Ein neuartiges inaktiviertes Virussystem (InViS) zur schnellen und kostengünstigen Beurteilung des Viruszerfalls

Oct 23, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11583 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die COVID-19-Pandemie hat weltweit großes Interesse an antiviralen Oberflächen geweckt und die Forschung und Entwicklung innovativer Materialsysteme zur Reduzierung der Virusübertragung hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen. Die Normen 18.184 und 21.702 der International Organization for Standardization (ISO) sind zwei Standardmethoden zur Charakterisierung der antiviralen Eigenschaften poröser und nichtporöser Oberflächen. In den letzten Jahren der Pandemie wurde jedoch ein Bedarf an einer schnelleren und kostengünstigeren Charakterisierung antiviraler Materialien erkannt. Daher wurde eine ergänzende Methode basierend auf einem inaktivierten Virussystem (InViS) entwickelt, um die frühe Entwicklung antiviraler Technologien und die Qualitätsüberwachung der Produktion antiviraler Materialien sicher und effizient zu erleichtern. Das InViS ist mit einem selbstlöschenden Fluoreszenzfarbstoff beladen, der einen messbaren Anstieg der Fluoreszenz erzeugt, wenn die Virushülle zerfällt. In der vorliegenden Arbeit wird die Empfindlichkeit von InViS gegenüber dem viralen Zerfall durch bekannte antivirale Wirkstoffe demonstriert und sein Potenzial zur Charakterisierung neuartiger Materialien und Oberflächen untersucht. Schließlich wird das InViS verwendet, um das Schicksal viraler Partikel in den Schichten von Gesichtsmasken zu bestimmen, was es zu einem interessanten Werkzeug zur Unterstützung der Entwicklung antiviraler Oberflächensysteme für technische und medizinische Anwendungen macht.

Was im Dezember 2019 in Wuhan als mysteriöse und unbekannte Lungenkrankheit begann, hat sich zu einer schweren Pandemie ähnlich der „Spanischen Grippe“ entwickelt: COVID-19. Auslöser ist das Beta-Coronavirus SARS-CoV-2, das für verschiedene Symptome wie Hals- und Atemwegsentzündungen, Husten, Atemnot, Müdigkeit, Fieber, Myalgie, Bindehautentzündung, Geruchsverlust und Geschmacksstörungen verantwortlich ist. In schweren Fällen kann es zu akutem Lungenversagen, Multiorganversagen und Tod kommen1.

Mit Stand Juni 2022 hat die Zahl der bestätigten COVID-19-Fälle weltweit 529 Millionen erreicht und die Zahl der Todesfälle ist auf über 6 Millionen gestiegen2. Obwohl inzwischen wirksame Impfstoffe und bessere Behandlungsstrategien entwickelt wurden, bringen neue hochansteckende Mutationen und niedrige Impfraten in armen Ländern die Gesundheitssysteme weiterhin an ihre Grenzen. Daher bleiben nicht-pharmazeutische Maßnahmen wie Kontaktreduzierung, Hygiene und Gesichtsmasken wichtig, um die Ausbreitung des Virus in Schach zu halten3.

Das übergeordnete Ziel dieser Maßnahmen besteht darin, die Übertragung von Krankheiten zwischen Menschen zu verlangsamen. COVID-19 verbreitet sich hauptsächlich durch Tröpfcheninfektion unter Menschen, die in engem Kontakt miteinander stehen4. Es sind jedoch auch andere Mechanismen der Krankheitsübertragung möglich. Beispielsweise kann eine Aerosolübertragung in Innenräumen in überfüllten und schlecht belüfteten Räumen erfolgen, und es ist auch möglich, sich indirekt mit COVID-19 anzustecken, indem man mit dem Virus kontaminierte Oberflächen oder Gegenstände infizierter Personen berührt und anschließend die Augen, die Nase oder den Mund berührt (Fomite). Übertragung)4. Es hat sich gezeigt, dass SARS-CoV-2 abhängig von der Chemie der Oberfläche, auf der sich das Virus ablagert, einige Stunden bis Tage stabil ist. Beispielsweise haben van Doremalen et al. zeigten, dass SARS-CoV-2 mehrere Stunden lang auf Kunststoff- und Edelstahloberflächen stabil blieb. Lebensfähige Viren konnten bis zu 72 Stunden nach der Anwendung auf diesen Oberflächen nachgewiesen werden, und die Halbwertszeit von SARS-CoV-2 wurde auf 5,6 Stunden auf Edelstahl und auf 6,8 Stunden auf Kunststoff geschätzt5. Im Gegensatz dazu konnte auf Kartonoberflächen nach 24 Stunden kein lebensfähiges Virus mehr nachgewiesen werden, und Kupferoberflächen neigten dazu, das Virus innerhalb von 4 Stunden zu inaktivieren5. Chin et al. bestätigten, dass SARS-CoV-2 auf glatten und hydrophoben Oberflächen stabiler ist. Während nach 3 Stunden kein infektiöses Virus aus Druck- und Gewebekulturpapieren nachgewiesen werden konnte, waren nach 2 Tagen noch lebensfähige und infektiöse Viren auf behandelten glatten Oberflächen (Glas und Banknoten), nach 4 Tagen auf Edelstahl und Kunststoff sowie auf der hydrophoben Außenseite vorhanden Schicht einer chirurgischen Maske nach 7 Tagen6.

Da diese hohe Oberflächenstabilität das Risiko einer Schmierinfektion erhöht, wäre es von großem Vorteil, wenn Viruspartikel, die anfällige Oberflächen wie Touchscreens, Türklinken, Lüftungsfilter, Textilien, Zugsitze oder Handläufe erreichen, ohne weitere Desinfektionsprozesse sofort inaktiviert werden könnten. Das Gleiche gilt auch für auf Gesichtsmasken abgelagerte Viruspartikel, da eine unsachgemäße Handhabung von Masken ein häufiges Problem darstellt.

