirkstoff enthält, der in der ausgefällten Polymermatrix eingeschlossen ist23,24,25,26. Wirkstoffe werden aus dem Depot durch Diffusion durch die Polymermatrix und durch den Abbau der Polymermasse im Laufe der Zeit freigesetzt.

Mit PLGA und NMP formulierte ISFIs wurden eingehend auf die langwirksame Freisetzung von Dolutegravir (DTG), einem HIV-Integrase-Inhibitor-Analogon von CAB20,21, untersucht. Bei NOD-Scid-Common-Gamma-Chain-Knockout-Mäusen und Knochenmark-Leber-Thymus (BLT)-Mäusen setzten ISFIs DTG über 11 Monate lang in Konzentrationen frei, die 10–100-fach über dem PA-IC90 lagen. Diese Werte waren mit einem hohen Schutz vor mehreren hochdosierten vaginalen HIV-Provokationen und einer Unterdrückung der Virämie bei infizierten Mäusen verbunden20,21. Obwohl eine Entfernung des Implantats aufgrund der biologischen Abbaubarkeit von PLGA nicht erforderlich ist, zeigte die Studie außerdem, dass das Depot leicht über einen kleinen Hautschnitt entnommen werden kann. Nach der Entfernung fielen die DTG-Spiegel im Plasma innerhalb von 24 Stunden unter den PA-IC90-Wert und nach 7 Tagen unter die Nachweisgrenze20. Insgesamt verdeutlichten diese Beobachtungen das Potenzial von ISFIs als neuartiges, ultralang wirkendes Abgabesystem und unterstützten die erweiterte Bewertung von ISFIs, die CAB abgeben.

Hier haben wir eine CAB-ISFI-Formulierung mit hoher Wirkstoffbeladung entwickelt und charakterisiert, die für die subkutane Verabreichung in kleinen Mengen geeignet ist. Wir haben Stabilität, Mikrostruktur, Injizierbarkeit und Freisetzungskinetik in vitro und in vivo definiert. Wir zeigen, dass diese Formulierung bei weiblichen Mäusen und nichtmenschlichen Primaten sicher ist und CAB 6–11 Monate lang in Mengen freisetzen kann, die über den etablierten Benchmarks für den PrEP-Schutz bei Makaken und Menschen liegen. Wir verbinden die verlängerte Freisetzung von CAB aus dem ISFI mit einem langanhaltenden Schutz vor einer SHIV-Infektion in einem Makaken-PrEP-Modell, das die klinische Wirksamkeit von CAB LA und anderen zugelassenen oralen PrEP-Therapien vorhersagte. Unsere Studie identifiziert eine vielversprechende Plattform für die verlängerte Freisetzung von CAB in Mengen, die bekanntermaßen mit dem PrEP-Schutz beim Menschen verbunden sind.

Viele Faktoren beeinflussen die Arzneimittelfreisetzungskinetik aus ISFIs, einschließlich Polymertyp und Molekulargewicht (MW), Lösungsmittel, Polymer-zu-Lösungsmittel-Verhältnis, Mischbarkeit des Arzneimittels und Polymers mit dem Lösungsmittel sowie physiochemische Eigenschaften des Arzneimittels20,24,27. Hier untersuchten wir die Wirkung von Lösungsmitteln, Wirkstoffbeladung, Polymermolekulargewicht und Polymer-zu-Lösungsmittel-Verhältnissen, um einen ISFI mit maximaler CAB-Beladung und hohen In-vitro-Freisetzungsraten zu entwickeln. Zunächst untersuchten wir die CAB-Sättigungslöslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln, um das ideale Lösungsmittelsystem für die Formulierung zu bestimmen, um eine maximale Wirkstoffbeladung zu erreichen (Ergänzungstabelle 1). NMP und DMSO sind wassermischbare organische Lösungsmittel, die üblicherweise in ISFI-Formulierungen24 verwendet werden. Daher wurden diese Lösungsmittel in verschiedenen Gewichtsverhältnissen getestet. Der Zusatz von Hilfsstoffen wie Tween 20, Pluronics und Gelucire wurde ebenfalls untersucht, da diese die Wasserlöslichkeit von schwer unlöslichen Arzneimitteln verbessern können28. Basierend auf der CAB-Löslichkeit in diesen verschiedenen Lösungsmitteln zeigte ein Gewichtsverhältnis von 1:1 (w/w) von NMP:DMSO (als „Lösungsmittel“ bezeichnet) die höchste CAB-Löslichkeit (Sättigungslöslichkeit von 167,12 ± 12,04 mg/ml). Daher wird CAB als stabile ISFI-Suspension oberhalb dieser Sättigungslöslichkeit formuliert.

Während der Optimierung und aufbauend auf unserer vorherigen Arbeit wurden alle CAB-ISFI-Formulierungen unter Verwendung eines von der FDA zugelassenen biologisch abbaubaren Polymers erstellt, das zu 50:50 aus PLGA besteht, das eine extrem lange Freisetzung antiretroviraler Wirkstoffe aus ISFIs20,21,29 ermöglicht und ein günstiges Abbauprofil aufweist was innerhalb weniger Monate zu einem vollständigen Abbau führt30,31. Dieses Abbauprofil ist ideal, um vor nachfolgenden ISFI-Injektionen einen vollständigen Polymerabbau sicherzustellen und so eine Polymeransammlung zu verhindern. Darüber hinaus bestanden alle Formulierungen aus 50:50 PLGA mit niedrigen MWs von 10 kDa oder 27 kDa, da PLGAs mit niedrigeren MWs eine höhere Arzneimittelbeladung aufnehmen können, eine stärkere Arzneimittelfreisetzung hervorrufen und eine niedrigere Viskosität aufweisen, um die Spritzbarkeit31 im Vergleich zu PLGAs mit höheren MWs zu gewährleisten Wird in ISFI-Systemen verwendet24,32,33.

Kumulative In-vitro-Freisetzungsstudien von sieben CAB-ISFI-Formulierungen wurden 35 Tage lang ausgewertet (Abb. 1a), um die Auswirkung der Wirkstoffbeladung, des PLGA-MW und der Polymer-zu-Lösungsmittel-Verhältnisse zu untersuchen und die optimale Formulierung mit der höchsten Wirkstoffbeladung und -freisetzung zu bestimmen Tarife (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). Die Ergebnisse zeigten, dass die CAB-Freisetzungsraten zunahmen, wenn (1) die Wirkstoffbeladung zunahm (Abb. 1b), (2) die Lösungsmittelmenge zunahm und (3) das MW von PLGA abnahm (Abb. 1c). Alle Formulierungen zeigten eine sehr geringe stoßartige Freisetzung (<3 % Freisetzung innerhalb von 24 Stunden), eine anhaltende Freisetzung über einen Monat und eine voraussichtliche Freisetzung über mehr als 6 Monate in vitro (Abb. 1d). ISFIs mit 349 mg/ml CAB (1:4 w/w PLGA (27 kDa):Lösungsmittel) (Formulierung 4), 500 mg/ml CAB (1:4 w/w PLGA (27 kDa):Lösungsmittel) (Formulierung 5). ) und 500 mg/ml CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):Lösungsmittel) (Formulierung 7) zeigten in den ersten 35 Tagen eine Freisetzungskinetik nullter Ordnung. Darüber hinaus war die CAB-Freisetzung bei Variation der Arzneimittelbeladung (Abb. 1b) und des PLGA-MW (Abb. 1c) signifikant unterschiedlich (p < 0,05). Insbesondere ISFIs, die 500 mg/ml CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):Lösungsmittel) (Formulierung 7) und 500 mg/ml (1:4 w/w PLGA (27 kDa):Lösungsmittel) (Formulierung) enthalten 5) zeigten trotz Unterschieden im PLGA-MW eine vergleichbare Freisetzungskinetik (p > 0,05).

eine kumulative Veröffentlichung von CAB ISFI-Formulierungen. b Auswirkung der Arzneimittelbeladung auf die kumulative CAB-Freisetzung. c Einfluss des PLGA-Molekulargewichts auf die kumulative CAB-Freisetzung. Alle In-vitro-Freisetzungsstudien wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 mit 2 % Solutol) bei 37 °C durchgeführt. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung für n = 3 Proben dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Statistische Analyse: Zwei-Wege-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey, der die Menge der Arzneimittelfreisetzung in Bezug auf Formulierung und Zeitpunkt in b und c vergleicht. *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 und ns (nicht signifikant), wenn p > 0,05. d Zusammenfassende Tabelle der Freisetzungskinetik für CAB ISFI-Formulierungen. Lösungsmittel = 1:1 (w/w) NMP:DMSO.

Ähnliche Freisetzungsraten zwischen Formulierung 5 und 7 sind wahrscheinlich auf die beträchtlich hohe Wirkstoffbeladung in den Formulierungen (500 mg/ml CAB) zurückzuführen, die das CAB-Freisetzungsprofil bestimmt, unabhängig von Unterschieden im PLGA-MW. In beiden Formulierungen beträgt das Verhältnis von PLGA zu CAB (Gew./Gew.) 1:3,5 Gew./Gew. (41,2 % CAB und 11,8 % PLGA). Somit hatte der Unterschied des PLGA-MWs in den Formulierungen 5 und 7 keinen so großen Einfluss auf die CAB-Freisetzung im Vergleich zu anderen Formulierungen mit unterschiedlichen PLGA-MWs, wie z. B. Formulierung 3 und 6 (PLGA-zu-CAB-Verhältnis von 1:0,75 w/w). ).

Basierend auf ähnlichen und vielversprechenden Wirkstofffreisetzungsprofilen der Formulierungen 5 und 7 wurde die In-vitro-Freisetzung für diese Formulierungen auf 180 Tage verlängert (ergänzende Abbildung 2a). Obwohl wir nach ca. 2 Monaten eine höhere In-vitro-Freisetzung von CAB aus Formulierung 5 im Vergleich zu Formulierung 7 beobachteten, zeigte eine Pilotstudie mit Mäusen bis zu 90 Tage lang keinen Unterschied in den CAB-Konzentrationen im Plasma zwischen den beiden Formulierungen (ergänzende Abbildung 2b). Formulierung 7 wurde aufgrund ihres geringeren PLGA-MW (10 kDa) für nachfolgende Studien ausgewählt. Das niedrigere PLGA-MW führte zu einer niedrigeren Viskosität (Ergänzungstabelle 2) und gewährleistete die Spritzbarkeit. Darüber hinaus wird erwartet, dass das 10-kDa-PLGA (Formulierung 7) im Vergleich zum 27-kDa-PLGA (Formulierung 5) schneller abgebaut wird und wurde ausgewählt, um einen vollständigen Polymerabbau sicherzustellen und die Polymerbildung bei nachfolgenden Dosen zu mildern24,32,33.

Letztendlich wurde das 500 mg/ml CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):Lösungsmittel) ISFI (Formulierung 7) (als CAB ISFI bezeichnet) aufgrund seiner hohen Wirkstoffbeladung und hohen Konzentration als optimierte Formulierung ausgewählt Die Freisetzungsrate wurde in vitro bestimmt und anhand der Depot-Mikrostruktur weiter charakterisiert. Es ist bekannt, dass die Kinetik der Arzneimittelfreisetzung durch die Mikrostruktur des Depots beeinflusst wird, die außerdem durch das Polymer, das Lösungsmittel, die physiochemischen Eigenschaften des Arzneimittels und die Mischbarkeit des Arzneimittels mit dem Lösungsmittel beeinflusst wird20,24. Wie in der ergänzenden Abbildung 3 gezeigt, wurde die CAB-ISFI-Mikrostruktur mit Rasterelektronenmikroskopie (REM) qualitativ analysiert und bildete ein dicht gepacktes Depot mit CAB-Kristallen. Die Mikrostruktur blieb über 90 Tage Inkubationszeit unverändert, ohne erkennbare Porenbildung in der ISFI-Mikrostruktur Freisetzungsmedien in vitro. Darüber hinaus führten wir eine rasterelektronenmikroskopische energiedispersive Röntgenanalyse (SEM EDX) an CAB-ISFI und Placebo-ISFI (CAB-frei) durch, um die in REM-Bildern sichtbaren CAB-Kristalle zu bestätigen (ergänzende Abbildung 4). Die SEM-EDX-Ergebnisse zeigten das Fehlen von Kristallen im Placebo-ISFI, und anhand der Elementaranalyse wurde bestätigt, dass die Kristalle im CAB-ISFI aus CAB bestanden (Vorhandensein von Fluorgruppen, ergänzende Abbildung 4). Letztendlich bestätigen diese Ergebnisse die In-vitro- und In-vivo-Freisetzungskinetik von CAB über 90 Tage.

