Bioprinting mikroporöser funktioneller lebender Materialien aus Protein

Oct 11, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 322 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Lebende Materialien vereinen Materialwissenschaft und Biologie, um die Entwicklung und Erweiterung lebender Systeme mit neuartigen Funktionalitäten zu ermöglichen. Bioprinting verspricht eine genaue Kontrolle über die Bildung solch komplexer Materialien durch programmierbare Ablagerung von Zellen in weichen Materialien, aber aktuelle Ansätze hatten nur begrenzten Erfolg bei der Feinabstimmung der Zellmikroumgebungen bei gleichzeitiger Erzeugung robuster makroskopischer Morphologien. Hier begegnen wir dieser Herausforderung durch den Einsatz von Core-Shell-Mikrogeltinte, um die Zellmikroumgebung für die weitere Verarbeitung von der Strukturhülle zu entkoppeln. Zellen werden im viskosen Kern mikrofluidisch immobilisiert, was die Bildung sowohl von Mikrobenpopulationen als auch von Säugetierzellsphäroiden fördern kann, gefolgt von einer interpartikulären Ausheilung, um kovalent stabilisierte Funktionsgerüste mit kontrollierter Mikroporosität zu ergeben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Core-Shell-Strategie das Austreten von Zellen verringert und gleichzeitig eine günstige Umgebung für die Zellkultur bietet. Darüber hinaus zeigen wir, dass verschiedene mikrobielle Konsortien für eine Reihe von Anwendungen in Gerüste gedruckt werden können. Durch die Kompartimentierung mikrobieller Konsortien in separaten Mikrogelen wird die kollektive Bioverarbeitungsfähigkeit des Gerüsts erheblich verbessert, was Aufschluss über Strategien zur Erweiterung lebender Materialien mit Bioverarbeitungsfähigkeiten gibt.

Lebende Materialien sind komplexe Materialien, die lebende Zellen in nicht lebende Komponenten integrieren1,2. Abhängig von der Art der Wechselwirkungen mit den einzelnen Zellen können solche Materialien von bioinerten Medien mit Gerüstfunktionen3,4,5,6,7 bis hin zu zellinstruktiven Biomaterialien reichen, die das Zellverhalten8,9,10 und neuerdings sogar steuern können zu genetisch programmierbaren Matrizen, die von Zellen produziert werden und die natürliche Bildung von Biofilmen nachahmen11,12,13,14,15. Die Funktionalität solcher Verbundmaterialien beruht meist auf eingebetteten Zellen; Daher sollte das Material immer dafür sorgen, dass die Zellen richtig wachsen und funktionieren. Allerdings gibt es in der Regel auch starke Einschränkungen hinsichtlich der makroskopischen Materialeigenschaften aufgrund der funktionalen Anforderung, dass eine endgültige Struktur eine physische Form aufweisen muss, die gehandhabt, geliefert, konserviert und wiederverwendet werden kann und Zellen schützt. Die Synergie zwischen Materialien und Biologie hat nicht nur unser Verständnis zellulärer Prozesse dramatisch verändert16, sondern uns auch die Fähigkeit verschafft, lebende Systeme für eine Vielzahl von Anwendungen zu konstruieren, von der therapeutischen Bereitstellung von Zellen für die regenerative Medizin17,18,19 bis hin zu On-Demand Produktion hochwertiger Chemikalien durch mikrobielle Bioverarbeitung6,7.

Die Manipulation der räumlichen Verteilung von Zellen ist eine der gefragtesten Fähigkeiten im Bereich lebender Materialien. Bioprinting hat aufgrund seiner Vielseitigkeit und Kompatibilität mit vielen zellfreundlichen weichen Materialien wohl die größte Aufmerksamkeit auf sich gezogen20,21. Bioprinting ermöglicht beispielsweise die programmierbare Ablagerung von Säugetierzellen in bioaktiven Hydrogelen, um biologische 3D-Konstrukte zu erstellen, die die Komplexität und Heterogenität nativer Gewebe besser nachbilden22,23,24,25, was enorme translationale Werte in der Biomedizin hat. Bioprinting-Mikroben haben in den letzten Jahren ebenfalls zunehmende Anwendungen erfahren, da sie unser Verständnis dynamischer Bakteriengemeinschaften26 erweitern und Erkenntnisse für die Verbesserung der Bioverarbeitung liefern3,4,5,6. Aktuelle Bioprinting-Routinen gehen jedoch häufig Kompromisse zwischen der Eignung für Zellen und einer verbesserten Materialherstellbarkeit ein, da die inhärenten mechanischen und rheologischen Eigenschaften des Bioinks nicht ordnungsgemäß von der zellulären Mikroumgebung entkoppelt werden können27,28. Darüber hinaus bleibt es eine Herausforderung, beliebige makroskopische Materialmorphologien mit genau definierten Zellnischen zu konstruieren, um robuste Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellgemeinschaften herzustellen20,21,29.