Daher ist die Entwicklung antiviraler Materialien, Beschichtungen und Gesichtsmasken von enormer Bedeutung, nicht nur zur Bekämpfung von COVID-19, sondern auch zur Verhinderung ähnlicher Pandemien oder Epidemien in der Zukunft.

Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Viren zu inaktivieren oder sogar zu zerstören. Am bekanntesten sind Detergenzien oder Ethanollösungen, die die Lipid- und Proteinstruktur des Virus auflösen7,8,9,10, Strahlung wie ultraviolettes Licht mit einer Wellenlänge zwischen 200 und 300 nm (UVC)11,12,13 und thermische Behandlung wie Autoklavieren14 ,15, Oxidation16,17 oder hohe positive Oberflächenladung18,19. Bei der Entwicklung neuer antiviraler Materialien ist es von entscheidender Bedeutung, ihr Potenzial zum Einfangen, Inaktivieren und/oder Abtöten der Viren zu untersuchen und zu quantifizieren. Derzeit sind zwei ISO-Normen verfügbar, die die Messung der antiviralen Aktivität auf Kunststoffen und anderen nicht porösen Oberflächen (ISO 21702) sowie die Bestimmung der antiviralen Aktivität von Textilprodukten (ISO 18184) regeln. In beiden Normen muss der Titer des infektiösen Virus entweder durch einen Plaque-Assay oder die Methode der mittleren Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) bestimmt werden. Beide Tests erfordern die Arbeit mit dem echten infektiösen Virus und basieren auf dem Prinzip, dass die durch das Virus verursachten zytopathischen Wirkungen in vitro sichtbar beurteilt werden können. Obwohl diese Tests zuverlässige und vergleichbare Ergebnisse zur antiviralen Aktivität der Materialien liefern, haben sie mehrere Nachteile: Die Arbeit mit echten Viren wie z. B. SARS-CoV-2 erfordert eine spezielle Infrastruktur (z. B. mit Biosicherheitsstufe 3 ausgestattete Labore) und geschultes Personal. Dies verhindert den breiten Einsatz dieser Analysen in den meisten Industrie- und Forschungsumgebungen und verzögert folglich die schnelle Entwicklung neuartiger antiviraler Materialien, wie sie während der aktuellen COVID-Pandemie beobachtet wurde. Daher sind neuartige Charakterisierungsmethoden dringend erforderlich, um ein schnelles, kostengünstiges und sicheres Vorscreening einer großen Anzahl von Materialien und Oberflächen auf potenzielle antivirale Eigenschaften zu ermöglichen.

In dieser Arbeit wird ein mit inaktiviertem Octadecylrhodamin R18 beladenes A/Brisbane 59/2007 Influenzavirussystem (InViS) als Ersatz für ein infektiöses Virus genutzt, um den viralen Zerfall durch einfache Fluoreszenzmessungen zu beurteilen. Dieses neuartige Virussystem ermöglicht die Untersuchung der antiviralen Wirkung verschiedener Chemikalien, Reinigungsmittel und Materialien auf einfache Weise: Die Fluoreszenz nimmt zu, wenn Viruspartikel zerfallen, da die Fluoreszenzsonde innerhalb der intakten Lipidstruktur des Virus selbst gelöscht wird (Abb. 1). .

InViS, ein fluoreszierender Ansatz zur Erkennung des durch antivirale Materialien verursachten Zerfalls der Virushülle.

In dieser Studie haben wir die Anwendungsbereiche, die Vorhersagekraft und die Grenzen dieses neuartigen InViS als alternative Vorscreening-Methode untersucht und definiert, indem wir die Wirkung antiviraler Chemikalien (70 % Ethanol, Zitronensäure) und verschiedener potenzieller antiviraler Nanopartikel (NPs) analysiert haben. und Oberflächenbeschichtungen. Darüber hinaus nutzten wir den Einsatz von InViS, um das Schicksal und die Lokalisierung von Viruspartikeln in Gesichtsmaskenschichten zu bewerten und zu quantifizieren.

Die Inaktivierung von Viren und die Beladung mit Fluoreszenzfarbstoffen20 sind etablierte Verfahren in der Impfstoffforschung. Hier untersuchen wir das Potenzial eines solchen inaktivierten Virus im Bereich der antiviralen Charakterisierung. Das in dieser Arbeit verwendete inaktivierte Virussystem (InViS) besteht aus einer mit inaktiviertem Octadecylrhodamin (R18) markierten Influenzaviruslösung A/Brisbane/2007, deren Fluoreszenz bei Membranbruch oder -fusion zunimmt21.

Die gemessene Viruskonzentration betrug 1,5 × 1013 (± 9,8 × 1010) Partikel mL−1 und die Viruspartikel wiesen eine sehr homogene Größe von 110,6 ± 0,8 nm auf. Die Fluoreszenzmarkierung im Inneren des Virus wurde selbst gelöscht und die Fluoreszenz des intakten Virus betrug nur 23 % der Fluoreszenz nach Zugabe des Detergens Octaethylenglykolmonododecylether (OEG) (Abb. 2A). Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestätigten, dass das Detergens die Viruspartikel schädigte und zu deren Zerfall führte. Während das InViS-System vor der Verabreichung des Detergens monodispers war (Polydispersitätsindex (PdI) von 0,063 ± 0,023), führte die Zugabe von OEG zu einer hochpolydispersen Probe (PdI von 0,443 ± 0,048), wobei kleinere und größere Peaks wahrscheinlich Virusfragmenten entsprachen agglomerierte Virusstrukturen und Detergensmizellen (Abb. 2B). Daher könnte das InViS-System verwendet werden, um viral zersetzende Eigenschaften von Chemikalien und Materialien durch eine schnelle und einfache Fluoreszenzauslesung zu bewerten. Die Nachweisgrenze (definiert als die Partikelkonzentration, bei der der virale Zerfall nicht mehr durch einen Anstieg der Fluoreszenz gegenüber der Grundlinienreaktion des Instruments nachweisbar ist) wurde durch Reihenverdünnungen bestimmt und betrug 108 Partikel ml−1.