Um die Haltbarkeit des optimierten CAB ISFI zu bestimmen, führten wir Stabilitätsstudien bei zwei Lagerbedingungen (40 °C/75 % relative Luftfeuchtigkeit (RH) und 4 °C) für 30 und 90 Tage durch, gefolgt von einer Analyse der Freisetzung nach der Lagerung in vitro. Die Stabilität wurde anhand des physikalischen Erscheinungsbilds (Farbe, Viskosität, Phasentrennung) der ISFI-Formulierung sowie der Arzneimittelstabilität und -konzentration nach der Lagerung bestimmt.

Nach 30 Tagen bei 4 °C oder 40 °C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit und 90 Tagen bei 4 °C zeigte die CAB ISFI-Formulierung keinen visuellen Unterschied im physikalischen Erscheinungsbild (Farbe, Spritzbarkeit, Phasentrennung). Die Arzneimittelkonzentration war mit der Anfangskonzentration (t = 0) vergleichbar (<5 % Unterschied), wobei durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) keine Arzneimittelabbauspitzen beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 5a). Die Formulierung war nach 90 Tagen bei 40 ° C und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit weder injizierbar noch homogen (ergänzende Abbildung 5b), was die Analyse der Freisetzungskinetik nach der Lagerung ausschloss.

Abbildung 2a und b zeigen die In-vitro-Freisetzungskinetiken nach der Lagerung, die nach 30 Tagen bei 4 °C oder 40 °C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit und nach 90 Tagen bei 4 °C erhalten wurden. Unabhängig von den Lagerbedingungen war die CAB-Freisetzung nach der Lagerung langsamer und unterschied sich signifikant (p < 0,05) im Vergleich zur Formulierung zu Studienbeginn (t = 0). Insbesondere unterschied sich die In-vitro-Freisetzung von CAB bei Lagerung bei 40 °C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit und 4 °C im Vergleich zum Ausgangswert nach 7 Tagen (p = 0,0042) bzw. 21 Tagen (p = 0,0004) deutlich. Letztendlich unterschieden sich alle Formulierungen signifikant (p < 0,0001) im Vergleich zum Ausgangswert nach 90 Tagen In-vitro-Freisetzung (Abb. 2a).

a Kumulative In-vitro-Freisetzungskinetik von CAB ISFI (500 mg/ml CAB (1:4 w/w PLGA (10 kDa):Lösungsmittel)) zu Studienbeginn (t = 0), 30 Tage und 90 Tage nach der Lagerung bei 4 °C und 40 °C/75 % relative Luftfeuchtigkeit. Alle In-vitro-Freisetzungsstudien wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 mit 2 % Solutol) bei 37 °C durchgeführt. Die Daten werden als Durchschnitt ± Standardabweichung für n = 3 Proben dargestellt. Statistische Analyse: Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichen zum Vergleich der CAB-Freisetzung in Bezug auf Formulierung und Zeitpunkt. Am Tag 90 nach der In-vitro-Freisetzung nach der Lagerung lösten alle Lagerungsformulierungen eine CAB-Freisetzung aus, die deutlich anders und langsamer als der Ausgangswert war (p < 0,0001). b Zusammenfassende Tabelle der CAB-ISFI-Freisetzungskinetik nach der Lagerung in vitro aus a. c Einfluss der Lagerbedingungen auf das PLGA-Gewichtsmittel MW von Placeboformulierungen, gemessen durch Gelpermeationschromatographie (GPC)-Analyse. d Übersichtstabelle zum PLGA-Abbau in der Placebo-Formulierung nach 30 und 90 Tagen bei 4 °C und 40 °C/75 % relative Luftfeuchtigkeit. Lösungsmittel = 1:1 w/w NMP:DMSO. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Diese Abnahme der Freisetzungskinetik wurde wahrscheinlich durch die PLGA-Hydrolyse unter Stabilitätslagerungsbedingungen beeinflusst. PLGA-Abbaustoffe können während der Hydrolyse24 kristallisieren, was zu einem kristallineren Polymernetzwerk führt, das die Arzneimittelfreisetzung verlangsamen kann. Um den Abbau zu bestätigen, zeigte die Gelpermeationschromatographie (GPC)-Analyse der Placebo-ISFI-Formulierung (1:4 Gew./Gew. PLGA (10 kDa):Lösungsmittel) einen Rückgang des MW um 2,3 % bei Lagerung bei 4 °C und einen Rückgang um 36,1 % MW bei Lagerung bei 40 °C/75 % RH für 90 Tage (Abb. 2c und d) relativ zum anfänglichen PLGA-MW (t = 0). Zusätzlich wurde der pH-Wert der Placeboformulierung vor und nach der Lagerung gemessen. Zu Beginn und nach 90 Tagen Lagerung bei 4 °C war der pH-Wert der Placebo-Formulierung neutral (pH = 6–7), wohingegen der pH-Wert nach 90 Tagen Lagerung bei 40 °C/75 saurer wurde (pH = 4). % RH, was den Abbau von PLGA zu seinen sauren Nebenprodukten weiter bestätigt, insbesondere nach Lagerung bei 40 °C/75 % RH. Insgesamt war CAB ISFI bei Lagerung bei 4 °C stabiler, was sich in einem minimalen PLGA-Abbau (2,3 %) und der Fähigkeit, die Injektionsfähigkeit und Homogenität der Formulierung nach 90 Tagen beizubehalten, widerspiegelt.

Eine In-vivo-Sicherheitsstudie von CAB ISFI wurde mit weiblichen BALB/c-Mäusen durchgeführt, um lokale und systemische Entzündungen nach der Injektion im Vergleich zu Kontrollmäusen zu beurteilen, die keine Behandlung oder Injektion erhielten. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass das CAB ISFI gut vertragen wurde und die Mäuse keine Anzeichen offener Toxizität, Verhaltensänderungen oder Gewichtsverlust zeigten (ergänzende Abbildung 6). Die histopathologische Analyse des herausgeschnittenen Implantats und des umgebenden subkutanen Gewebes zeigte, dass der CAB ISFI eine leichte bis mittelschwere lokale Entzündung aufwies, die durch infiltrierte Immunzellen rund um das Depot sichtbar wurde (Abb. 3a). Am 3. und 7. Tag lag der mittlere Hautmikroskopie-Entzündungswert bei 3 (mäßige Entzündung), wahrscheinlich aufgrund der anfänglichen Immunantwort auf die Injektion, und nahm bis zum 30. Tag bei 2 der 3 getesteten Mäuse ab (Abb. 3b).

a Lokale Entzündung herausgeschnittener Depots und umgebender subkutaner Gewebe, die am Tag 3, 7 und 30 nach der Injektion gesammelt wurden (n = 3/Zeitpunkt für CAB ISFI-behandelte Mäuse und n = 1/Zeitpunkt für Kontrollmäuse (ohne Injektion)) und mit gefärbt ER. Sternchen weisen auf ein CAB-Implantat hin. Pfeile zeigen infiltrierte Immunzellen und Entzündungsbereiche an. Alle Maßstabsbalken repräsentieren 1 mm. b Entzündungsbewertung des das Depot umgebenden subkutanen Gewebes, bewertet mit einem Lichtmikroskop und blind bewertet durch einen zertifizierten Pathologen. Schwarze Balken stellen den mittleren Entzündungswert zu jedem Zeitpunkt dar (n = 3 pro Zeitpunkt). Entzündungsbewertung: 0: Entzündungszellen innerhalb der erwarteten Grenzen vorhanden; 1: minimale Entzündung, wenige vermehrte, verstreute Immunzellen vorhanden; 2: leichte Entzündung, kleine Ansammlungen von Immunzellen an dünnen oder lokalisierten Entzündungsspuren oder leichter Anstieg der Anzahl der Zellen, die das Depot diffus umgeben; 3, mäßige, dickere oder mehrere Entzündungsspuren oder mäßige Anzahl von Zellen, die das Depot diffus umgeben; 4, schwere, verschmelzende Entzündungsspuren, die groß genug sind, um die normale Gewebearchitektur zu ersetzen, oder eine große Anzahl von Zellen, die das Depot diffus umgeben; 5, ausgeprägte Entzündung, die ausgedehnte Bereiche der normalen Gewebearchitektur ersetzt. c Konzentration von TNF-α (pg/ml) im Plasma, quantifiziert durch ELISA am Tag 3 (n = 3), 7 (n = 3) und 30 (n = 5) nach der Injektion. d Konzentration von IL-6 (pg/ml) im Plasma, quantifiziert durch ELISA am Tag 3 (n = 3), 7 (n = 3) und 30 (n = 5) nach der Injektion. e CAB-Konzentration (Durchschnitt ± Standardabweichung) im Plasma (1215 mg/kg) für 90 Tage (n = 6 pro Zeitpunkt). 1×- und 4×-PA-IC90-Werte sind mit gepunkteten Linien für CAB angegeben (166 ng/ml bzw. 664 ng/ml). Plasmaproben einzelner Mäuse sind in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die systemische Entzündung wurde durch einen Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) beurteilt, um die proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-6 im Plasma zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigten keine systemische akute oder chronische Entzündung. TNF-α lag zwischen 0 und 20 pg/ml und war vergleichbar mit der Kontrollgruppe ohne Injektion (p = 0,5521) (Abb. 3c). Die IL-6-Spiegel im Plasma lagen zwischen 0 und 45 pg/ml (Abb. 3d) und waren vergleichbar mit denen, die in der Kontrollgruppe ohne Injektion beobachtet wurden [p = 0,4188 (2-Wege-ANOVA mit mehreren Vergleichen)]. Die Variabilität der Entzündungswerte oder der proinflammatorischen Zytokinspiegel kann auf interindividuelle Variabilität oder Hormonzyklusvariabilität bei Mäusen zurückgeführt werden34. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass CAB-ISFIs im Allgemeinen gut verträglich waren und als sicher galten und keine offensichtlichen Anzeichen von Toxizität oder chronischer Entzündung aufwiesen.

Pharmakokinetische (PK) Studien wurden über 90 Tage an weiblichen BALB/c-Mäusen durchgeführt, um die Kinetik der Arzneimittelfreisetzung von CAB ISFI in vivo zu bewerten. Die CAB-Plasmakonzentrationen wurden mithilfe einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-LC/MS-MS-Methode quantifiziert und über 90 Tage aufgezeichnet (Abb. 3e). Darüber hinaus haben wir die CAB-Freisetzungskinetik anhand von drei mathematischen Modellen (nullter Ordnung, erster Ordnung und diffusionskontrolliert) bewertet35). Wir haben festgestellt, dass die beobachtete CAB-In-vivo-Freisetzung bei Mäusen am besten zu einem Modell nullter Ordnung (Modell nullter Ordnung R2 = 0,97; Modell erster Ordnung R2 = 0,87; diffusionskontrolliertes Modell R2 = 0,86) über die 90-tägige PK-Studiendauer passt. Darüber hinaus war die durchschnittliche CAB-Konzentration im Plasma zwischen allen Mäusen während der gesamten 90-Tage-Studie zwischen dem 6- und 53-fachen des 4-fachen PA-IC90 (664 ng/ml16) höher (Abb. 3e und ergänzende Abb. 7).