Hier schlagen wir eine Methode vor, um dieser Herausforderung zu begegnen. In dieser Arbeit untersuchen wir die Anwendbarkeit zellbeladener Kern-Schale-Mikrogele an der Schnittstelle von Bioprinting und funktionellen lebenden Materialien. Basierend auf einem wässrigen Zweiphasensystem zwischen Gelatine/Gelatinemethacryloyl (gelMA) und Carboxymethylcellulose (CMC)30 werden Kern-Schale-Mikrogele mit in der viskosen Kernphase eingekapselten Zellen hergestellt, während die Hydrogelhülle eine duale Vernetzungsstrategie ermöglicht kovalent miteinander zu einem mikroporösen PAM-Gerüst (Protein-based Annealed Microgel) verbunden. Darüber hinaus verbinden wir mikrofluidisch abstimmbare Bausteine ​​mit Funktionalitäten makroskopischer lebender Materialien über Extrusions-Bioprinting29,31 hin zur Bioverarbeitung. Wir zeigen, dass Kern-Schale-Mikrogele das Wachstum sowohl mikrobieller Populationen als auch zellulärer Sphäroide von Säugetieren unterstützen; Noch wichtiger ist, dass die Kern-Schale-Mikrogele im Vergleich zu ihren Gegenstücken ohne Kern-Schale den Zellaustritt in das Medium reduzieren und gleichzeitig die Bioverarbeitungskapazität solcher Materialien erhöhen können. Schließlich zeigen wir, dass durch die Herstellung von Gerüsten mit lokal variierenden Eigenschaften, dh heterogen verteilten und räumlich getrennten Zellpopulationen in diskreten Mikrogelen, in zwei typischen Modellen mikrobieller Konsortien deutlich verbesserte Bioaktivitäten beobachtet werden. Wir glauben, dass unsere Methode eine verallgemeinerbare Strategie zum Aufbau der nächsten Generation lebender Materialien bereitgestellt hat, die nicht nur bei der mikrobiellen Bioverarbeitung, sondern auch bei der fortgeschrittenen Biofabrikation vielversprechend ist.

Wir begannen mit Gelatine, einem aus Kollagen gewonnenen Material, das aufgrund seines tierischen Ursprungs und seiner breiten Verfügbarkeit32 seit langem in einer Vielzahl biologischer Anwendungen zur Herstellung lebender Materialien verwendet wird (Abb. 1). Um ein duales Netzwerk zu erhalten, wurde Gelatine zunächst mit ihrem photovernetzbaren Derivat gelMA gemischt, um eine homogene 15 %ige Hydrogel-Vorläuferlösung zu erzeugen, die mit 0,5 % Blaulicht-Photoinitiatoren Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) versetzt war. GelMA wurde nach einem gut etablierten Protokoll mit einem geschätzten Funktionalisierungsgrad von 50 % durch NMR synthetisiert (ergänzende Abbildung 1). Die dispergierte Phase wurde in einem mikrofluidischen Flussfokussierungsgerät emulgiert, wobei eine Lösung von 1 % Carboxymethylcellulose (CMC), versetzt mit 10 U/ml Transglutaminasen, von hydrogelbildenden Lösungen an der Geräteverbindung flankiert wurde und zusammen die dispergierte Phase durchschnitten wurde das Trägeröl (Novec 7500 mit 0,1 % Pico-Surf-Tensid), um Tröpfchen zu erzeugen (ergänzende Abbildung 2). Die Flussraten für Hydrogel-Vorläufer, CMC und Öl betrugen jeweils 8, 2, 40 µL/min, was zu hoch monodispersen Kern-Schale-Tröpfchen mit einem Durchmesser von ~165 µm (Varianzkoeffizient, CV = 2,2 %) und einem CMC-Kern von ~90 führte µm (CV = 7,4 %). Durch Mikrofluidik konnte die Schalendicke gesteuert werden (Abb. 1b). Die Tröpfchen wurden über Nacht bei Raumtemperatur ausgehärtet, um die Diffusion von Transglutaminasen aus dem CMC-Kern in die Hüllenphase zu ermöglichen, was anschließend die Bildung von Isopeptidbindungen zwischen Glutamin und Lysin und damit das erste kovalente Netzwerk katalysierte. Mikrogele wurden demulgiert und anschließend direkt mit phosphatgepufferter Lösung (PBS), die 0,5 % LAP enthielt, im Volumenverhältnis 4:1 gemischt, um eine zufriedenstellende Druckbarkeit zu erzielen. Mit einem Extrusions-3D-Drucker könnten verklemmte Mikrogele zu makroskopischen Gerüsten geformt werden. Schließlich leitete ein blaues Licht von 405 nm eine zweite Vernetzung zwischen Mikrogelen ein, um kovalent stabilisierte PAM-Gerüste zu erzeugen, die mechanisch steif genug sind, um leicht mit einer Pinzette gehandhabt zu werden (Abb. 1c) und ihre strukturelle Integrität nach dreitägiger Inkubation in PBS beibehalten können ( Ergänzendes Video 1). Bemerkenswert ist, dass die duale kovalente Strategie reversibel ist, d. h. Tröpfchen können zunächst durch blaue Lichtstrahlung ausgehärtet und dann enzymatisch getempert werden.