Wirkung von OEG auf InViS. (A) Die Fluoreszenzintensität von InVis wurde kontinuierlich über 300 s überwacht. Nach 280 s wurde der Probe OEG zugesetzt, um den Zerfall des Virus und die Freisetzung der fluoreszierenden R18-Markierung aus der Virusmembran zu induzieren. (B) Partikelgrößenverteilung gemessen durch DLS vor und nach der Reinigungsmittelverabreichung. Das intakte InViS ist stark monodispers. Bei Kontakt mit Reinigungsmittel zerfällt das Virus, was zu mehreren Populationen von Restaggregaten und einem höheren Polydispersitätsindex führt.

Um zu überprüfen, dass InViS nicht nur empfindlich gegenüber Reinigungsmitteln ist, sondern auch andere bekannte antivirale Verbindungen mit unterschiedlicher antiviraler Wirksamkeit erkennen kann, haben wir weitere Experimente mit 70 % Ethanol und Zitronensäure (1 M) durchgeführt. Beide Chemikalien führten zu einem signifikanten Anstieg der Fluoreszenzsignalintensität (Abb. 3). Allerdings induzierte das milde antivirale Mittel Zitronensäure22 (pH 2,95) nur eine teilweise Freisetzung der R18-Markierung, während bei Zugabe von 70 % Ethanol eine fast vollständige Freisetzung ähnlich der positiven Waschmittelkontrolle festgestellt wurde.

Fluoreszenzintensität von InViS nach Inkubation mit Zitronensäure (1 M) und 70 % Ethanol. Als Negativ- bzw. Positivkontrolle dienten InViS in PBS und mit OEG behandeltes InViS. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert und die entsprechenden Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei Wiederholungen dar. $p < 0,01, £p < 0,001 im Vergleich zu Negativkontrollen.

Verschiedene Studien haben gezeigt, dass mehrere NPs, darunter Kupferoxid (CuO), Zinkoxid (ZnO), Titandioxid (TiO2), Gold (Au), Silber (Ag), Selen (Se) und Graphenoxid (GO), antivirale Eigenschaften besitzen23. 24,25,26,27,28,29, doch die zugrunde liegenden Toxizitätsmechanismen sind oft nicht vollständig verstanden. Um zu untersuchen, ob die antiviralen Mechanismen dieser NP-Typen möglicherweise den Zerfall von Viren umfassen, inkubierten wir InViS mit unterschiedlichen NP-Konzentrationen für 2 und 24 Stunden und maßen die Fluoreszenzintensitäten, um die mögliche Freisetzung der fluoreszierenden R18-Markierung festzustellen. Keines der untersuchten NPs war in der Lage, die InViS-Hülle zu zerstören, da die Fluoreszenzniveaus nicht anstiegen und mit der Negativkontrolle (intaktes InViS ohne NPs) vergleichbar waren (Abb. 4). Bei steigenden NP-Konzentrationen kam es sogar zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu unbehandelten Kontrollproben. Obwohl NPs vor den Fluoreszenzmessungen durch Zentrifugation entfernt wurden, um mögliche Interferenzreaktionen zu vermeiden, führten wir weitere Interferenzstudien durch, die das Fehlen von NP-Autofluoreszenzsignalen oder unspezifischen Auswirkungen auf die Fluoreszenzmessungen bestätigten (Daten nicht gezeigt).

Fluoreszenzintensität nach Inkubation von InViS mit NPs. NP-Suspensionen wurden 2 und 24 Stunden lang mit InViS-Lösung inkubiert und die Suspensionen wurden dann vor den Fluoreszenzmessungen zentrifugiert, um NPs zu entfernen. Die Negativkontrolle ist InViS in PBS (0,4 % v/v) und die Positivkontrolle ist InViS in PBS (0,4 % v/v) und OEG (1,25 mg mL−1). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert und die entsprechenden Standardabweichungen von mindestens drei unabhängigen Experimenten mit zwei technischen Wiederholungen pro Experiment dar. *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 und #p < 0,0001 im Vergleich zur Negativkontrolle.

Nach der Evaluierung des InViS-Systems zur Erkennung antiviraler Wirkungen von Chemikalien und NPs haben wir seine Eignung zur Erkennung des antiviralen Potenzials von Oberflächen und Beschichtungen weiter bewertet. Um eine flache und porenfreie antivirale Oberfläche zu erhalten, wurden sterile Zellkulturplatten mit einer neuartigen antiviralen Beschichtungslösung (Patentnummer PCT/EP2021/06058030) beschichtet. Das InViS wurde entweder mit der beschichteten Oberfläche oder der flüssigen Form der Beschichtungslösung in Kontakt gebracht und in beiden Fällen konnte ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenzintensität festgestellt werden (Abb. 5), was eindeutig auf den Zerfall der Viruskapsel hinweist.

Fluoreszenzintensität von InViS nach Kontakt mit einer antiviralen Beschichtung. Sowohl die flüssige als auch die beschichtete Form einer antiviralen Beschichtungslösung (Patentnummer PCT/EP2021/06058030) führen zu einem deutlichen Anstieg der Fluoreszenz, was auf einen Zerfall der Viruskapsel hinweist. Die Fluoreszenzniveaus des intakten InViS in PBS und des mit OEG inkubierten InViS dienten als Negativ- bzw. Positivkontrolle. Die Ergebnisse stellen den Median und die entsprechenden Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten mit zwei technischen Wiederholungen dar. $p < 0,01 und £p < 0,001 im Vergleich zur Negativkontrolle.