Basierend auf den vielversprechenden Sicherheits- und PK-Daten bei BALB/c-Mäusen wurde die CAB ISFI-Formulierung zur Bewertung der Sicherheit, PK und Wirksamkeit bei Rhesusaffen ausgewählt. Da jedoch das Injektionsvolumen für Makaken (zwei 1-ml-Injektionen) viel höher wäre als für Mäuse (50 µL), war es wichtig, die Injizierbarkeit der Formulierung großer Volumina in vitro sicherzustellen, bevor die Studie auf Makaken übertragen wurde. Um die Injizierbarkeit der optimierten CAB-ISFI-Formulierung zu beurteilen, verwendeten wir Polyacrylamid-Hydrogele36. Es wurde gezeigt, dass Polyacrylamid-Hydrogele die mechanischen Eigenschaften von subkutanem In-vivo-Gewebe an der Injektionsstelle nachahmen und bei ISFIs eine bessere Korrelation zur In-vivo-Freisetzung hervorrufen als standardmäßige In-vitro-Freisetzungsmethoden durch direkte Injektion in ein PBS-Bad36,37. Die Beurteilung der Injizierbarkeit war für die CAB-ISFI-Formulierung aufgrund ihrer schnellen Phaseninversionseigenschaft bei der Injektion, die auf die hohe Mischbarkeit der organischen Lösungsmittel mit Wasser und den niedrigen PLGA-MW24 zurückzuführen ist, von entscheidender Bedeutung. Wenn die Phasenumkehr zu schnell erfolgt, könnte sich die Formulierung zwischen Spritze und Nadel verfestigen und den Injektionsfluss blockieren.

Daher untersuchten wir die Injizierbarkeit mehrerer Placeboformulierungen mit unterschiedlichen Polymer-zu-Lösungsmittel-Verhältnissen und PLGA-MW sowie der optimierten CAB-ISFI-Formulierung (1:4 w/w PLGA (10 kDa):Lösungsmittel). Die Injizierbarkeit von Formulierungen in Polyacrylamid-Hydrogele wurde mit 16-Gauge- (G), 18-G- und 19-G-Nadeln mit einem Injektionsvolumen von 1 ml untersucht (Ergänzungstabelle 3). Wie in der Ergänzungstabelle 3 gezeigt, war eine 1-ml-Injektion in die Hydrogelmatrix mit einer 19-G-Nadel der 1:4 w/w PLGA (10 kDa):Lösungsmittel-Placebo- oder CAB-ISFI-Formulierung aufgrund der schnellen Phasenumkehr und der Schnelligkeit nicht erfolgreich Depotbildung führt zu einer Behinderung des Formulierungsflusses durch die Nadel. Dies wurde wahrscheinlich auf die Kombination von PLGA mit niedrigem Molekulargewicht (10 kDa) und hohen Lösungsmittelmengen (1:4 w/w PLGA:Lösungsmittel) zurückgeführt. Andererseits wurden 1 ml Placebo-ISFIs, die mit einem höheren PLGA-MW (27 kDa) oder geringeren Lösungsmittelmengen (1:3 und 1:2 w/w PLGA:Lösungsmittel) hergestellt wurden, erfolgreich in die Hydrogelmatrix injiziert. Darüber hinaus gelang die Injektion von 1 ml des optimierten CAB ISFI (500 mg/ml 1:4 PLGA (10 kDa):Lösungsmittel) in die Hydrogelmatrix erfolgreich mit einer 18 G- oder 16 G-Nadel. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine 16-G-Nadel verwendet, um die CAB-ISFI-Formulierung in Makakenstudien einfach zu verabreichen.

Wir verabreichten CAB ISFI an sechs weibliche Rhesusaffen. Alle Tiere erhielten zwei separate 1-ml-Injektionen (insgesamt 1000 mg CAB), mit Ausnahme eines Makaken (RH-1080), der eine 1,0-ml- und eine 0,5-ml-Injektion ISFI oder insgesamt 750 mg CAB erhielt. Bezogen auf das Gewicht erhielten die Tiere zwischen 72,8 und 143,9 mg/kg CAB (Median = 113,8 mg/kg). Makaken RH-42012 war ein SHIV-infiziertes und ansonsten gesundes Tier aus einer separaten Studie und wurde nur für PK-Zwecke einbezogen. Abbildung 4a zeigt die Längskonzentrationen von CAB im Plasma. Insgesamt erreichten alle Makaken in Woche 4 Plasma-CAB-Konzentrationen über dem 4-fachen PA-IC90, mit Ausnahme von RH-1073, das in Woche 24 Benchmark-Konzentrationen erreichte (1230 ng/ml). Die mittleren (Bereichs-)Plasmakonzentrationen von CAB in den Wochen 4, 8 und 12 betrugen 982 [406–1977], 1950 [578–5627] bzw. 2127 [522–2552] ng/ml oder etwa 1,5 bis 3,2 %. über dem 4× PA-IC90 falten. Die Entfernung der beiden CAB-ISFIs bei den Makaken RH-1097 und RH-1093 in Woche 12 führte zu einer 7- bzw. 48-fachen Verringerung der Plasma-CAB-Spiegel nach 72 Stunden und zu einer etwa 10- bis 100-fachen Verringerung 2 Wochen nach der Entfernung (Abb. 4a). Ebenso führte die Entfernung eines der beiden ISFIs, die in Woche 14 im Makaken RH-42012 noch tastbar waren, zu einem etwa zweifachen Rückgang des Plasma-CAB innerhalb einer Woche (1550–765 ng/ml); Die CAB-Konzentrationen blieben weitere 3 Wochen lang über dem 4-fachen PA-IC90. Bei den verbleibenden drei Tieren mit intakten CAB-ISFIs betrugen die mittleren CAB-Plasmakonzentrationen in den Wochen 16, 20, 24 und 28 1923 [534–2082], 2227 [646–2827], 1230 [971–1585] und 886 [ 473–1415] ng/ml bzw. 1,3- bis 3,4-fach über dem 4× PA-IC90 (Abb. 4b). Bemerkenswerterweise blieben die Plasma-CAB-Spiegel bei einem Tier (RH-1048) in Woche 47 über dem 4-fachen PA-IC90 (838 ng/ml). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass zwei 1-ml-Injektionen der optimierten CAB-ISFI-Formulierung CAB bei Makaken in Konzentrationen freisetzen können, die über dem Schwellenwert für einen Schutz von bis zu 6–11 Monaten liegen.

a Längsschnittbewertung der CAB-Konzentrationen im Plasma. Die beiden CAB-ISFIs wurden in Woche 12 von den Makaken RH-1097 und 1093 (blaue und violette ausgefüllte Kreise) entfernt, und einer der beiden CAB-ISFIs wurde in Woche 14 von den Makaken RH-42012 entfernt (grüner ausgefüllter Kreis). Die gestrichelten Linien zeigen die CAB-Werte nach der Entfernung an. b Ein Sternchen (*) kennzeichnet Tiere, bei denen ISFIs in den Wochen 12–14 entfernt wurden. Daten nach der Implantatentfernung werden nicht in die Berechnung der Mediane einbezogen. c CAB-Spiegel im Plasma, im Rektalgewebe und im Vaginalgewebe von drei Makaken (RH-42012, RA-1048 und RA1080) mit CAB-ISFIs nachgewiesen. Die Proben wurden von denselben Tieren zu drei verschiedenen Zeitpunkten nach der Implantation (Woche 4, 8 und 12) entnommen. Schwarze Balken stellen den Median dar. d Verhältnis der CAB-Konzentrationen in Vaginalgewebe (VT) und Rektalgewebe (RT) im Verhältnis zum Plasma.

Die CAB-Konzentrationen wurden auch im Vaginal- und Rektalgewebe von drei Makaken (RH-42012, RA-1048 und RA-1080) in den Wochen 4, 8 und 12 gemessen. Abbildung 4c zeigt, dass CAB in beiden Geweben konsistent nachgewiesen wurde Einzige Ausnahme: Makaken RH-1048, der in Woche 4 kein nachweisbares CAB im Vaginalgewebe aufwies. Die mittleren CAB-Konzentrationen im Rektalgewebe stiegen zwischen Woche 4 und Woche 8 um das etwa Dreifache (jeweils 333–1004 ng/g) und sanken von Woche zu Woche leicht ab 12 (713 ng/g). Die mittleren CAB-Konzentrationen im Vaginalgewebe stiegen von Woche 4 bis 8 ebenfalls um etwa das 2,8-fache (jeweils 293–849 ng/g) und blieben in Woche 12 bei 823 ng/g. Das Gewebe-Plasma-Verhältnis (Abb. 4d) blieb über die Zeit stabil und waren in der Vagina [Median = 0,18 (0,15–0,32)] und im Rektalkompartiment [Median = 0,42 (0,23–0,43)] ähnlich.

Um zu untersuchen, ob von ISFIs abgegebenes CAB einen rektalen Schutz verleihen kann, führten wir zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Implantation eine Reihe von SHIV-Challenge-Experimenten durch. Wir haben zunächst den Kurzzeitschutz bei zwei Makaken (RH-1093 und RH-1097) untersucht, die zwischen Woche 4 und 8 zweimal wöchentlich einer Herausforderung ausgesetzt wurden (insgesamt acht Herausforderungen pro Tier) (Abb. 5a). Beide Tiere waren vor einer SHIV-Infektion geschützt, im Gegensatz zu einer unbehandelten Echtzeitkontrolle (RH-1092), die nach einer einzigen SHIV-Exposition infiziert wurde. Der Langzeitschutz wurde bei zwei weiteren Makaken (RH-1048 und RH-1080) bewertet, die zwischen der 14. und 18. Woche zweimal pro Woche SHIV ausgesetzt wurden (8 Herausforderungen pro Tier) (Abb. 5b). Ein Tier (RH-1048), dessen Plasma-CAB-Spiegel über 4× PA-IC90 lagen, erhielt zwischen der 25. und 28. Woche zusätzlich sechs SHIV-Provokationen. Die beiden mit CAB behandelten Tiere waren vor Infektionen geschützt, während eine unbehandelte Echtzeitkontrolle (RH-1084) wurde nach einer einzigen SHIV-Exposition infiziert (Abb. 5b). Insgesamt schützte eine einzige ISFI-Behandlung vier Makaken während insgesamt 38 rektalen SHIV-Expositionen über einen Zeitraum von 27 Wochen vollständig.

a Kurzfristiger Schutz durch CAB ISFIs. Zwei mit CAB behandelte Makaken (RH-1093 und RH-1097) und ein unbehandelter Makaken (RH-1092) wurden zwischen der 4. und 8. Woche nach der Implantation rektal SHIV ausgesetzt. Jedes Tier erhielt bis zu vier Wochen lang zweimal pro Woche rektale SHIV-Provokationen (insgesamt acht Expositionen). Pfeile zeigen SHIV-Expositionen an. ISFIs wurden in Woche 12 chirurgisch entfernt (blaue und violette durchgezogene Kreise). b Plasma-SHIV-RNA-Spiegel wurden durch Echtzeit-PCR bei Tieren während der Belastungsperiode und der 32-wöchigen Nachbeobachtungszeit nachgewiesen. c Langfristiger Schutz durch CAB ISFI. Zwei mit CAB behandelte Makaken (RH-1080 und RH-1048) und ein unbehandelter Makaken (RH-1084) erhielten zwischen der 14. und 18. Woche nach der Implantation zweimal pro Woche rektale SHIV-Provokationen (bis zu 8 Expositionen). Tier RH-1048 erhielt zwischen der 25. und 28. Woche sechs zusätzliche SHIV-Provokationen (insgesamt 14 Expositionen). Pfeile zeigen SHIV-Expositionen an. d Plasma-SHIV-RNA-Spiegel, nachgewiesen durch Echtzeit-PCR bei Tieren während des Belastungszeitraums und des 24- bis 36-wöchigen Nachbeobachtungszeitraums.