a Schematische Darstellung der Bildung von PAM-Gerüsten. Zunächst wird die LAP-haltige Gelatine/GelMA-Polymermischung zusammen mit der mit Transglutaminasen versetzten zellhaltigen CMC-Lösung durch Trägeröl in Tröpfchen in einem flussfokussierenden Mikrofluidikgerät emulgiert. Anschließend werden die Tröpfchen durch enzymatische Reaktionen in Mikrogele umgewandelt, die anschließend extrudiert und zu Gerüsten geformt werden. Schließlich initiiert blaues Licht eine zweite kovalente Vernetzung zwischen verklemmten Mikrogelen, wodurch PAM-Gerüste entstehen. b Durch Mikrofluidik kann das Kern-Schale-Verhältnis gesteuert werden. Die Flussraten der Hydrogel-Vorläuferlösung (Hüllenphase) und des Trägeröls werden auf 8 bzw. 40 µL/min gesteuert, und die Flussraten von CMC (Kernphase) betragen 1, 2 und 3 µL/min für kleine , mittlere bzw. große Kerngröße, n = 50 Mikrogele, analysiert in einem Experiment. c Gedruckte PAM-Gerüste und die mikroskopische Aufnahme zeigt die lokale Vergrößerung zweier gekreuzter Filamente. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt und die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

REM-Bilder (Rasterelektronenmikroskop) zeigen die Kern-Schale-Morphologie der Bausteine ​​(ergänzende Abbildung 3b) und zeigen, dass die doppelt vernetzten PAM-Gerüste eine mehrskalige Porosität aufwiesen (ergänzende Abbildung 3a – c). Auf der Mikrogeloberfläche befanden sich Nanoporen (ergänzende Abbildung 3a), die für Hydrogele als Material mit hohem Wassergehalt charakteristisch sind. Durch die Mikrogelpackung entstanden Mikroporen , was durch die gestreckte Netzmorphologie lyophilisierter PAM-Gerüste belegt wird (ergänzende Abbildung 3c). Um weiter zu untersuchen, wie sich die Mikrogelgröße auf die physikalischen Eigenschaften von Gerüsten im Makromaßstab auswirkt, untersuchten wir die Abbaukinetik von PAM-Gerüsten, die aus unterschiedlich großen Mikrogelen durch Perkolation von Trypsinlösung in die Struktur zusammengesetzt waren (ergänzende Abbildung 4a), zusammen mit doppelt vernetzten Massenhydrogelen und nicht getemperte Mikrogele. Kinetikprofile (ergänzende Abbildung 4b) zeigen, dass der Abbau aller PAM-Gerüste unabhängig von der Mikrogelgröße aufgrund des Vorhandenseins von Mikroporen, die das Eindringen der Trypsinlösung in die Gerüste erleichterten, höhere Geschwindigkeiten aufwies als bei Massenhydrogelen. Darüber hinaus verlief der Abbau bei kleineren Mikrogelgrößen tendenziell langsamer, möglicherweise aufgrund verringerter Porengrößen 19 und damit verlangsamter Perkolation (ergänzende Abbildung 4b).