Neben der Erkennung des Viruszerfalls haben wir die Hypothese aufgestellt, dass das InViS-System auch dazu geeignet sein kann, das Schicksal und die Lokalisierung von Viruspartikeln in mehrschichtigen Gesichtsmasken und Textilien zu erkennen. Dies sind äußerst wertvolle Informationen, um zu verstehen, welche Schicht(en) eine starke antivirale Aktivität aufweisen müssen. Wir haben ein Filtereffizienz-Testsystem verwendet, um textile Community-Masken, chirurgische Masken und FFP2-Masken (wie in der Norm EN149 definiert, entspricht der US-Norm N95-Atemschutzmaske) Aerosolen auszusetzen, die InViS enthalten. Zum Vergleich wurde auch die Prüfung der Filtrationseffizienz mit Salzlösungen durchgeführt, die dem aktuellen europäischen Standardverfahren (EN13274-7) zur Beurteilung der Filtrationseffizienz von Textilien entspricht. Nach dem Filtrationstest wurden die verschiedenen Maskenschichten abgezogen und die Lokalisierung der Partikel mittels Rasterelektronenmikroskop (REM) (Salz und InViS; nur textile Community-Masken) und Fluoreszenzmessungen (nur InViS; alle Maskentypen) beurteilt.

Gezeigt werden Mikroaufnahmen der äußeren gewebten Schicht (Abb. 6A, A', B) und der inneren schmelzgeblasenen Schicht (Abb. 6C, C', D, D', F–H) einer Community-Maske vor und nach den Tests zur Filtrationseffizienz mit Salz oder InViS-Partikeln. Zusätzlich wurde ein SEM von InViS auf einem TEM-Gitter (Abb. 6E) einbezogen, um die Identifizierung viraler Partikel in den Maskenschichten zu erleichtern. Die InViS-Partikel erschienen monodispers mit einer Größe von etwa 100 nm, während die Salzkristalle größer wirkten.

Lokalisierung von NaCl- und InViS-Partikeln in textilen Community-Masken nach Tests zur Filtrationseffizienz. Mikroaufnahmen nach dem Filtrationseffizienztest mit NaCl zeigen: (A) die äußerste gewebte Schicht einer Textilmaske, (B) eine Pore der äußersten gewebten Schicht nach dem Filtrationstest mit NaCl-Partikeln, (C) die innere schmelzgeblasene Filterschicht und ( D) Salzpartikel, die durch die innere Meltblown-Filtrationsschicht gefiltert werden. (A'–D') stellen Vergrößerungen des weißen Quadranten in (A–D) dar (mit Ausnahme von C', das aus einem anderen Bereich stammt, der in C nicht sichtbar ist). Mikroaufnahmen nach dem Filtrationseffizienztest mit InVIS zeigen: (E) REM-Aufnahme von InViS auf einem Rasterprobenhalter des Transmissionselektronenmikroskops (TEM), (F) und (G) die innere schmelzgeblasene Filtrationsschicht (Salzkristalle und InViS-Partikel sind mit Pfeilspitzen hervorgehoben). bzw. Pfeile). (H) ist eine Referenzfaser aus der inneren Meltblown-Schicht, die keinen Filtrationsexperimenten unterzogen wurde.

Während der Filtereffizienzexperimente wurde die Luft zunächst durch die Poren in der äußeren gewebten Schicht der Masken geleitet, wo eine bevorzugte Ansammlung von Salzpartikeln in der Nähe der Poren beobachtet wurde, während die meisten Fasern der äußeren Schicht frei von Partikeln waren (Abb. 6B). ,B'). In der äußeren Gewebeschicht wurden keine InViS-Partikel beobachtet. Als nächstes erreichte die Luft die innere schmelzgeblasene Schicht, die eine beträchtliche Ansammlung von Salz- (Abb. 6D) und InViS-Partikeln (Abb. 6F, G) aufwies. Um die bevorzugte Lokalisierung von InViS-Partikeln in der inneren Meltblown-Schicht auf halbquantitative Weise weiter zu bestätigen, wurden ergänzende Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Daher wurden die verschiedenen Maskenschichten mit Ethanol behandelt, um das Rhodamin aus dem adsorbierten InViS freizusetzen. Die Fluoreszenzintensität entsprechend jeder Schicht für chirurgische, textile und eine FFP2-Gesichtsmaske ist in Abb. 7A,B dargestellt. Dieses Auswaschen führte zum Zerfall von InViS, ermöglichte aber dennoch die Quantifizierung der Viruspartikel in jeder Schicht, da die Fluoreszenzintensität proportional zur Menge der gefilterten Viruspartikel ist.

Fluoreszenzintensität der verschiedenen Schichten einer textilen, chirurgischen (A) und FFP2-Maske (B) nach der Prüfung der Filtrationseffizienz mit InViS. Der Luftstrom strömte von rechts nach links (von der äußeren zur inneren Schicht). Bei der EtOH-Kontrolle handelt es sich ausschließlich um den Fluoreszenzwert der Ethanollösung. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert und die entsprechenden Standardabweichungen aus drei unabhängigen Experimenten mit zwei technischen Wiederholungen dar. *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 und #p < 0,0001 im Vergleich zu Kontrollen.

Die schwere COVID-19-Pandemie hat das Leben der Menschen in den letzten 2,5 Jahren dramatisch verändert. Früher selbstverständliche Dinge wie ein regulärer Job im Büro, Freunde treffen, kulturelle Veranstaltungen besuchen und Reisen waren plötzlich nicht mehr möglich. Lockdowns zwangen Menschen auf der ganzen Welt dazu, zu Hause zu bleiben, und wirkten sich negativ auf die Wirtschaft aus. Die Gesundheitssysteme stießen an ihre Kapazitätsgrenzen und viele Menschen erlitten schwere Krankheiten oder starben sogar. Um die Pandemie zu bekämpfen, arbeiteten viele Forscher und Kliniker unter großem Druck daran, die Krankheit zu verstehen und wirksame Impfstoffe und Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln. Parallel dazu arbeitete die Textilindustrie intensiv an der Entwicklung benutzerfreundlicher, bequemer und wirksamer Gesichtsmasken, um die Übertragung von Krankheiten zwischen Menschen zu verlangsamen31.