Um die Sicherheit und Verträglichkeit zu beurteilen, haben wir bis zu 12 Wochen lang oder bis zur Entfernung des Implantats jede Woche die Umgebung der Implantate untersucht. Diese Bewertung umfasste die sechs Makaken, die zwei Injektionen für eine kumulative Analyse von 12 Implantationsstellen und insgesamt 144 klinischen Beobachtungen erhielten. Basierend auf der Draize-Skala waren alle Implantationsstellen unauffällig und zeigten während des 12-wöchigen Studienzeitraums keine Anzeichen lokaler Hautreaktionen (Abb. 6a und ergänzende Abb. 8). Eine semiquantitative histopathologische Untersuchung wurde anhand einer chirurgischen 3-mm-Hautbiopsie durchgeführt, die an der Implantationsstelle von drei Makaken während der Implantatentfernung (12–14 Wochen nach der Implantation) entnommen wurde. Zum Vergleich wurde eine chirurgische 3-mm-Stanzbiopsie von einem Tier entnommen, das keine CAB-ISFI-Injektion erhalten hatte. Hautbiopsien wiesen bei den Tieren, einschließlich der Kontrolltiere, keine bis nur minimale lymphoplasmazytische Infiltrate auf, und in keinem der Gewebeschnitte waren Hinweise auf eine Infektion oder Fremdmaterial (Restimplantat) vorhanden (Abb. 6b und Ergänzungstabelle 4).

eine Heatmap der lokalen Hautreaktionen an der Implantationsstelle bei den sechs mit ISFI behandelten Tieren. Lokale Hautreaktionen wurden anhand einer Draize-Skala (0 – keine bis 4 – schwerwiegend) bewertet. b Histopathologie der Haut. Bei der Implantation wurde eine Hautbiopsie pro Tier von den behandelten Tieren RH-1093, RH-1097, RH-42012 (n = 3) und einer unbehandelten Kontrolle (n = 1) entnommen. Alle Maßstabsbalken repräsentieren 1 mm (H&E, Originalvergrößerung ×4).

Um die Rückholbarkeit von Implantaten nach In-vivo-Studien zu beurteilen, entfernten wir CAB-ISFIs von Mäusen an den Tagen 30 (n = 6), 60 (n = 6) und 90 (n = 6) nach der Verabreichung, indem wir bei der Euthanasie einen kleinen Hautschnitt machten. ISFIs wurden erfolgreich von allen Tieren entfernt, bei denen kein fibrotisches Gewebe das Depot umgab (Abb. 7a). Die am Tag 30 (n = 6), 60 (n = 6) und 90 (n = 6) entfernten Depots wurden weiterverarbeitet, um den Polymerabbau (n = 3/Zeitpunkt) und die restlichen CAB-Konzentrationen (n = 3/Zeitpunkt) zu bewerten. . Nach 90 Tagen bei Mäusen zeigten die Ergebnisse dieser Analysen einen Verlust der Depotmasse um 59,5 ± 13,4 % (Abb. 7b) und eine Abnahme des PLGA-Molekulargewichts um 49,7 ± 5,4 % (Abb. 7c). Wichtig ist, dass in den Implantaten, die Mäusen am Tag 90 entnommen wurden, noch 61,6 ± 6,5 % CAB vorhanden waren, was zeigt, dass die CAB-Freisetzung aus dem ISFI über 90 Tage hinaus aufrechterhalten werden kann (Abb. 7d).

a Bild von CAB-ISFIs, die 30, 60 und 90 Tage nach der Injektion von BALB/c-Mäusen entnommen wurden. b CAB-ISFI-Massen 30, 60 und 90 Tage nach der Injektion bei Mäusen (Durchschnitt ± Standardabweichung; n = 6/Zeitpunkt) im Vergleich zur anfänglichen ISFI-Masse (Tag 0) aus einem Injektionsvolumen von 50 µL (60,75 mg) . Die Massen am Tag 0 wurden basierend auf einem Injektionsvolumen von 50 µL und unter Verwendung der Dichte der Formulierung (1,215 g/ml) berechnet, um die ungefähre Masse bei der Injektion zu bestimmen. c Quantifizierung des restlichen CAB in ISFIs 30, 60 und 90 Tage nach der Injektion bei Mäusen (Durchschnitt ± Standardabweichung von n = 3 Proben) im Vergleich zur Anfangsdosis (25 mg in 50 µL Injektion). d Abnahme des PLGA-Molekulargewichts in CAB-ISFIs 30, 60 und 90 Tage nach der Injektion bei Mäusen (Durchschnitt ± Standardabweichung von n = 3 Proben) im Vergleich zu reinem PLGA (10 kDa). e Quantifizierung der verbleibenden Arzneimittelreste von Implantaten (injiziert an der linken und rechten oberen Rückenstelle), die 84 und 98 Tage nach der Injektion von drei Rhesusaffen entnommen wurden. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Darüber hinaus wurden beide CAB-ISFIs von zwei Makaken (RH-1097 und RH-1093) am Tag 84 und ein ISFI von einem dritten Makaken (RH-42012) am Tag 98 nach der Injektion entfernt. Wie in Abb. 7e dargestellt, verblieben nach der Depotentfernung durchschnittlich 48,32 ± 11,44 % CAB pro Implantat.

Die einzelnen CAB-Clearance-Raten wurden auf der Grundlage des extravaskulären PK-Profils für unsere sechs Makaken, denen 1,5–2 ml subkutanes CAB-ISFI verabreicht wurden, geschätzt (ergänzende Abbildung 9) [Median (IQR) = 15,9 (9,1–25,2) ml/(h*kg) ] und für neun historische Referenzmakaken, denen 7 und 1 Tag vor der PK-Probenahme eine intramuskuläre Dosis von 50 mg/kg CAB LA verabreicht wurde [Median (IQR) = 12,4 (11,7–14,3) ml/(h*kg)]38. Die Eingaberaten für diese beiden langwirksamen Formulierungen wurden abgeleitet, indem die beobachtete Plasmakonzentration mit der geschätzten Clearance-Rate der jeweiligen Tiere multipliziert wurde, korrigiert um das Gewicht zum Zeitpunkt der Verabreichung bei unseren sechs ISFI-behandelten Makaken oder das angenommene Gewicht von 8 kg bei historischen Referenzmakaken (Abb. 8). ). Zieleingaberaten für eine effektive klinische Dosierung wurden anhand mittlerer Parameter aus einem veröffentlichten CAB-Populations-PK-Modell (CL = 151 ml/h, V2 = 5270 ml, Q = 507 ml/h und V3 = 2430 ml)39 geschätzt, um menschliches Plasma zu simulieren Konzentrationen bei verschiedenen IV-Infusionsraten. Bei Zugaberaten von 3 und 0,75 mg/Tag wurden Plasmakonzentrationen über 4× PA-IC90 bzw. 1× PA-IC90 erreicht. Die in unserer Makaken-Studie beobachteten mittleren CAB-ISFI-Eingaberaten überstiegen diese klinische Wirksamkeitsschwelle von 3 mg/Tag vom 28. bis zum 140. Tag nach der Verabreichung. Unter der Annahme, dass die Eingaberate proportional zum Injektionsvolumen steigt, würde eine 3-ml-CAB-ISFI-Injektion diesen Schwellenwert am 21. Tag bis zum 168. Tag oder 5,6 Monate nach der Verabreichung erreichen. Im Vergleich zu den Makaken, denen zwei intramuskuläre CAB LA-Injektionen von 50 mg/kg im Abstand von 6 Tagen verabreicht wurden, hielten CAB-ISFIs die Raten über der vorhergesagten Schutzschwelle für einen Median von 97 zusätzlichen Tagen aufrecht (Abb. 8b).

Eine CAB-ISFI-Eingaberate wird geschätzt, indem die beobachteten Plasmakonzentrationen mit der Clearance der jeweiligen Tiere multipliziert werden, die durch ihr extravaskuläres PK-Profil bestimmt wird. Gestrichelte und gepunktete Referenzlinien bezeichnen Eingaberaten von 3 und 0,75 mg/Tag, die voraussichtlich Plasmakonzentrationen beim Menschen über dem 4-fachen PA-IC90 bzw. PA-IC90 erreichen. b Die in dieser Studie beobachteten mittleren (±IQR) CAB-ISFI-Eingaberaten von a (grüne Linie) werden mit den für ein Injektionsvolumen von 3 ml prognostizierten mittleren Raten (unter der Annahme, dass die Eingaberate proportional mit dem Volumen zunimmt; violette Linie) und den für n geschätzten überlagert = 9 Referenzmakaken, denen 7 und 1 Tag vor der PK-Probenahme 50 mpk (mg pro kg) intramuskuläres CAB LA verabreicht wurde38.

Wir berichten über einen CAB-ISFI mit ultralanger Wirkung, der die Dosierungsintervalle bei kleinen Injektionsvolumina verlängert, einen dauerhaften Schutz vor rektalen SHIV-Infektionen bietet und die Rückholbarkeit des Produkts ermöglicht. Wir zeigen, dass die CAB-Freisetzung bei Makaken bis zu 6–11 Monate über den etablierten PrEP-Schutz-Benchmarks liegt, und nutzten diese Daten, um die klinische Exposition abzuschätzen. Wir haben herausgefunden, dass eine 2-ml- oder 3-ml-Injektion unserer Formulierung beim Menschen Plasmakonzentrationen über dem 4-fachen PA-IC90-Wert über 4 bzw. 5 Monate aufrechterhalten kann.

CAB-ISFIs blieben injizierbar, zeigten keinen Wirkstoffabbau und behielten eine homogene CAB-Konzentration bei, wenn sie bis zu 30 Tage bei 40 °C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit und bis zu 90 Tage bei 4 °C gelagert wurden, was die Stabilität der Formulierung demonstriert. Obwohl In-vitro-Freisetzungsstudien nach der Lagerung bei beiden Lagerungsbedingungen zu einer langsameren CAB-Freisetzung führten, gab es nur einen Unterschied von ca. 3 % in der kumulativen CAB-Freisetzung zwischen dem Ausgangswert und nach 90 Tagen Lagerung bei 4 °C. Wir haben auch ISFI-Injektionsstudien in Polyacrylamid-Hydrogelen durchgeführt, um zu verstehen, ob die schnelle Phaseninversion von ISFIs, die zu einer möglichen Verfestigung des Implantats führt, eine Einschränkung im Zusammenhang mit der Verabreichung großer Injektionsvolumina (≥ 1 ml) darstellen könnte. Wir haben gezeigt, dass eine Nadelstärke von 18 G oder 16 G für Injektionsvolumina ≥1 ml verwendet werden kann. Bei BALB/c-Mäusen waren die Plasma-CAB-Konzentrationen 90 Tage lang bis zu 53-fach höher als die 4× PA-IC90. Bei Rhesusaffen hielten CAB-ISFIs die Plasma-CAB-Konzentrationen 6 bis 11 Monate lang über dem 4-fachen PA-IC90, was im Gegensatz zu zuvor berichteten langwirksamen CAB-Formulierungen steht, die viel kürzere Zeiträume von Plasma-CAB-Spiegeln über den schützenden Grenzwerten dokumentierten40,41,42, 43. Unsere In-vivo-Sicherheitsstudien an weiblichen BALB/c-Mäusen und weiblichen Rhesusaffen zeigten, dass CAB-ISFIs gut vertragen wurden und keine nennenswerten lokalen oder systemischen Entzündungen auftraten. Darüber hinaus konnten tastbare Implantate bei Mäusen und Makaken noch bis zu 90 Tage nach der Injektion entfernt werden, was zeigt, dass sie im Falle unerwünschter Ereignisse leicht entfernt werden können, wodurch möglicherweise die Notwendigkeit entfällt, einen langen pharmakologischen Schwanz wie bisher mit oraler PrEP zu bedecken mit der aktuellen CAB LA-Formulierung. Wir stellten außerdem fest, dass nach der Entnahme 84–90 Tage nach der Injektion etwa 60 % des CAB im Implantat bei Mäusen und zwischen 30 und 60 % des CAB bei Makaken in jedem Implantat verblieben, was zeigt, dass CAB-ISFIs das Potenzial haben, über viel längere Zeiträume freizusetzen von Zeit.