Mikrogele haben sich kürzlich als eine Art Tinte zur Herstellung von 3D-Strukturen durch Extrusionsdruck herausgestellt29,31,34,35,36,37. Im verklemmten Zustand können sie durch physikalische Wechselwirkungen wie Reibung Ruhestrukturen bilden, die sich wie elastische Festkörper verhalten; Bei Scherung werden die Reibungen zwischen den Partikeln abgebaut, sodass die Tinte fließen kann. Daher sind Materialien, die zu Mikrogelen verarbeitet werden können, theoretisch durch Extrusion druckbar, unabhängig von ihrer Polymerchemie29,31. Um die Druckfähigkeit dieser Kern-Schale-Mikrogeltinte quantitativ zu bewerten, wurde zunächst eine rheologische Charakterisierung durchgeführt. Verklemmte Mikrogele zeigten ein strukturviskoses Verhalten (Abb. 2a) und konnten sich nach ihrer Entfernung schnell von der Belastung erholen (Abb. 2b). Insgesamt lässt sich dieses besondere rheologische Verhalten in die Fähigkeit der Tinte umwandeln, sich bei Scherung schnell von einer fließenden Flüssigkeit in einen elastischen Feststoff umzuwandeln, wenn sie die Düse verlässt. Das Dehnungs-Sweep-Experiment zeigt, dass die Mikrogeltinte bei einer Dehnung von etwa 30 % nachgibt (ergänzende Abbildung 5a); Nach dem Glühen zwischen den Partikeln stiegen sowohl der Speicher- als auch der Verlustmodul deutlich an (Abb. 2c), und die Fließspannung stieg etwa um das Sechsfache an (ergänzende Abb. 5b), was zu PAM-Gerüsten mit erhöhter mechanischer Festigkeit führte. Darüber hinaus hatte die Tinte mit einer umgekehrten Dual-Networking-Strategie eine Reihe ähnlicher rheologischer Eigenschaften (ergänzende Abbildung 5c ​​– f).

a–c Rheologische Charakterisierung der Mikrogeltinte. Mikrogele werden enzymatisch gehärtet. ein Schergeschwindigkeits-Sweep-Experiment. Schergeschwindigkeit von 0 bis 10 1/s. Dehnung 1 %. b Schrittweiser Dehnungsdurchlauf, bei dem alle 100 s eine niedrige Dehnung (1 %) und eine hohe Dehnung (90 %) durchlaufen. Frequenz 1 Hz. c Speicher- und Verlustmodule vor und nach dem photoinitiierten Tempern, n = 3 unabhängige rheologische Charakterisierungen. ***p = 0,00022, ** p = 0,0031, ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test. d Fluoreszierende Bilder von extrudierten Filamenten, die aus unterschiedlich großen Düsen gedruckt werden. Der Einschub zeigt eine gebogene Ecke eines Filaments. e Analyse der Filamentdurchmesser. Farbige Balken stellen die Innendurchmesser der Druckdüsen dar und die leeren Balken sind die gemessenen Durchmesser der gedruckten Filamente, n = 3 unabhängig voneinander gedruckte Filamente in einem Experiment. f Fluoreszierende Bilder von Gerüsten, dh (i) grünen und (ii) roten homogenen Gerüsten, (iii) einem makroskopisch heterogenen Gerüst und (iv) einem mikroskopisch heterogenen Gerüst. d, f Fluoreszierende Mikrogele werden aus einer Mischung von Gelatine mit Fluorophor-markiertem GelMA erzeugt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt und die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes testeten wir die Drucktreue. Düsen mit unterschiedlichen Innendurchmessern wurden zum Mustern von Gerüsten verwendet, und die Filamente zeigten alle eine gleichmäßige Dicke ohne merkliche Abflachung (Abb. 2d), die sonst durch die Oberflächenspannung beim Kontakt mit der festen Oberfläche beeinflusst würde. Folglich entsprachen die Filamentdurchmesser denen der Druckdüsen und waren bei Verwendung von 20-G-, 21-G- und 22-G-Düsen sogar etwas kleiner (Abb. 2e), da die Ränder stärker gezackt waren. Anschließend haben wir die Kompatibilität der Mikrogeltinte mit einem kommerziellen Extrusions-3D-Drucker getestet (ergänzende Abbildung 6a und ergänzendes Video 2). Mikrogeltinte mit optimierter Druckbarkeit wurde in eine Dispersionskartusche geladen, die mit einem dreiachsigen mechanischen Roboterarm gekoppelt war. Die Extrusion und die Schreibgeschwindigkeit der Mikrogeltinte wurden pneumatisch bzw. durch den Roboterarm gesteuert. Im Gegensatz zum kontinuierlichen materialbasierten Extrusionsdruck, bei dem die Filamentdicke aufgrund der Filamentfusion sowohl durch die Extrusion als auch durch die Schreibgeschwindigkeit gesteuert werden kann38, haben wir festgestellt, dass die Dicke der gedruckten Mikrogeltinte kaum von der Geschwindigkeit, sondern von der Größe der Düse abhängt zu seinem elastischeren Verhalten. Daher führen nicht übereinstimmende Geschwindigkeiten entweder zum Brechen des Filaments (Extrusion Schreiben, ergänzende Abbildung 6b). Durch Anpassen der Geschwindigkeit der Tintenextrusion und des Schreibens konnten wir die Mikrogeltinte in verschiedene vordefinierte Formen (ergänzende Abbildung 6a) und mehrschichtige Strukturen bringen. Neben homogenen Strukturen (Abb. 2fi und ii) könnten auch heterogene Strukturen (Abb. 2f, iii und iv) durch einfaches Mischen von Populationen von Mikrogelen mit unterschiedlichen Eigenschaften hergestellt werden.