Bald erkannte man, dass die Entwicklung antiviraler Materialien und Oberflächen ein wirksames Mittel zur Verlangsamung der Ausbreitung von SARS-CoV-2 und zur Verhinderung von Infektionen durch direkten Kontakt darstellt. Allerdings ist die Entwicklung antiviraler Materialien ein zeit- und kostenintensiver Prozess. Eines der Hauptprobleme bestand darin, dass die antiviralen Eigenschaften neu entwickelter Beschichtungen und Materialien nur durch Tests mit dem echten Virus beurteilt werden konnten (ISO 21702 und ISO 18184). Dies erforderte geschultes Personal und eine spezielle Infrastruktur (z. B. mit Biosicherheitsstufe 3 ausgestattete Labore), die für die meisten Materialentwickler schwer zugänglich waren und die Entwicklung innovativer antiviraler Materialien erheblich verzögerten.

Daher sind alternative Testmethoden, die kostengünstig sowie einfach und sicher zu handhaben sind, äußerst wertvoll, um das schnelle Vorscreening neuartiger antiviraler Materialdesigns zu erleichtern, Innovationen voranzutreiben und vielversprechende Kandidaten für weitere Tests mit dem echten Virus schnell zu identifizieren. In dieser Studie stellen wir InViS vor, ein neuartiges alternatives Virussystem, das einen schnellen, kostengünstigen und sicheren Nachweis der Viruszerfallsaktivität von Flüssigkeiten, Verbindungen und Materialien durch einfache Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Wir verwendeten ein inaktiviertes Rhodamin-18-markiertes A/Brisbane 59/2007 Influenzavirus, das große strukturelle Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2 aufweist, nämlich ein umhülltes RNA-Virus mit einer Größe von ca. 100 nm und Hämagglutinin auf seiner Oberfläche darstellt. Das Virus wurde mit β-Propiolacton inaktiviert, wodurch die antigene Virusstruktur erhalten bleibt, das Virus jedoch aufgrund der Alkylierung der Nukleinsäurebasen, der Unterdrückung der Genomreplikation, der Induktion des Genomabbaus sowie der Protein- und Genomvernetzung nicht infektiös wird32. Das interessanteste Merkmal von InViS ist, dass die Fluoreszenzsonde innerhalb der Virusmembran selbst gelöscht wird. Dies hat zur Folge, dass die Fluoreszenz von InViS deutlich zunimmt, wenn die Viruspartikel zerfallen und den Fluoreszenzfarbstoff freisetzen.

Es ist bekannt, dass Ethanol Viruspartikel durch Auflösung der Lipidmembran und Denaturierung von Proteinen zersetzen kann33,34,35. Ebenso kann ein niedriger pH-Wert zum Membranabbau führen36,37,38. Deshalb haben wir InViS 70 % Ethanol und Zitronensäure ausgesetzt, um seine Empfindlichkeit gegenüber bekannten antiviralen Flüssigkeiten zu testen. Tatsächlich führten beide Chemikalien zu einem deutlichen Anstieg der Fluoreszenz. Wenn die InViS-Partikel mit der Ethanollösung in Kontakt kamen, kam es innerhalb von 5 Minuten zu einem vollständigen Viruszerfall. Im Fall der Zitronensäurelösung blieb der Viruszerfall teilweise, was darauf hindeutet, dass das InViS-System (semi-)quantitative Daten zum Viruszerfall liefern kann.

Da einige NPs antivirale Eigenschaften haben können, werden sie intensiv für die Entwicklung neuartiger antimikrobieller Materialien und Beschichtungen erforscht16,23,39. Daher untersuchten wir, ob Ag-, Au-, CuO-, ZnO-, TiO2- und Graphenoxid-NPs in der Lage sind, InViS aufzulösen. Obwohl für die untersuchten NP-Typen antivirale Wirkungen beschrieben wurden, löste keines der getesteten NPs selbst bei längerer Exposition von bis zu 24 Stunden einen Zerfall der Virushülle aus. Wir beobachteten sogar eine leichte Abnahme der Fluoreszenzsignale mit steigenden NP-Konzentrationen, was auf die Partikeladsorption an und/oder das Eindringen in die Viruskapseloberfläche und die anschließende Entfernung aus der flüssigen Probe während des Zentrifugationsschritts zurückzuführen sein könnte. Dies stünde im Einklang mit den von Kim et al. veröffentlichten Ergebnissen, bei denen über eine gleichzeitige Ausfällung von Au-NPs und Influenza-A-Virus während der Zentrifugation berichtet wurde24.

Diese Ergebnisse für die NPs stimmen mit der vorhandenen Literatur überein, die darauf hindeutet, dass die antiviralen Aktivitäten der meisten NPs offenbar auf anderen Effekten als dem Kapselzerfall beruhen. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass Ag-NPs das virale Kapsidprotein binden oder denaturieren oder die Bindung des Virus an Zellrezeptoren hemmen und so den Viruseintritt in die Wirtszellen verhindern23. Cu-haltige NPs könnten die Bildung von Radikalen über Fenton oder Fenton-ähnliche Reaktionen katalysieren, die Kapsidproteine ​​oxidieren und somit die Virusinfektion in einem frühen Stadium blockieren23. Es wurde gezeigt, dass AuNPs die Disulfidbindungen des Hämagglutinin-Glykoproteins auf der Virusoberfläche oxidieren, was zu dessen Inaktivierung führt und somit die Membranfusion des Virus mit Wirtszellen behindert23. TiO2-NPs können Lipide und Glykoproteine ​​in der Virushülle schädigen40. Graphen-Nanoblätter konnten hydrophobe Protein-Protein-Wechselwirkungen unterbrechen und Graphenoxid konnte Viruspartikel adsorbieren und so deren Wechselwirkung mit der Zellmembran verhindern.