Bei Rhesusaffen führt eine Dosis von 50 mg/kg injizierbarem CAB LA für etwa 6 Wochen zu Plasma-CAB-Konzentrationen über dem etablierten PrEP-Schutzrichtwert44. Hier zeigen wir, dass zwei 1-ml-CAB-ISFI-Injektionen, die nur 1,5- bis 2,9-fach mehr CAB pro kg enthalten, die Plasma-CAB-Werte 6–11 Monate lang über diesem Grenzwert halten können. In rektalen und vaginalen Geweben lagen die CAB-Konzentrationen ebenfalls im Bereich derjenigen, die bei mit CAB LA behandelten Makaken beobachtet wurden, und waren etwa zwei- bis viermal höher als diejenigen, die beim Menschen mit der klinischen Dosis von 600 mg CAB LA erreicht wurden, obwohl eine mögliche Einschränkung besteht dass unsere Analyse nur die ersten 12 Wochen nach der Implantation umfasste44,45. Darüber hinaus bietet das ultralang wirkende CAB ISFI deutliche Vorteile gegenüber anderen langwirksamen CAB-Formulierungen, die sich in der präklinischen Entwicklung befinden. Karunakaran et al. berichteten über ein langwirksames hydrophiles, röntgendichtes CAB-Implantat aus Poly(etherurethan), das bei Makaken 12 Wochen lang Plasmaspiegel über dem 1× PA-IC90 erreichte, aber ca. 2 Wochen nach der Implantation unter den 4× PA-IC90 fiel sechs Implantate pro Makaken41. Jedes Implantat enthielt etwa 274 mg CAB und setzte in vivo durchschnittlich 348 µg CAB/Tag frei41. Zhou et al. und Kulkarni et al. berichteten über ein injizierbares, nanoformuliertes CAB-Prodrug, das bei Makaken eine lang anhaltende Freisetzung von CAB (45 mg CAB-Äquivalente/kg, ~2 ml intramuskuläres Injektionsvolumen) über ein Jahr hinweg zeigte, die CAB-Plasmakonzentrationen fielen jedoch unter den 4-fachen PA-IC90-Wert und PA-IC90 nach ca. 60 Tagen42 bzw. 200 Tagen43. Das in unserer Studie beschriebene injizierbare und biologisch abbaubare CAB ISFI zeigte bei Makaken 6–11 Monate lang Plasma-CAB-Werte über dem 4-fachen PA-IC90 und zeigte mit nur zwei subkutanen 1-ml-Injektionen 100 % Schutz gegen mehrere rektale SHIV-Provokationen.

Unsere Ergebnisse, die einen 100-prozentigen Schutz bei Makaken über mehrere Monate hinweg zeigen, stellen unseres Wissens nach auch die längste dokumentierte PrEP-Aktivität dar, die bei einer einzigen CAB-Verabreichung beobachtet wurde. Wir haben die SHIV-Herausforderungen auf Zeiträume beschränkt, in denen die Plasma-CAB-Werte über dem 4-fachen PA-IC90 lagen, da diese Konzentration einen etablierten PrEP-Schutzmaßstab bei Makaken und Menschen darstellt. Der vollständige Schutz, der trotz insgesamt 38 rektalen SHIV-Expositionen beobachtet wurde, war daher nicht völlig unerwartet. Es wird wichtig sein, die Dauer der PrEP-Aktivität von CAB-ISFIs weiter zu definieren, da Werte über dem 1-fachen PA-IC90 auch mit einem signifikanten (>95 %) Schutz vor rektalen SHIV-Provokationen bei Makaken in Verbindung gebracht werden40,46. Diese Analyse kann auch Aufschluss über mögliche Reduzierungen der CAB-ISFI-Dosen oder Injektionsvolumina und über eine mögliche Verlängerung des Schutzes über die vorhergesagten 5,6 Monate hinaus bei einer 3-ml-Injektion beim Menschen geben. Die Dokumentation seltener Durchbruchsinfektionen bei Menschen, die CAB LA erhielten und die Zielwerte einhielten, könnte jedoch gegen eine Senkung der CAB-Dosierung sprechen47,48.

Die Analyse der Plasma-CAB-Konzentrationen bei Makaken nach der Implantatentfernung nach drei Monaten lieferte ebenfalls wichtige Informationen über die Rückholbarkeit von ISFIs. Bei zwei der Makaken führte die Entfernung der beiden Implantate innerhalb von zwei Wochen zu einem schnellen 10- bis 100-fachen Rückgang der Plasma-CAB-Spiegel, obwohl bei einem der Tiere etwas Restimplantatmaterial erkennbar war, was durch den anhaltenden Nachweis von CAB angezeigt wurde im Plasma in Konzentrationen über dem PA-IC90. Bei einem anderen Makaken führte die Entfernung eines der beiden Implantate innerhalb einer Woche zu einem schnellen Rückgang der CAB-Plasmaspiegel um das Zweifache. In allen Fällen verblieb etwa die Hälfte der CAB-Dosis im wiedergefundenen ISFI, was darauf hindeutet, dass CAB-ISFIs das Potenzial haben, über viel längere Zeiträume freizusetzen. Zukünftige Studien sind erforderlich, um das Fenster der Entfernbarkeit zu definieren und die Zeit bis zur Erschöpfung von CAB aus ISFIs zu verstehen. Obwohl das vorgeschlagene CAB ISFI ein vielversprechendes Potenzial für HIV-PrEP gezeigt hat, weist diese Formulierung einige Einschränkungen auf. Obwohl wir beispielsweise in unserer Maussicherheitsstudie keine Anzeichen von Toxizität oder unerwünschten Ereignissen beobachteten, sind unsere Ergebnisse aufgrund der geringen Stichprobengröße der Studie (n = 3) begrenzt. Zukünftige Studien werden daher die Durchführung einer umfassenden Sicherheitsstudie an Mäusen mit einer größeren Stichprobe und die Bewertung der Langzeitsicherheit bis zu 180 Tagen umfassen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass es bei Makaken in den ersten zwei Wochen nach der Injektion zu einem anfänglichen Rückgang der CAB-Konzentration kommt, mit einem möglichen Verlust der PrEP-Aktivität, wenn die Werte unter den 4-fachen PA-IC90-Wert fallen. Dieser Zeitraum mit geringer Freisetzung würde, wenn er sich beim Menschen bestätigt, dazu führen, dass alternative HIV-Präventionsmodalitäten für 28 Tage nach der ersten CAB ISFI-Injektion mit einem Injektionsvolumen von 2 ml oder 21 Tage mit einer Injektion von 3 ml empfohlen werden. Aktuelle CDC-PrEP-Richtlinien empfehlen alternative HIV-Präventionsmodalitäten für 7 bis 20 Tage nach Beginn der täglichen oralen PrEP, abhängig vom möglichen Übertragungsweg49. Eine weitere mögliche Einschränkung besteht darin, dass die Formulierung organische Lösungsmittel enthält, die in großen Mengen toxisch wirken können. Die mittlere tödliche Dosis (LD50) und der No-Observable-Effect-Level (NOEL) von NMP beträgt bei intravenöser Verabreichung bei Mäusen 3600 mg/kg bzw. 257 mg/kg50. Alternativ beträgt die LD50 und der NOEL von DMSO 4000 mg/kg bzw. 3300 mg/kg bei nichtmenschlichen Primaten und die LD50 bei Mäusen 14.000 mg/kg bei Verabreichung in den Blutkreislauf51. In unserer Studie wurden Mäusen (700 mg/kg pro Lösungsmittel) und Makaken (71 mg/kg pro Lösungsmittel) etwa 300 mg/ml pro Lösungsmittel verabreicht und zeigten keine Anzeichen einer chronischen oder offensichtlichen Toxizität. Obwohl die ISFIs deutlich unter den LD50- und NOEL-Grenzwerten für DMSO und NMP bei Makaken liegen, sollten zukünftige Studien Anstrengungen zur Verringerung der Lösungsmittelmenge beinhalten, um mögliche Toxizitätsbedenken zu verringern.

Zu den weiteren Studien zur Behebung dieser Einschränkungen und zur Weiterentwicklung dieser Studie gehören (1) die Erhöhung der Burst-Freisetzung des CAB ISFI, die verabreichte Dosis oder die Implementierung einer oralen Einführungsdosis, um sicherzustellen, dass die Plasmakonzentrationen währenddessen über dem 4-fachen PA-IC90 bleiben im ersten Monat nach der Injektion (2) Bestimmung der Zeit bis zum Abschluss der CAB-Freisetzung und des vollständigen Polymerabbaus, um das vollständige PK-Profil in vivo zu beurteilen, und (3) Einbeziehung von Bariumsulfat, um ein röntgendichtes Implantat für die Röntgenüberwachung zu erzeugen, um die Rückholbarkeit zu erleichtern, wenn erforderlich und untersuchen Sie die Implantatmigration. Darüber hinaus haben wir die Fähigkeit demonstriert, mehrere ARVs in einem einzigen ISFI zu laden und so bei Mäusen eine extrem lang wirkende Freisetzungskinetik zu erreichen20. Daher könnten weitere zukünftige Studien die Hinzufügung eines weiteren ARV zur derzeit vorgeschlagenen CAB ISFI-Formulierung für HIV-Behandlungsanwendungen umfassen.

Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse das Versprechen von CAB ISFIs als Plattform mit extrem langer Wirkungsdauer zur Bereitstellung von PrEP und zur Unterstützung seiner klinischen Weiterentwicklung beim Menschen. Die beobachtete präklinische Sicherheit und die erweiterte pharmakokinetische Bioäquivalenz zu CAB LA sind sehr vielversprechend, was bei klinischem Nachweis zu einem beschleunigten Weg zur behördlichen Zulassung führen könnte, möglicherweise ohne die Notwendigkeit von Wirksamkeitsstudien. Wir gehen davon aus, dass CAB-ISFIs äußerst wünschenswert sind und eine hohe Adhärenz aufweisen, wenn sie in ein klinisches Umfeld überführt werden. Studien haben gezeigt, dass langwirksame Injektionsmittel im Vergleich zu anderen potenziellen Dosierungsformen (z. B. tägliche orale Pille und Vaginalringe) in Bereichen, in denen die HIV-Prävalenz am höchsten ist, die größte Akzeptanz und Adhärenz beim Anwender hervorrufen (z. B. tägliche orale Pille und Vaginalringe)5,10 aufgrund der geringen Dosierungshäufigkeit, Vertrautheit und Einfachheit Nutzungsart und Diskretion. Darüber hinaus könnte die vorgeschlagene Formulierung selbst verabreicht werden, da sie subkutan injiziert wird, was die Benutzerakzeptanz und den einfachen Zugang weiter erhöhen könnte. Insgesamt hat CAB ISFI mit ultralanger Wirkung das Potenzial, zwei- bis dreimal pro Jahr in einem klinischen Umfeld verabreicht zu werden, und kann die HIV-Landschaft vorantreiben und die Präventionsmöglichkeiten auf der ganzen Welt erweitern.

50:50 Poly(DL-lactid-co-glycolid, PLGA) wurde von LACTEL (Birmingham, AL; Kat.-Nr. B6010-1P, Chargen-Nr. A17–142, Molekulargewicht 27,2 kDa, inhärente Viskosität 0,26–0,54 dl/h) gekauft. g; Kat.-Nr. B6017-1G, Chargen-Nr. A15-108, Molekulargewicht 10 kDa, inhärente Viskosität 0,15–0,25 Dl/g). N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP, USP) wurde von ASHLAND (Wilmington, DE, Produktcode 851263, 100 % NMP) erhalten. Dimethylsulfoxid (DMSO, ≥99,7 %) wurde von Fisher Scientific (Waltham, MA) bezogen. Solutol-HS 15, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (0,01 M PBS, pH 7,4) sowie Acetonitril (ACN) in HPLC-Qualität und Wasser wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Gelucire 44/14 (Kat.-Nr. 1356950) wurde von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. Tween 20 wurde von Fisher Scientific (Hampton, NJ; Kat. Nr. BP337-100) gekauft. Tetrahydrofuran (THF) wurde von Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri; Kat.-Nr. SHBF9530V) bezogen. 98,5 % Acrylamid (AM) und Ammoniumpersulfat (APS) wurden von Acros Organics (Carlsbad, CA; AM-Kat.-Nr. 16435000, APS-Kat.-Nr. 40116-1000) sowie 2 % Bisacrylamidlösung und N, N gekauft ,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) wurden von Fisher Scientific (Hampton, NJ; Bisacrylamid, Kat.-Nr. BP150-20, TEMED-Kat.-Nr. BP1404-250) bezogen. Hochreines (≥99 %) CAB wurde von Selleckchem (Houston, TX; Kat.-Nr. S7766) und steril gefiltertes DMSO (≥99,7 %) von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; Lot-Nr. RNBH5297) erworben.

Eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) mit einem Diodenarray-Detektor und einer LC-Pumpe mit Autosampler durchgeführt. Die für die CAB-Analyse verwendete stationäre Phase war eine Inertsil ODS-3-Säule (5 μm, 4,6 × 150 mm 100 Å, [GL Sciences, Torrance, CA]), die bei 40 °C gehalten wurde. Die chromatographische Trennung wurde durch Gradientenelution unter Verwendung einer mobilen Phase bestehend aus 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser und ACN (H2O/ACN 95:5 v/v) erreicht. Die Flussrate betrug 1,0 ml/min und die Gesamtlaufzeit betrug 25 Minuten für jede 25-ml-Injektion. CAB wurde bei einer Wellenlänge von 254 nm analysiert und hatte eine Retentionszeit von 11,4 Minuten. Der Kalibrierungsbereich für den Assay betrug 0,48–250 µg/ml. Für die HPLC-Datenerfassung wurde die Agilent OpenLab-Software (Version C.01.08) verwendet.

Die Sättigungskonzentration von CAB in NMP, DMSO, verschiedene Gewichtsverhältnisse (w/w) von NMP:DMSO (1:1, 9:1 und 2:8 w/w), 9:1 NMP:Gelucire 44/14 ( w/w), 9:1 w/w (NMP:DMSO):Tween 20 (Ergänzungstabelle 1), um das optimale Lösungsmittel im ISFI-System für maximale CAB-Beladung zu bestimmen. Die CAB-Sättigungslöslichkeit wurde auch in Freisetzungsmedien (PBS mit 2 % Solutol) gemessen, um Sink-Bedingungen (unter 1/5 der maximalen Löslichkeit52) während In-vitro-Freisetzungsstudien sicherzustellen (Ergänzungstabelle 1). Es hat sich gezeigt, dass die Zugabe von Solutol zu Freisetzungsmedien die Löslichkeit hydrophober Arzneimittel in Freisetzungsmedien erhöht und so sicherstellt, dass Sink-Bedingungen während der gesamten In-vitro-Freisetzungsstudien aufrechterhalten werden20. Die CAB-Sättigungslöslichkeit erhöhte sich durch die Zugabe von 2 % Solutol in PBS im Vergleich zu PBS allein um das 4,3-fache.

Um die Sättigungslöslichkeit von CAB in den folgenden in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Lösungsmitteln zu bestimmen, wurden 100 mg CAB in einzelne Fläschchen eingewogen und 100 mg des jeweiligen Lösungsmittels hinzugefügt. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 37 °C gerührt. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei 16.000 × g (Eppendorf Centrifuge 5415R, USA) zentrifugiert, um überschüssiges ungelöstes Arzneimittel zu entfernen. Probenaliquots (n = 3) wurden aus dem gesättigten Überstand gesammelt und mit ACN20 verdünnt. Die Arzneimittelkonzentration in den gesättigten Aliquots wurde durch HPLC-Analyse bestimmt.

50:50 Poly(DL-lactid-co-glycolid) (PLGA) (27 kDa oder 10 kDa Molekulargewicht) wurde mit 1:1 Gewichtsverhältnis (w/w) NMP:DMSO im Verhältnis 1:2 oder 1:4 gemischt w/w in ein 7-ml-Szintillationsfläschchen gegeben und durch Mischen bei Raumtemperatur aufgelöst, um eine homogene Placebo-Formulierung zu erhalten. Anschließend wurde Cabotegravir (CAB; 100–400 mg/g) der jeweiligen Polymer-/Lösungsmittellösung zugesetzt und man ließ den Wirkstoff solubilisieren und eine stabile ISFI-Lösung oder -Suspension mit der angestrebten Wirkstoffbeladung erzeugen. Um eine vollständige Auflösung des Arzneimittels in der Placeboformulierung und Homogenität der Arzneimittellösung oder -suspension sicherzustellen, wurden Probenaliquots (1–2 mg, n = 4) aus der Arzneimittelformulierung gesammelt und in ACN gelöst. Die Arzneimittelkonzentration wurde durch HPLC-Analyse quantifiziert.

Für In-vivo-Studien wurden ISFI-Formulierungen unter aseptischen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank hergestellt. Alle Lösungsmittel und ISFI-Placeboformulierungen wurden steril filtriert (steriler Puradisc 13 mm Nylon-Spritzenfilter, 0,2 µm; Kat.-Nr. 6786-1302). Anschließend wurde CAB der steril filtrierten Polymer-/Lösungsmittellösung zugesetzt und solubilisiert, um eine stabile ISFI-Lösung oder -Suspension mit der angestrebten Wirkstoffbeladung zu erzeugen. Um eine vollständige Auflösung und Homogenität des Arzneimittels sicherzustellen, wurden Probenaliquots (1–2 mg, n = 3) aus der Arzneimittelformulierung entnommen und in ACN gelöst, und die Arzneimittelkonzentration wurde durch HPLC-Analyse quantifiziert.

Die Mikrostrukturen des Implantats wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) wie zuvor beschrieben20,30 bewertet. Kurz gesagt, zur Beurteilung der Mikrostruktur von In-vitro-ISFIs wurden 30 ± 3 mg ISFI-Lösung oder -Suspension in 200 ml 0,01 M PBS, pH 7,4, mit 2 % Solutol bei 37 °C injiziert. Zu festgelegten Zeitpunkten (3, 30 und 90 Tage nach der Inkubation) wurden die Implantate aus der Badlösung entnommen, schockgefroren und 48 Stunden lang lyophilisiert (FreeZone Benchtop Freeze Dryer, Labconco, Kansas City, MO). . Die Probenvorbereitung von ISFIs für die SEM-Bildgebung vor Tag 3 war aufgrund einer Implantatverzerrung, die wahrscheinlich durch unvollständige Phaseninversion und Lösungsmittelaustausch verursacht wurde, nicht möglich20,27,53. Nach der Gefriertrocknung wurden alle Depots halbiert, um den Querschnitt für die Bildgebung freizulegen. Die lyophilisierten Proben wurden anschließend mit Kohlenstoffband auf einem Aluminiumstummel befestigt und mit 9 nm Gold-Palladium-Legierung (60:40) sputterbeschichtet (Hummer X Sputter Coater, Anatech USA, Union City, CA). Die beschichteten Proben wurden dann mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop Zeiss Supra 25 mit einer Beschleunigungsspannung von 5 kV, einer Apertur von 30 µm und einem durchschnittlichen Arbeitsabstand von 10 mm abgebildet (Carl Zeiss Microscopy, LLC, Thornwood, NY). ISFIs, die einer REM-Bildgebung/-Analyse mit energiedispersiver Röntgenstrahlung (EDX) unterzogen wurden, wurden mit Kohlenstoffband auf Aluminiumstummeln montiert und mit einer 3 nm dicken leitfähigen Goldbeschichtung durch Sputtern beschichtet. Die beschichteten Proben wurden dann mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop vom Typ Hitachi S-4700 bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV, einem Strahlstrom von 10 µA und einem durchschnittlichen Arbeitsabstand von 12 nm abgebildet. Die EDX-Analyse wurde mit einem am Mikroskop angeschlossenen Oxford INCA PentaFet-X3 bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV durchgeführt.

In-vitro-Freisetzungsstudien wurden ähnlich wie zuvor beschrieben20 durchgeführt. Kurz gesagt, die In-vitro-Wirkstofffreisetzungskinetik von CAB-ISFIs wurde untersucht, indem die wirkstoffbeladene Polymerlösung oder -suspension (30 ± 3 mg) in 200 ml Freisetzungsmedium (0,01 M PBS, pH 7,4 mit 2 % Solutol) injiziert und unter Spüle inkubiert wurde Bedingungen bei 37 °C. Die Zugabe von Solutol erhöht die CAB-Löslichkeit in Trennmedien und stellt so sicher, dass Sink-Bedingungen aufrechterhalten werden52. Die Sättigungslöslichkeit von CAB stieg in PBS mit 2 % Solutol im Vergleich zu PBS allein um das 4,3-fache. Sinkbedingungen wurden als maximale CAB-Konzentration in PBS definiert, wobei 2 % Solutol weniger als 1/5 der Sättigungslösung ausmacht52. Das Freisetzungsmedium wurde jede Woche vollständig entfernt und durch frisches Medium ersetzt, um die Sinkbedingungen aufrechtzuerhalten. Probenaliquots (1 ml) wurden eine Woche lang täglich und danach wöchentlich gesammelt. Die Wirkstoffkonzentration im Freisetzungsmedium wurde mittels HPLC bestimmt. Die kumulative Arzneimittelfreisetzung wurde anhand der HPLC-Analyse berechnet und durch die Gesamtmasse des Arzneimittels im Implantat normalisiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

ISFI-Stabilitätsstudien wurden in ähnlicher Weise wie zuvor beschrieben20 durchgeführt. CAB ISFI-Formulierungen wurden bei 4 °C oder in einer Glaskammer bei 40 °C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) in einem Fisher Scientific Isotemp Incubator (Pittsburgh, PA) gelagert. Die Glaskammer, in der sich die Formulierungsfläschchen befanden, enthielt eine gesättigte, salzhaltige, wässrige Natriumchloridlösung, um eine relative Luftfeuchtigkeit von 75 % bei 40 °C zu erreichen54. In die Glaskammer war ein Feuchtigkeitssensor eingebaut, um eine relative Luftfeuchtigkeit von 75 % zu überprüfen. Die Formulierungen wurden 30 und 90 Tage nach der Inkubation entfernt und Probenaliquots (1–2 mg, n = 4) gesammelt und mittels HPLC analysiert, um den Wirkstoffgehalt und einen möglichen Wirkstoffabbau zu beurteilen. Die Formulierungen wurden auch visuell auf Veränderungen in ihrem physikalischen Zustand (dh Farbe und Viskosität) untersucht. Eine In-vitro-Freisetzungsstudie nach der Lagerung wurde durchgeführt, wenn die Formulierung physikalische Stabilität (d. h. keine Verfärbung, Phasentrennung oder Ausfällung), einen ähnlichen Wirkstoffgehalt wie die Kontrolle zum Zeitpunkt 0 (<10 % Unterschied) und eine homogene Suspension zeigte.

Die GPC wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt30. Kurz gesagt wurde GPC verwendet, um den Polymerabbau von Placebo-ISFIs nach der Lagerung sowie den Polymerabbau in CAB-ISFIs zu bewerten, die 30, 60 und 90 Tage nach der Injektion von BALB/c-Mäusen entnommen wurden. Die GPC-Analyse von Placebo-ISFIs, CAB-ISFIs und reinem Polymer wurde mit einem EcoSEC Elite HLC-8420 von Tosoh Biosciences durchgeführt, das mit einer TSKgel GMH-M-Säule ausgestattet war. Die Säulenabmessungen betragen 7,8 mm × 30 cm mit einer Porengröße von 5 Mikrometern. Als mobile Phase wurde Tetrahydrofuran mit einer Flussrate von 0,5 ml/min verwendet. Das Molekulargewicht wurde relativ zu Polystyrol-Standards angegeben und mittels Brechungsindex-Detektion (RI) analysiert.