Eine der größten Herausforderungen beim Extrusions-Biodruck besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen den mechanischen Eigenschaften des Materials, der Herstellbarkeit des Materials und der Eignung für Zellkulturen21,27,28 sowie den inhärenten mechanischen Eigenschaften des Materials, d. h. dem rheologischen Profil und dem Endprodukt, zu finden Die Steifheit des Materials bestimmt nicht nur seine Druckleistung20,39, sondern kann, was noch wichtiger ist, das Zellverhalten negativ beeinflussen40,41. Um dieser Herausforderung zu begegnen, nutzen wir die Core-Shell-Strategie, um die Materialverarbeitung (die Shell-Phase) durch deren Phasentrennung von der Zellkultur (der Core-Phase) zu entkoppeln30. Das Kernmaterial, CMC, wurde für Zellkulturen und als Gerüste für die Gewebezüchtung verwendet42,43. Die rheologische Charakterisierung des Kernmaterials zeigt, dass die CMC-Lösung zur Viskosität tendiert (ergänzende Abbildung 5g, i). Als nächstes untersuchten wir die Vermehrung von Mikroorganismen in einer solchen viskosen Umgebung im Gegensatz zu Nicht-Kern-Schale-Bausteinen (Abb. 3). E. coli ließ man 24 Stunden lang in ausgehärteten Mikrogelen wachsen. In Kern-Schale-Mikrogelen war das Zellwachstum weitgehend physikalisch begrenzt, was zu einer konzentrierten Bakterienpopulation im Kern führte (Abb. 3a). Im krassen Gegensatz dazu vermehrten sich Bakterien in Nicht-Kern-Schale-Mikrogelen lokal und bildeten runde und sporadische Mikrokolonien (Abb. 3b), die den kürzlich berichteten ähnelten44. Darüber hinaus haben wir auch visuell festgestellt, dass eine solche räumliche Beschränkung das Entweichen von Bakterien in die Umwelt wirksamer verhindern kann (ergänzende Abbildung 7a). Wir haben das Ergebnis weiter durch ein Verdünnungsplattierungsexperiment bestätigt (ergänzende Abbildung 7b), das zeigt, dass die koloniebildende Einheit (KBE) des Überstands von Nicht-Kern-Schale-Mikrogelen zwei Größenordnungen höher war als die von Kern-Schale Mikrogele über 24 Stunden (Ergänzende Abbildung 7c). Da das Austreten von Zellen eine ungelöste Herausforderung im Bereich lebender Materialien für die Bioverarbeitung darstellt6,7,45, insbesondere wenn genetisch veränderte Mikroorganismen beteiligt sind, die nicht entkommen können, könnte die Verwendung von Kern-Schale-Mikrogelen Lösungsstrategien für dieses Problem bieten46. Darüber hinaus könnten sich Mikroben in den PAM-Gerüsten auf ähnliche Weise vermehren, ohne dass es zu einer nennenswerten Kreuzkontamination zwischen benachbarten Mikrogelen kommt (ergänzende Abbildung 8).