Mit diesem Wissen wird die größte Einschränkung unseres InViS-Systems deutlich: Die Membranauflösung ist nicht die einzige Inaktivierungsmethode und daher können nicht alle antiviralen Materialien mit InViS charakterisiert werden. Dennoch beruhen viele antivirale Materialien auf dem Zerfall der Virushülle. Ziel des InViS ist es nicht, die bestehenden und anerkannten ISO-Prüfungen zu ersetzen. Es wurde vielmehr entwickelt, um eine einfache, kostengünstige und sichere Alternative zur Beurteilung des Viruszerfalls (der eine potenzielle Resistenzentwicklung verhindert) in einem frühen Stadium der Forschung und Entwicklung zu bieten. Besonders interessant ist das System für Forscher und Hersteller, die die Wirksamkeit von Materialien beurteilen wollen, die die Lipidhülle auflösen sollen. Im Rahmen dieser Studie haben wir eine solche antivirale Beschichtungslösung (Patentnummer PCT/EP2021/06058030) mit InViS evaluiert. Wir berichten über einen starken Anstieg der Fluoreszenz und bestätigen, dass die Beschichtungslösung tatsächlich zum Zerfall des Virus führte. Solche Schnelltests können bei der Entwicklung antiviraler Flüssigkeiten und Beschichtungen von großem Nutzen sein. Sie ermöglichen beispielsweise das Screening einer Vielzahl verschiedener Substanzen, Zusammensetzungen und Konzentrationen, um die erfolgversprechendste Lösung für die weitere Entwicklung zu identifizieren.

Darüber hinaus kann das InViS verwendet werden, um das Schicksal und die Lokalisierung von NPs in mehrschichtigen Strukturen, Textilien und Gesichtsmasken zu erkennen. Wir haben InViS in einem Filtereffizienzsystem eingeführt, in dem die Leistung verschiedener Arten von Gesichtsmasken bewertet wurde. Dies ermöglichte den Einsatz von Aerosolen mit biologisch relevanten Viruspartikeln anstelle der in den Normen vorgeschriebenen Substanzen wie Salz oder Öl. Aufgrund des gemischten Vorhandenseins von Salzkristallen und Viruspartikeln war es nicht möglich, die Filtrationseffizienz direkt aus dem Virusaerosol mit dem Partikelanalysator zu messen. Dennoch haben wir wichtige Informationen über die Ansammlung von Viruspartikeln in den verschiedenen Maskenschichten und die Relevanz der Verwendung von NaCl-Partikeln als Modell für Viruspartikel erhalten. Die REM-Aufnahme der verschiedenen Schichten ergab, dass sich sowohl Salz- als auch Viruspartikel bevorzugt in der inneren Meltblown-Schicht ansammelten, was darauf hindeutet, dass NaCl-Aerosole trotz ihrer unterschiedlichen Eigenschaften in Bezug auf Größe und Form repräsentativ für Viruspartikel sein könnten. Dennoch könnte eine Anpassung der Filtrationseffizienzbank implementiert werden, um Filtrationseffizienztests mit InViS durchzuführen. Es wäre interessant, die Filtrationseffizienz zu quantifizieren, indem die restlichen Viruspartikel, die durch die getesteten Gesichtsmasken und Filter gelangt sind, gesammelt werden, beispielsweise mit einem Bubbler, der es ermöglicht, verbleibende Viruspartikel in einer flüssigen Lösung zu sammeln. Durch den Vergleich der Restfluoreszenz von Maskenproben mit Blindproben können Unterschiede in der Filtrationseffizienz erkannt werden. Dies würde eine Bewertung der Filtrationseffizienz von Gesichtsmasken unter Verwendung von Viruspartikeln ermöglichen und uns der Bestimmung der Filtrationseigenschaften medizinischer und technischer Filtersysteme gegen echte Viren in einem relevanteren Expositionsszenario einen Schritt näher bringen.

Abschließend berichten wir über die Entwicklung einer neuartigen Methode zur Bewertung potenzieller antiviraler Verbindungen und Oberflächen mit einem inaktivierten Virussystem (InViS), um eine schnelle, kostengünstige und sichere Beurteilung des Viruszerfalls durch einfache Fluoreszenzmessungen zu ermöglichen. Darüber hinaus kann InViS zur Untersuchung des Verbleibs und der Lokalisierung von Viruspartikeln auf nichtporösen und porösen Materialien wie technischen und medizinischen Textilien eingesetzt werden, was es zu einem wertvollen Werkzeug zur Unterstützung der Entwicklung neuartiger antiviraler Materialien, Beschichtungen und Gesichtsmasken macht.

Chemisch inaktivierte und gereinigte monovalente Influenzavirus A/Brisbane/59/2007 (H1N1)-Lösung in GMP-Qualität wurde von Seqirus (Melbourne, Australien) Hämagglutinin (HA) (1,6 mg mL−1) erhalten, bestimmt durch Single Radial Immunodiffusion Assay, SRID. Rhodamin-B-Octadecylesterperchlorat (R18) wurde von Merck KGaA (Niederlande) gekauft und in wasserfreiem Ethanol der HLPC-Qualität bei einer Endkonzentration von 10 mM gelöst. R18-Lösung (40 µL) wurde tropfenweise bei Raumtemperatur (RT) unter kontinuierlichem Rühren bei 200 U/min für 15 Minuten zu einer Influenza-Lösung (1 ml) gegeben. Nicht eingebautes R18 wurde durch Trennung auf einer Sephadex G50-Säule (Merck KGaA) entfernt. Der Hohlraumvolumenanteil wurde gesammelt und weiter charakterisiert.