Eine 30-tägige In-vivo-Studie wurde durchgeführt, um die systemische und lokale Entzündung von CAB-ISFIs bei weiblichen BALB/c-Mäusen zu untersuchen (8–10 Wochen, Jackson Laboratory). Alle Experimente wurden nach einem genehmigten Protokoll des Animal Care and Use Committee der University of North Carolina durchgeführt. Zu den Haltungsbedingungen für Mäuse gehörte ein 12-Stunden-/12-Stunden-Hell-/Dunkel-Zyklus bei einer Umgebungstemperatur von 68–72 °Fahrenheit und 30–70 % Luftfeuchtigkeit. Mäusen wurden 50 µL der CAB ISFI-Formulierung mit einer 19-G-Nadel subkutan injiziert (n = 9 Mäuse). Zwei Mäuse erhielten keine Injektion und dienten als Kontrolle. Am 3., 7. und 30. Tag nach der Verabreichung wurden Mäuse getötet (n = 3/Zeitpunkt für CAB ISFI-Behandlungsgruppen und n = 1 Kontrollmaus am Tag 3 und 30, die keine Behandlung oder Injektion erhielten) und Blutproben entnommen B. durch Herzpunktion, wurden in Kapillarröhrchen gesammelt und bei –80 °C gelagert, um proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) durch einen enzymgebundenen Immunosorbens-Assay (ELISA, MAX.) zu quantifizieren ™ Deluxe-Sets, BioLegend®). Das ISFI wurde für die Histologie gewonnen, indem das Depot und die umgebende Haut von 1 cm mit darunterliegendem subkutanem Fett umlaufend herausgeschnitten und die gesamte Probe flach auf Karton gelegt wurde, um das Gewebe flach zu fixieren. Die Probe wurde 72 Stunden lang bei Raumtemperatur in 10 % neutral gepuffertes Formalin in einem Verhältnis von 1:10 Gewebe:Fixiermittel gelegt und dann bis zur Probenvergrößerung bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol überführt. Fixierte Hautproben wurden durch die Mitte geschnitten, wobei das Depot zentral ausgerichtet war, und die geschnittene Haut wurde hochkant in Paraffinblöcke eingebettet. Die Proben wurden auf 4 µm geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung des Autostainer XL von Leica Biosystems gefärbt. Die Schnitte wurden 2 Minuten lang mit Hämatoxylin (Richard-Allen Scientific, 7211) und 1 Minute lang mit Eosin-Y (Richard-Allen Scientific, 7111) gefärbt. Zur Differenzierung der Reaktion wurden die Lösungen Clarifier 2 (7402) und Bluing (7111) von Richard-Allen Scientific verwendet. Die Entzündung wurde von einem staatlich geprüften Veterinärpathologen wie folgt bewertet: 0: Entzündungszellen innerhalb der erwarteten Grenzen vorhanden; 1: minimale Entzündung, wenige vermehrte, verstreute Immunzellen vorhanden; 2: leichte Entzündung, kleine Ansammlungen von Immunzellen an dünnen oder lokalisierten Entzündungsspuren oder leichter Anstieg der Anzahl der Zellen, die das Depot diffus umgeben; 3, mäßige, dickere oder mehrere Entzündungsspuren oder mäßige Anzahl von Zellen, die das Depot diffus umgeben; 4, schwere, verschmelzende Entzündungsspuren, die groß genug sind, um die normale Gewebearchitektur zu ersetzen, oder eine große Anzahl von Zellen, die das Depot diffus umgeben; 5, ausgeprägte Entzündung, die ausgedehnte Bereiche der normalen Gewebearchitektur ersetzt. Lokale und systemische Entzündungen der Behandlungsgruppen wurden mit der Kontrollgruppe ohne Injektion verglichen.

Eine 90-tägige In-vivo-Studie wurde durchgeführt, um die In-vivo-Pharmakokinetik von CAB-ISFIs bei weiblichen BALB/c-Mäusen zu bewerten (8–10 Wochen, Jackson Laboratory). Alle Experimente mit Mäusen wurden nach einem genehmigten Protokoll des Animal Care and Use Committee der University of North Carolina durchgeführt. Zu den Haltungsbedingungen für Mäuse gehörte ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus bei einer Umgebungstemperatur von 68–72 °F und einer Luftfeuchtigkeit von 30–70 %. Mäusen wurden 50 µL der CAB ISFI-Formulierung mit einer 19-G-Nadel subkutan injiziert (n = 6 Mäuse). Nach 1 Stunde, 1 Tag, 3 Tagen, 7 Tagen, 30 Tagen, 60 Tagen und 90 Tagen wurde peripheres Blut von Mäusen in mit EDTA beschichteten Kapillarröhrchen gesammelt, um Plasma zu isolieren. Alle Proben wurden bis zur PK-Analyse bei –80 ° C gelagert. CAB wurde durch eine Flüssig-Flüssig-Extraktion aus Mausplasma extrahiert, gefolgt von einer Analyse mittels LC-MS/MS. Kurz gesagt, 25 μl Mausplasma wurden mit 40 μl 80:20 Wasser:Methanol, das das stabile, isotopenmarkierte 13C,2H2,15N-CAB enthielt, und 300 μl Ethylacetat gemischt. Nach dem Mischen und Zentrifugieren wurde die organische Schicht entfernt und zur Trockne eingedampft. Die Extrakte wurden vor der LC-MS/MS-Analyse mit 75 μl 75:25 Wasser mit 0,1 % Ameisensäure:Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure rekonstituiert. Die chromatographische Trennung wurde auf einer analytischen Säule Waters XTerra MS C18 (50 × 2,1 mm, 3,5 μm Partikelgröße) unter Gradientenbedingungen mit Detektion auf einem Triple-Quadruple-Massenspektrometer AB Sciex API-5000 durchgeführt. Der Kalibrierungsbereich für den Assay betrug 25–50.000 ng/ml. Kalibrierungsstandards und Qualitätskontrollproben lagen innerhalb von 15 % der Nennkonzentrationen.

Um die Fähigkeit zur sicheren Entfernung eines ISFI nach der Verabreichung im Falle unerwünschter Ereignisse zu beurteilen, wurden weiblichen BALB/c-Mäusen (8–10 Wochen, Jackson Laboratory) (n = 18) CAB-ISFIs subkutan injiziert (50 µL) und die ISFIs entfernt am Tag 30 (n = 6), 60 (n = 6) und 90 (n = 6). Alle Experimente mit Mäusen wurden nach einem genehmigten Protokoll des Animal Care and Use Committee der University of North Carolina durchgeführt. Zu den Haltungsbedingungen für Mäuse gehörte ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus bei einer Umgebungstemperatur von 68–72 °F und einer Luftfeuchtigkeit von 30–70 %. Mäuse wurden eingeschläfert und ISFIs wurden durch einen kleinen Einschnitt neben der Injektionsstelle 30 (n = 6), 60 (n = 6) und 90 Tage (n = 6) nach der Verabreichung entfernt. Am 30., 60. und 90. Tag extrahierte ISFIs wurden weiterverarbeitet, um den Massenverlust und die Abnahme des Polymermolekulargewichts durch GPC-Analyse (n = 3/Zeitpunkt) zu bewerten und den restlichen Wirkstoff zu quantifizieren (n = 3/Zeitpunkt). Um die verbleibende Arzneimittelkonzentration zu quantifizieren, wurde überschüssiges Gewebe vorsichtig von den Implantaten entfernt. Implantate wurden in ACN eingesetzt, um die Arzneimittelextraktion zu erleichtern, und die verbleibende Arzneimittelkonzentration wurde durch HPLC-Analyse quantifiziert.

Wir verwendeten Polyacrylamid-Hydrogele, um die CAB-ISFI-Injizierbarkeit bei einem ähnlichen Injektionsvolumen zu beurteilen, das nichtmenschlichen Primaten (1 ml) verabreicht wurde. Die Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogelen (40 ml) wurde an zuvor veröffentlichte Protokolle angepasst36,37. Kurz gesagt wurde ein 40-ml-Hydrogel durch Kombinieren von 40 Gew.-% einer wässrigen Acrylamidlösung (16 ml), 2 Gew.-% einer wässrigen Bisacrylamidlösung (2 ml) und 22 ml 0,01 M PBS, pH 7,4, hergestellt. Die Mischung wurde auf 4 °C abgekühlt und anschließend wurden 10 Gew.-% APS (2 ml) und 200 µL TEMED hinzugefügt und über Nacht bei 4 °C gehalten, um die Polymerisation der Lösung zu ermöglichen. 1 ml der Placebo-ISFI- oder CAB-ISFI-Formulierung wurde mit einer 16-, 18- oder 19-G-Nadel in das Hydrogel injiziert, um die Injizierbarkeit zu beurteilen.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) genehmigt. Makaken wurden im CDC unter der Obhut von CDC-Tierärzten gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht. Alle Eingriffe wurden unter Narkose durchgeführt und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Beschwerden zu minimieren, einschließlich der Bereitstellung geeigneter Unterbringungsbedingungen, Nahrungsergänzungsmitteln und reichlicher Möglichkeiten zur körperlichen Betätigung.

Weibliche Rhesusaffen erhielten subkutane Injektionen von CAB ISFI (500 mg/ml) an zwei verschiedenen Stellen im oberen Rücken (0,5–1 ml pro Stelle). Kurz gesagt, anästhesierte Tiere wurden in die ventrale Liegeposition gebracht und die halbwässrige ISFI-Suspension, geladen in einer 3-cm³-Spritze, wurde mit einer 16-G-Nadel in den subkutanen Raum verabreicht. Nach dem Entfernen der Nadel wurde kurzzeitig digitaler Druck auf die Verabreichungsstelle ausgeübt.

Um die Machbarkeit der Implantatentfernung zu beurteilen und den Medikamentenschweif zu messen, wurden ISFIs, die noch tastbar waren, operativ von zwei Makaken in Woche 12 (RA-1097 und RA-1093; jeweils 2 Implantate) und von einem Tier in Woche 14 (RH-) entfernt. 42012; 1 Implantat wiederhergestellt). Die Tiere wurden in Bauchlage gebracht und die Implantatpositionen wurden durch digitales Abtasten bestätigt. Mit einem chirurgischen Skalpell wurde über jedem Implantat ein einzelner Hautschnitt (ca. 1 Zoll) vorgenommen. Das ISFI-Material wurde sorgfältig vom umgebenden Bindegewebe getrennt und mit einer Pinzette größtenteils intakt gewonnen. Die Inzisionsstelle wurde visuell auf Anomalien untersucht und anschließend mit steriler Kochsalzlösung gespült, bevor sie mit Polydioxanon-Nähten verschlossen wurde. Die Tiere wurden wöchentlich von betreuenden Tierärzten überwacht, um die Operationsstellen auf eine ordnungsgemäße Wundheilung zu prüfen und sicherzustellen, dass keine Anzeichen einer lokalen Infektion vorliegen.

Für die longitudinale PK-Bewertung erhielten sechs weibliche Rhesusaffen CAB-ISFIs, gefolgt von Messungen des Arzneimittelspiegels im Blutplasma sowie im rektalen und vaginalen Gewebe. Fünf der Tiere erhielten zwei 1-ml-Injektionen (insgesamt 1000 mg CAB) und ein Tier (RH-1080) erhielt Injektionsvolumina von 1 und 0,5 ml (insgesamt 750 mg CAB). Die CAB-Spiegel wurden bis zu 11 Monate lang wöchentlich im Plasma und in den Geweben in den Wochen 4, 8 und 12 mithilfe einer validierten LC-MS-Methode gemessen, wie zuvor beschrieben55. Von den Makaken RH-42012, RA-1048 und RA-1080 wurden in den Wochen 4, 8 und 12 rektale und vaginale Biopsien entnommen. Die untere Bestimmungsgrenze lag bei 1 ng/mg bzw. 10 ng/ml für Biopsie und Plasma .