Linkes Feld: GFP Escherichia Coli (E. coli) in Kern-Schale- und Nicht-Kern-Schale-Mikrogelen. Rechtes Feld: Bildung und Charakterisierung von HEK 293 T-Zellsphäroiden in Kern-Schale-Mikrogelen. a Vermehrung von GFP E. coli. in den Kern-Schale-Mikrogelen. Das Zellwachstum ist innerhalb der viskosen Mikrogelkerne begrenzt. b Vermehrung von E. coli. in den Nicht-Kern-Schale-Mikrogelen. E. coli vermehren sich lokal und bilden sichtbare Mikrokolonien. Blaue und weiße gestrichelte Linien umreißen die Mikrogele bzw. die CMC-Kerne. c Schematische Darstellung der Entstehung vielzelliger Sphäroide. Aufgrund der räumlichen Beschränkung können Zellen in allen drei Dimensionen interagieren und mehrzellige Sphäroide mit einer hierarchischen Struktur bilden. d Wachstum von HEK 293 T-Sphäroiden von Tag 3 bis Tag 6, quantifiziert durch Sphäroid-Zirkularität und -Fläche. Die Daten werden als Mittelwerte mit Minima/Maxima dargestellt, n = 107 Sphäroide (Tag 3), n = 248 Sphäroide (Tag 6) im selben Experiment. **p = 0,0019, ****p < 1E-15, ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. e Lebend-/Totfärbung von zellbeladenen Mikrogelen an Tag 0, Tag 3 und Tag 6. Lebende Zellen (grün) und tote Zellen (rot) werden mit Calceinacetoxymethyl (Calcein AM) und Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) gefärbt ), jeweils. f Zytoskelettstruktur von HEK 293 T-Sphäroiden. (i) Hellfeldbild eines HEK 293 T-Sphäroids und (ii) sein konfokales mikroskopisches Bild. (iii) Zytoskelettstruktur von HEK 293 T aus einer Monoschichtkultur. F-Aktin und Kerne werden mit Phalloidin bzw. 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) gefärbt. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopaufnahme wird aus Querschnittsbildern an verschiedenen vertikalen Positionen gerendert (ergänzende Abbildung 10).

Die Anwendbarkeit von Kern-Schale-Mikrogelen für die Zellkultur von Säugetieren wurde ebenfalls charakterisiert (Abb. 3c – f). Die Abgabe der Zellen in die Mikrogele folgte der Poisson-Verteilung (ergänzende Abbildung 9). Ebenso wurden die Zellen räumlich begrenzt und konnten sich innerhalb von Mikrogelkernen in allen Dimensionen vermehren und interagieren, um sich selbst zu Sphäroiden mit hoher Zelldichte zusammenzusetzen (Abb. 3c). Humane embryonale Nieren (HEK) 293 T-Zellen entwickelten sich nach drei Tagen in Kern-Schale-Mikrogelen zu zellulären Sphäroiden (Abb. 3e), von denen die meisten eine hohe Zirkularität aufwiesen (höher als 0,8, Abb. 3d). Von Tag 3 bis Tag 6 nahm die Größe der Sphäroide um 80 % zu (Abb. 3d) und behielt eine hohe Lebensfähigkeit bei, wie durch Lebend-/Totfärbung nachgewiesen wurde (Abb. 3e). Darüber hinaus bestand das Zytoskelett der HEK 293 T-Sphäroide aus dicht gepackten Kernen, die von einem Netzwerk aus kortikalem Aktin umgeben waren (Abb. 3f, ii und ergänzende Abb. 10), was das Vorherrschen von Zell-Zell-Wechselwirkungen im Gegensatz zu Monoschicht-Wechselwirkungen verkörpert Zellkultur, in der Aktin in zytoplasmatischen Fasern organisiert war47 (Abb. 3f, iii). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass HEK 293 T in der Lage sind, gut strukturierte zelluläre Sphäroide in Kern-Schale-Mikrogelen mit hoher Zelllebensfähigkeit zu bilden, was auf ihr Potenzial für zukünftige Anwendungen als Bausteine ​​für die Biofabrikation von Strukturen mit hoher Zelldichte hinweist20.