Partikelgröße, Größenverteilung und Konzentration wurden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse auf einem Malvern NanoSight LM10-Instrument analysiert. Die Probe wurde 1:10.000 in HNE-Puffer (HEPES (10 mM) pH 7,4, NaCl (142,5 mM), EDTA (5 mM) verdünnt, vor der Verwendung durch einen 0,1 µm Spritzenfilter filtriert) und in die Analysekammer des 405 injiziert nm-Lasermodul mit einem konstanten Fluss von 70 Einheiten bei einer kontrollierten Temperatur von 25 °C und einer Viskositätseinstellung von 0,975–0976 Cp. Es wurden 5 Aufnahmen durchgeführt, wobei jede Aufnahme eine Dauer von 60 s hatte. Die Kameraeinstellung war Stufe 15 mit einer Erkennungsschwelle von 3. R18-Fluoreszenz und Fusionsaktivität wurden bestimmt, um die Fluoreszenzlöschung und das Vorhandensein von HA auf der Virusoberfläche wie beschrieben zu bestätigen20,41. Für die Fusion von Influenza-Virosomen mit Erythrozyten-Ghosts wurde das Medium auf pH 4,5 angesäuert. Die R18-Fluoreszenz wurde kontinuierlich bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 560 bzw. 590 nm gemessen. Zur Kalibrierung der Fluoreszenzskala in Fusionsexperimenten wurde die anfängliche Fluoreszenz der markierten Membranen auf Null und die Fluoreszenz bei unendlicher Sondenverdünnung auf 100 % gesetzt. Letzterer Wert wurde nach Zugabe von OEG (Merck KGaA, Niederlande, Endkonzentration 1 mM) erhalten. Um zu bestätigen, dass das Virus nach dem Versand intakt blieb, wurden DLS-Messungen durchgeführt, um den hydrodynamischen Durchmesser der Viruspartikel und ihren Polydispersitätsindex in PBS vor und nach der Zugabe des OEG zu bestimmen (Zetasizer Nanoseries, Nano-ZS90, Malvern, Worcestershire, UK). , 1,25 mg mL−1). Darüber hinaus wurden Fluoreszenzmessungen des seriell verdünnten Virus mit und ohne OEG (1,25 mg mL−1, 5 Minuten Inkubationszeit) mit einem Horiba FluoroMax SpectraFluorometer durchgeführt, um die Nachweisgrenze festzulegen.

70 % Ethanol (CAS 64-17-5) und Zitronensäure (1 M; CAS: 77-92-9) wurden mit InVis (0,4 % v/v) inkubiert. Die Proben wurden mit einem Vortex-Mischer homogenisiert und 5 Minuten bei RT inkubiert. Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Horiba FluoroMax SpectraFluorometer durchgeführt. Die Anregungswellenlänge betrug 560 nm und Emissionsspektren wurden zwischen 580 und 650 nm gemessen. Als Negativkontrolle wurde eine InViS-Lösung in PBS (0,4 % v/v) verwendet, um die Fluoreszenzintensität des intakten Virus zu ermitteln. Als Positivkontrolle wurde OEG (CAS: 3055-98-9; 2,5 % v/v) zugegeben, um das Virus aufzulösen und die entsprechende Fluoreszenzintensität anzuzeigen.

Um mögliche antivirale Wirkungen von NPs zu untersuchen, verwendeten wir Partikel, die in früheren Studien verwendet und vollständig charakterisiert wurden. Die wichtigsten Eigenschaften der Partikel sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Als Suspensionen verfügbare Partikel (Ag-COONa, Au-5-COONa) wurden mit Reinstwasser zu einer Stammsuspension von 1 mg mL−1 verdünnt und mit einem Vortexmischer homogenisiert (1 Minute). Als Pulver verfügbare Partikel (CuO, Graphenoxid, TiO2 und ZnO) wurden in hochreinem Wasser zu einer Stammsuspension von 1 mg mL−1 suspendiert, wobei ein Sondenschallgerät bei 230 V/50 Hz (Branson Sonifier 250, Branson Ultraschall Co., Danbury, CT, USA, Sondendurchmesser 6,5 mm, maximale Spitze-zu-Spitze-Amplitude 247 μm) für 5 Minuten bei 13 W.

Verschiedene Partikelkonzentrationen (0,1, 1, 10 und 100 µg mL−1) wurden mit einer Lösung von InViS in PBS (0,4 % v/v; Stammkonzentration von InVis: 1,5 * 1013 Partikel mL−1) 2 und 24 Stunden lang inkubiert . Die Inkubation erfolgte bei RT im Dunkeln und unter ständigem Schütteln. Die Suspensionen wurden 10 Minuten lang bei 4500 × g zentrifugiert, um die NPs zu entfernen. Die Fluoreszenz der Überstände wurde mit einem Horiba FluoroMax SpectraFluorometer gemessen. Um die antivirale Wirkung zu quantifizieren, wurde die Fluoreszenz mit der Fluoreszenz einer Virussuspension in PBS (Negativkontrolle) und einer mit OEG behandelten Virussuspension (1,25 mg mL−1; Positivkontrolle, bei der das gesamte Rhodamin freigesetzt werden sollte) verglichen. Um eine Autofluoreszenz oder Fluoreszenzlöschung der NPs auszuschließen, wurden auch die Fluoreszenz reiner NP-Suspensionen (ohne Virus) und die Fluoreszenz von mit Virus und Detergenz inkubierten NPs gemessen.