Wir verwendeten ein SHIV162P3-Rektalprovokationsmodell mit wiederholter Exposition, das die klinische Wirksamkeit aller derzeit zugelassenen PrEP-Therapien vorhersagte56. SHIV162P3 wurde aus dem NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (ARP-6526) bezogen und in Rhesusaffen-PBMCs vermehrt. Die endgültige Belastungslösung wurde auf 10 TCID50 verdünnt und einzeln als 1-ml-Aliquots in flüssigem Stickstoff gelagert und vor jeder rektalen Belastung aufgetaut. In diesem Modell werden unbehandelte Kontroll-Rhesusaffen, die 10 TCID50 von SHIV162p3 ausgesetzt waren, nach durchschnittlich zwei Infektionen infiziert56,57. In der Studie wurden sechs weibliche Rhesusaffen verwendet (10 Jahre alt; 7–11 kg). Vier erhielten CAB-ISFIs implantiert und wurden zweimal pro Woche rektal SHIV162p3 ausgesetzt, während die CAB-Konzentrationen über dem vierfachen proteinbereinigten IC90 (4× PA-IC90) lagen. Davon wurden zwei zwischen der 4. und 8. Woche nach der Implantation provoziert, was insgesamt jeweils acht SHIV-Provokationen ergab. Die CAB-ISFI-Depots wurden in Woche 12 chirurgisch von beiden Tieren entfernt, um den Drogenschwanz zu messen, und während der Drogenauswaschphase auf eine SHIV-Infektion überwacht. Die verbleibenden zwei Tiere wurden zwischen der 14. und 18. Woche zweimal pro Woche herausgefordert; Eines dieser Tiere (RH-1048) erhielt zwischen der 25. und 28. Woche sechs zusätzliche Provokationen. Das Infektionsergebnis der mit CAB behandelten Tiere in jeder Gruppe wurde mit zwei unbehandelten Tieren verglichen, die gleichzeitig mit derselben SHIV162p3-Stammlösung und derselben Dosis provoziert wurden. Während der Herausforderungen und der Nachbeobachtungsphase wurde wöchentlich Blut für diagnostische Tests gesammelt. SHIV-RNA im Plasma wurde durch einen RT-PCR-Assay mit einer Empfindlichkeit von 50 RNA-Kopien/ml quantifiziert. Virusspezifische serologische Reaktionen wurden mithilfe eines synthetischen Peptid-Enzym-Immunoassays (BioRad, Genetic Systems HIV-1/HIV-2, Redmond, WA) gemessen56. Tiere galten als geschützt, wenn sie während der SHIV-Provokationen und einer Nachbeobachtungszeit von 16 Wochen seronegativ und viral-RNA-negativ waren.

Wöchentliche Gesundheitschecks wurden wöchentlich durchgeführt, um die Sicherheit und Verträglichkeit von CAB ISFI-Implantaten zu beurteilen. Zu den körperlichen Untersuchungen gehörten die Überwachung des Gewichts der Tiere, des allgemeinen Gesundheitszustands und eine gründliche Untersuchung der Umgebung der Implantate auf sichtbare Hautreaktionen (ergänzende Abbildung 8). Erytheme und Ödeme wurden anhand der Draize-Skala visuell bewertet und mit einer Bewertung von 0 (keine Reaktion) bis 4 (schwere Reaktion)58 bewertet.

Während der Implantatentfernung wurden zwei chirurgische 3-mm-Hautbiopsien im mittleren und kranialen Bereich der Implantatstelle entnommen, um den Medikamentenspiegel zu messen und eine histologische Beurteilung zu ermöglichen. Eine Biopsie wurde gewogen und zur Prüfung des Drogenspiegels schockgefroren, die andere wurde zur histologischen Untersuchung in 10 % Formalin fixiert. In Formalin gelagerte Biopsien wurden halbiert, eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die Schnitte wurden auf Art und Intensität der Entzündung sowie auf die Häufigkeit von Fibrose und das Vorhandensein von Nekrose untersucht. Die Schnitte wurden verblindet und unabhängig voneinander von zwei Veterinärpathologen beurteilt. Wir verwendeten einen halbquantitativen Score basierend auf ISO-Richtlinien (ISO 10993-6:2007) für Entzündungszellen, einschließlich Neutrophile, Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, Eosinophile und reaktive Fibroblasten in der Dermis sowie im subkutanen Gewebe und Fibroblasten. Die Verteilung und der Schweregrad der Infiltration durch jeden Zelltyp wurden auf einer Skala von 0–5 bewertet, wobei 0 für keine vorhandenen Zellen und 5 für eine umfassende Infiltration durch den spezifischen Zelltyp steht.

Jedes Implantat (links und rechts) wurde aus dem Gewebe entnommen und dann in einer sterilen BSL2+-Umgebung in ACN platziert. Anschließend wurde die Probe aus der sterilen Umgebung entnommen und in einen Schüttelinkubator gestellt. Probenaliquots (1 ml, n = 3) aus der Extraktionslösung wurden gesammelt und mittels HPLC analysiert.

Um die Schätzung der CAB-ISFI-Eingaberaten bei Makaken zu unterstützen, wurden die individuellen CAB-Clearance-Raten von NCA unter Verwendung der linearen Up-Log-Down-Trapezregel in Phoenix WinNonlin v8.3 für 4 Tiere geschätzt, wobei die Plasmakonzentrationen über 98 bis 329 Tage nach der ISFI-Verabreichung gesammelt wurden ( Ergänzende Abbildung 9). Diese Schätzung konnte für die beiden Tiere (RH-1093 und RH-1097), deren Implantate 84 Tage nach der Verabreichung entfernt wurden, nicht durchgeführt werden. Daher wurde AUCINF basierend auf der Gleichung \(f=\left(\right.{C}_{{last}}+\left({kel}*{{AUC}}_{{last}}\right) abgeleitet. /({kel}*{{AUC}}_{{INF}})\)59 wobei f der Bruchteil der absorbierten Dosis ist (d. h. geladene Masse – Restmasse) und kel basierend auf Daten auf 0,173 h-1 festgelegt wurde berichtet im neuen Arzneimittelantrag39. Die Clearance wurde dann berechnet durch \({Cl}=({Dose}*F)/({{AUC}}_{{INF}})\). Bei allen Berechnungen wurde die Bioverfügbarkeit (F) über angenommen Der SQ-Verabreichungsweg betrug 100 %, was mit den Annahmen übereinstimmt, die für gemeldete Populations-PK-Modelle der LA CAB IM-Injektion verwendet wurden39.

Um den Vergleich der Eingaberaten von CAB ISFI und CAB LA bei Makaken zu unterstützen, wurde die Software Quintessa Graph Grabber v2.0.2 verwendet, um PK-Daten aus einem veröffentlichten Konzentrations-Zeit-Diagramm von 9 Makaken zu extrahieren, denen zwei 50 mg/kg IM-Injektionen von CAB LA über 6 Tage verabreicht wurden auseinander38. NCA wurde wie oben verwendet, um die Clearance einzelner Tiere unter der Annahme eines Gewichts von 8 kg abzuschätzen.

Statistische Analysen wurden in GraphPad Prism Version 9.4 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Um Unterschiede in den In-vitro-CAB-Freisetzungsprofilen bei Variation der Wirkstoffbeladung und des PLGA-Molekulargewichts zu analysieren, wurden ein Zwei-Wege-ANOVA-Test und ein Tukey-Mehrfachvergleichstest in Bezug auf Zeitpunkt und Formulierung durchgeführt. Um Unterschiede in den In-vitro-CAB-Freisetzungsprofilen nach der Lagerung im Vergleich zum Ausgangswert zu analysieren, wurden ein Zwei-Wege-ANOVA-Test und ein Tukey-Mehrfachvergleichstest in Bezug auf Zeitpunkt und Lagerungsbedingungen durchgeführt. Ein Zwei-Wege-ANOVA-Test und ein Sidak-Mehrfachvergleichstest wurden in Bezug auf den Zeitpunkt und die TNF-α- und IL-6-Konzentrationen im Plasma durchgeführt, um Unterschiede in der systemischen Entzündung in vivo mit der Kontrollgruppe ohne Injektion zu analysieren. Für alle statistischen Tests wurde ein P-Wert von <0,05 als signifikant angesehen (95 % Konfidenzniveau).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

In diesem Dokument werden Quelldaten bereitgestellt, die den Abbildungen 1a–c, 2a, c, 3e, 7b–d sowie den ergänzenden Abbildungen 1a–c und 2a, b zugrunde liegen. Alle weiteren Daten werden im Papier bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases (Fördernummer R01AI131430 für SRB und MK, R01AI162246 für SRB, R01AI140799 für JVG), dem National Center for Advancing Translational Science (Fördernummer KL2TR001109-04 für SRB) und der University of North unterstützt Carolina am Chapel Hill Center for AIDS Research (P30 AI050410) und im Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation (Stipendiennummer DGE-1650116 an ICY). Für den Inhalt sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of Allergy and Infectious Diseases wieder. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen dieses Manuskripts stammen von den Autoren und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten wieder. Wir möchten dem UNC Animal Studies Core (ASC) für die Unterstützung bei den Maus-ISFI-Injektionen, dem UNC Clinical Pharmacology and Analytical Chemistry Core (CPAC), insbesondere Lauren Tompkins und Brian Van Horne, und dem Chapel Hill Analytical and Nanofabrication Laboratory (CHANL) danken ) für die Unterstützung bei der SEM-EDX-Analyse, insbesondere Amar Kumbhar.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Isabella C. Young, Ivana Massud.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Gerardo Garcίa-Lerma, S. Rahima Benhabbour.

Abteilung für Pharmakotechnik und Molekularpharmazeutik, Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Isabella C. Young & S. Rahima Benhabbour

Laborabteilung, Abteilung für HIV-Prävention, Nationales Zentrum für HIV/AIDS, Virushepatitis, sexuell übertragbare Krankheiten und Tuberkuloseprävention, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Ivana Massud, Andrew Wong-Sam, Chuong Dinh, Tiancheng Edwards, James Mitchell, Walid Heneine, Charles W. Dobard und J. Gerardo Garca-Lerma

Abteilung für Pharmakotherapie und experimentelle Therapeutika, Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Mackenzie L. Cottrell, Amanda Schauer, Craig Sykes und Angela DM Kashuba

Gemeinsame Abteilung für Biomedizintechnik der North Carolina State University und der University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Roopali Shrivastava, Panita Maturavongsadit, Alka Prasher, Allison Thorson und S. Rahima Benhabbour

Abteilung für Vergleichende Medizin, Abteilung für wissenschaftliche Ressourcen, National Center for Emerging and Zoonotic Infection Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Victoria Mrotz

Abteilung für Pathologie von Infektionskrankheiten, Abteilung für Krankheitserreger mit hoher Konsequenz und Pathologie, National Center for Emerging and Zoonotic Infection Diseases, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA

Josilene Nascimento Seixas

Abteilung für Psychologie und Neurowissenschaften, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Aryani Pallerla

Pathology Services Core, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, Chapel Hill, NC, USA

Gabriela De la Cruz und Stephanie A. Montgomery

Internationales Zentrum zur Förderung der translationalen Wissenschaft, Abteilung für Infektionskrankheiten, Zentrum für AIDS-Forschung, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA

Martina Kovarova & J. Victor Garcia

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Konzeptualisierung: SRB, JGG-L., IM, CWD, JVG, MK Methodik: JGG-L., SRB, IM, ICY, CWD, PM, AP, MLC, SAM, GDCUntersuchung: ICY, IM, CWD, PM, AP , RS, AW-S., CS, JM, AT, AP, AS, CD, MLC, SRB, JGG-L. Visualisierung: ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L,. TE, VM, JNS Finanzierungseinwerbung: SRB, JGG-L., JVG, MK Projektverwaltung: SRB, JGG-L., JVG, MK, ADMK, WH Betreuung: SRB, JGG-L., JVG, ADMK Schreiben – Original Entwurf: ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L., MLC, CS, SAM, Schreiben – Rezension und Bearbeitung: ICY, IM, CWD, SRB, JGG-L., JVG, MK, WH

Korrespondenz mit J. Gerardo Garcίa-Lerma oder S. Rahima Benhabbour.

SRB, ICY, RS und PM sind Erfinder eines Patents, das die injizierbare Arzneimittelformulierung auf Polymerbasis für die Arzneimittelabgabe mit extrem langer Wirkungsdauer beschreibt. JGG-L. und WH sind in den USA benannt. Regierungspatente zum Thema „Hemmung der HIV-Infektion durch Chemoprophylaxe“. JGG-L.,. IM und WH sind in den USA benannt. Regierungspatent zur „HIV-Postexpositionsprophylaxe“ und ein US-Patent. Regierungspatentanmeldung zum Thema „HIV-Präexpositionsprophylaxe“. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Cristian Apetrei und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Young, IC, Massud, I., Cottrell, ML et al. Ultralang wirkende in-situ-bildende Implantate mit Cabotegravir schützen weibliche Makaken vor einer rektalen SHIV-Infektion. Nat Commun 14, 708 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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Eingegangen: 16. September 2022

Angenommen: 24. Januar 2023

Veröffentlicht: 09. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36330-5

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