Das Drucken von Mikroben ist die neue Grenze im Bioprinting48, da es ein vielseitiges Werkzeug zur Herstellung funktioneller lebender Materialien mit genau definierten Formen und Eigenschaften bietet, die ein breites Anwendungsspektrum einschließlich Sensorik49, Bioproduktion6 und Bioremediation3,7 gefunden haben. Die Kern-Schale-Mikrogele wurden dann als Biotinte zum Drucken funktioneller lebender Gerüste für die Bioverarbeitung verwendet (Abb. 4a). Wir begannen mit einem natürlichen Saccharomyces cerevisiae-Fermentationssystem, um Glukose anaerob in Ethanol umzuwandeln3,4,5. Mit Hefe beladene Kern-Schale-Mikrogele wurden in getemperte PAM-Gerüste gedruckt (Abb. 4b) und in einer sauerstofffreien Umgebung zur Fermentation in Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medien (YPD) getaucht. Bei allen in dieser Arbeit verwendeten hefebeladenen Kern-Schale-Mikrogelgerüsten begann die Ethanolproduktion zwei Stunden nach dem Eintauchen in YPD-Medien zu steigen und wuchs innerhalb von 12 Stunden exponentiell an (Abb. 4e). Zunächst untersuchten wir, wie physikalische Eigenschaften des Bausteins die Bioverarbeitungskapazität gedruckter Gerüste beeinflussen. Durch alleinige Abstimmung der Flussrate der Kernphase wurden Kern-Schale-Mikrogele mit der gleichen Gesamtgröße (Kern-Schale A und B: 156 ± 3,2 µm bzw. 154 ± 2,0 µm) mit unterschiedlichen Kerngrößen (84 ± 8,2) erzeugt µm bzw. 56 ± 2,1 µm, Abb. 4c, d) und damit eine Diskrepanz in der Zellbeladung. Wir untersuchten die Kinetik der Ethanolproduktion in Medien (Abb. 4e) und stellten fest, dass größere Kerne (Kern-Schale A) aufgrund höherer Zellbeladungen zu einer schnelleren Ethanolerzeugung führten. Als nächstes untersuchten wir, ob die Größe der Kern-Schale-Mikrogele zu Unterschieden bei der Fermentation führen würde. Um den Faktor Zellbeladung von der Bioverarbeitungsleistung zu trennen, wurden die Strömungsprofile der dispergierten Phase (sowohl des Kerns als auch der Schale), die zur Herstellung des Kern-Schale-Mikrogels B verwendet wurde, konstant gehalten, jedoch mit einer erhöhten Flussrate des Trägeröls in einem kleineren Tröpfchen-Mikrofluidikgerät (ergänzende Abbildung 11a), wodurch kleinere Kern-Schale-Mikrogele entstehen (Kern-Schale C, 95 ± 3,2 µm insgesamt, 34 ± 1,7 µm Kern) mit einem unveränderten Volumenverhältnis zwischen Kern- und Schalenmaterial (Abb . 4d). Durch den Druck von Gerüsten mit gleichem Gewicht lagen ihre anfänglichen Zellbeladungen daher unabhängig von der Größe der Bausteine ​​nahe beieinander. Wir fanden heraus, dass bei einer äquivalenten Menge an im Gerüst immobilisierten Hefezellen die Größe der Kern-Schale-Mikrogele keinen signifikanten Einfluss auf den Fermentationsprozess hatte (Abb. 4e), was wir auf das Vorhandensein der Mikroporen im Gerüst zurückführten mit relativ kürzerer Diffusionslänge34, was die Abgabe kleiner Moleküle zu/von den Zellen nicht merklich behinderte. Schließlich wurden zum Vergleich auch Nicht-Kern-Schale-Mikrogele erzeugt (150 ± 3,0 µm), und es wurde eine erheblich verzögerte Produktion von Ethanol durch daraus gedruckte Gerüste (Abb. 4e) beobachtet, was größtenteils wahrscheinlich auf das eingeschränkte Wachstum von Hefen in a zurückzuführen ist hochchemisch vernetztes Hydrogelnetzwerk, das die Zellproliferation verlangsamt hatte44. Wir stellten jedoch auch fest, dass die Endpunkt-Ethanolproduktion (20 Stunden) aus den Kern-Schale-PAM-Gerüsten etwas niedriger war (ergänzende Abbildung 11b), was wir auf eine stärkere Zellleckage bei Nicht-Kern-Schale-PAM-Gerüsten zurückführten (Ergänzende Abbildung 11c), die die Ethanolproduktion steigerte.