Zur Herstellung einer antiviralen Beschichtung wurde eine antivirale Lösung [Patentnummer: PCT/EP2021/06058030] verwendet. Zunächst wurden die antiviralen Eigenschaften der flüssigen Form durch eine 5-minütige Inkubation mit einer InViS-Lösung (0,4 % v/v) und Fluoreszenzmessungen charakterisiert. Um die Eigenschaften der beschichteten Form zu charakterisieren, wurde ein Volumen von 0,5 ml gleichmäßig in Einweg-Petrischalen verteilt und 24 Stunden bei RT inkubiert. Als Richtlinie für die Probenvorbereitung diente die ISO-Norm 21.702, die die antivirale Charakterisierung nichtporöser Materialien abdeckt. Das Virusinokulum, 0,4 ml für jede Probe, bestand aus einer 20 % v/v InViS-Stammlösung in PBS. Als Negativ- bzw. Positivkontrolle wurden ein Inokulum mit InViS (20 % v/v) in PBS und ein Inokulum mit InViS in PBS (20 % v/v) und OEG (62,5 mg mL−1) in leeren Petrischalen verwendet . Zur Abdeckung des Inokulums wurde eine inerte Polymerfolie (Polyethylen niedriger Dichte (LDPE)) (40 mm × 40 mm) verwendet. Der Film wurde vorsichtig nach unten gedrückt, um eine Sandwichstruktur zu bilden und die Kontaktfläche zwischen dem Inokulum und der antiviralen Probe zu maximieren, während gleichzeitig ein Auslaufen über die Ränder des inerten Films verhindert wurde. Die Proben wurden 24 h im Dunkeln bei RT gelagert. 20 ml PBS wurden in die Petrischale gegeben und die Schalen wurden gerührt, um die Homogenisierung des frisch hinzugefügten PBS und des verbleibenden Inokulums sicherzustellen. Nach dem Mischen wurden 2 ml des Auswaschguts gesammelt und in transparente Küvetten pipettiert. Die Emissionsfluoreszenzspektren der Auswaschung wurden mit dem Horiba FluoroMax SpectraFluorometer charakterisiert. Die Anregungswellenlänge wurde auf 560 nm eingestellt und die Emissionsintensität zwischen 580 und 650 nm gemessen. Für jede Probe wurden zwei Replikate analysiert.

Um den Verbleib und die Lokalisierung von InViS und Salzpartikeln in Gesichtsmasken zu beurteilen, wurde der in Abb. 8 dargestellte Filtereffizienzaufbau verwendet. Mithilfe eines Pumpensystems wurde ein konstanter Luftstrom von 8 l/min durch die Probe erzeugt (basierend auf EN13274-7), der das menschliche Atemvolumen bei leichter körperlicher Anstrengung nachahmte und gleichzeitig eine relative Luftfeuchtigkeit im endgültigen Aerosol von 30 aufrechterhielt –40 % bei Raumtemperatur. Ein kreisförmiges Stück einer Gesichtsmaske wurde in einem Probenhalter in einer kleinen Sicherheitskammer montiert und die durch die Probe diffundierenden Partikel wurden in Echtzeit mit einem Partikelanalysator (Cambustion DMS500) quantifiziert. Eine Lösung von InViS in Reinstwasser (1011 Partikel mL-1) oder NaCl [2 g mL-1, Aerosolkonzentration zwischen 4 und 12 mgm-3 und mittlere Partikelgröße zwischen 60 und 100 nm] wurde dem Aerosolgenerator (AGK) zugeführt 2000 Palas). Da die Virusstammlösung aus Virus in PBS bestand, enthielt die Aerosollösung 1 % v/v PBS. Daher waren nicht nur InViS, sondern auch PBS-Rückstände im Aerosol vorhanden.

Schematische Beschreibung der Filtrationseffizienzbank. Das Virus oder die NaCl-Lösung wurde in den Aerosolgenerator gegeben. Durch die Probe wurde in Anlehnung an DIN 14683 ein konstanter Luftstrom mit Virus- oder Salzpartikeln erzeugt. Die Partikelgrößenverteilung wurde im Partikelanalysator gemessen.

Nach Experimenten zur Filtrationseffizienz wurden die Maskenschichten auseinandergezogen und separat analysiert, um die InViS-Partikel zu lokalisieren. Zunächst lieferten Rasterelektronenmikroskopbilder (REM) der inneren und äußeren Schichten eine qualitative Analyse der Partikelpräsenz auf den Maskenfasern. Hierzu wurde ein Hitachi S-4800 (Hitachi High-Technologies, Kanada) REM verwendet. Vor der Bildgebung wurden die Maskenschichten mit einem leitfähigen doppelseitigen Kohlenstoffband auf SEM-Stützen montiert und mit 7 nm Gold/Palladium (LEICA EM ACE600) durch Sputtern beschichtet, um Elektronenaufladungseffekte zu reduzieren. Die Einstellungen für die REM-Bildgebung waren eine Beschleunigungsspannung von 2 kV und ein Stromfluss von 10 µA. Zweitens wurde die Virusmenge auf jeder Schicht durch Fluoreszenzmessungen bewertet. Hierzu wurden die verschiedenen Maskenschichten für einen Zeitraum von 2 Stunden in 8 ml 70 %iges Ethanol gelegt. Anschließend wurden 2 ml der Lösung in transparente Küvetten pipettiert und Fluoreszenzmessungen mit einem Horiba FluoroMax SpectraFluorometer (Anregungswellenlänge 560 nm, Emissionsspektren zwischen 580 und 650 nm) durchgeführt.

R wurde für Zahlen und statistische Berechnungen verwendet. Die statistischen Unterschiede wurden mithilfe des Student-t-Tests bewertet und die folgenden Symbole stellen die entsprechenden p-Werte dar: *p < 0,05, $p < 0,01, £p < 0,001 und #p < 0,0001.

Daten, die diese Studie unterstützen, werden auf begründete Anfrage den entsprechenden Autoren zur Verfügung gestellt.

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Korrespondenz mit Peter Wick.

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Eingegangen: 25. April 2022

Angenommen: 24. Juni 2022

Veröffentlicht: 08. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15471-5

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