ein Schema der Herstellung funktioneller lebender Gerüste. Mit Mikroben beladene Kern-Schale-Mikrogele werden über Tröpfchen-Mikrofluidik erzeugt und in getemperte Gerüste gedruckt, die für die Bioverarbeitung verwendet werden, wobei die Mikroben als Ganzzell-Biokatalysator fungieren, um das Substrat im Medium in Produkte umzuwandeln. b Mikroaufnahmen der Kern-Schale-Mikrogele mit unterschiedlichen Größen und Nicht-Kern-Schale-Mikrogelen. c Die Größenverteilung der Kern-Schale-Mikrogele und Nicht-Kern-Schale-Mikrogele in b, n = 20 Mikrogele in einem Experiment. d Das Volumenverhältnis zwischen der Kern- und der Hüllenphase für Kern-Hülle-Mikrogele. Kern-Schale-Mikrogele A haben eine ähnliche Gesamtgröße wie B, verfügen jedoch über größere Kerne. Die Kern-Schale-Mikrogele B und C unterscheiden sich in der Gesamtgröße, haben aber das gleiche Kern/Schale-Verhältnis, um äquivalente Zellbeladungen für das Bioprinting aufrechtzuerhalten, n = 20 Mikrogele in einem Experiment, ****p < 1E-10, ns (nicht signifikant) = 0,74, ungepaarter zweiseitiger Student-T-Test. e Die Produktion von Ethanol aus Hefe über 12 Stunden in einer sauerstofffreien Umgebung, normalisiert durch die Gerüstgewichte, n = 3 unabhängige biologische Experimente. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt und die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes erweiterten wir die Anwendung auf mikrobielle Konsortien-basierte Bioverarbeitung6. Durch miteinander verbundene Kern-Schale-Mikrogele verfügen PAM-Gerüste nicht nur über eine kontrollierbare Porosität, sondern auch über die Fähigkeit, Multi-Spezies-Gemeinschaften in separate Mikrogele aufzuteilen (Abb. 5a), was zusammen einen effizienteren Transfer von Nährstoffen und Metaboliten zwischen dem Gerüst und der Umgebung bewirkt sowie interagierende Arten und verhindert gleichzeitig deren Konkurrenzwachstum. Anschließend untersuchten wir, ob diese Methode die Bioaktivität immobilisierter mikrobieller Konsortien durch räumliche Arbeitsteilung (Abb. 5b) im Vergleich zur direkten Vermischung von Konsortien verbessern kann. Zunächst untersuchten wir ein Mikroalgen-Bakterien-System bestehend aus photoautotropher Chlorella vulgaris und aerobem Bacillus subtilis (Abb. 5c) auf seine Fähigkeit zur biologischen Sanierung von Methylorange3,50 und Amoxicillin51. In diesem mikrobiellen Konsortium binden die Mikroalgen das von den Bakterien emittierte Kohlendioxid in Kohlenstoffquellen und produzieren gleichzeitig durch Photosynthese Sauerstoff für die Atmung der Bakterien (Abb. 5c), wodurch ihre Bioremediationsfähigkeit verbessert wird, indem das Wachstum beider Mikroben gegenseitig gefördert wird52,53. Um den Bioremediationsprozess zu demonstrieren, wurden zunächst heterogene PAM-Gerüste hergestellt, die das Konsortium in separaten Mikrogelen immobilisierten, und in synthetisches Abwasser getaucht, das Methylorange oder Amoxicillin enthielt (ergänzende Abbildung 12a). Über 90 % von Amoxicillin (300 mg/L) wurden innerhalb von 24 Stunden entfernt und etwa 15 % von Methylorange (100 mg/L). Um zu untersuchen, ob eine solche räumliche Trennungsstrategie die Bioremediation steigert, wurden homogene Gerüste getestet, in denen das Konsortium in denselben Mikrogelen eingekapselt war, sowie Gerüste, die Monokulturen von Mikroalgen bzw. Bakterien immobilisierten. Das Ergebnis (Abb. 5d) zeigt, dass beide immobilisierten einzelnen Mikrobenpopulationen Methylorange mit ähnlicher Wirksamkeit über 24 Stunden entfernen konnten, die homogenen Gerüste jedoch trotz einer halbierten Zellbeladung für beide Mikroben effizienter bei der biologischen Sanierung waren, was auf den synergistischen Effekt von hindeutet das Konsortium. Noch wichtiger ist, dass die heterogenen Gerüste deutlich mehr Methylorange sanierten (Abb. 5d), was auf eine verbesserte Bioverarbeitungsfähigkeit hinweist. Wir beobachteten jedoch auch, dass nach 48 Stunden alle heterogenen Gerüste abgebaut und verflüssigt waren (ergänzende Abbildung 13a), was durch die Hydrolyse der Gerüste durch mikrobielle Proteasen verursacht wurde, deren Konzentration im Laufe der Zeit in 48 Stunden anstieg (ergänzende Abbildung). 12b). Wir wollten dieses Phänomen als zusätzliches qualitatives Maß für die mikrobielle Bioaktivität des Konsortiums nutzen (Abb. 5e). Vier PAM-Gerüste mit der exakten Anordnung wie zuvor wurden hergestellt und in BG11-Medien eingetaucht (Abb. 5e und ergänzende Abb. 13b). Wir beobachteten erneut ein ähnliches Muster: Während das Gerüst, das die Mikroalgen immobilisierte, nach 24 Stunden zu zerfallen begann, behielt das Gerüst mit Bakterien 72 Stunden lang seine Struktur weitgehend bei, da das nährstoffarme Medium für das Wachstum von Bacillus subtilis ungünstig ist. Innerhalb von 24 Stunden begann das heterogene Gerüst in kleinere Fragmente zu zerfallen, während das homogene Gerüst bis zum dritten Tag seine strukturelle Integrität beibehielt (ergänzende Abbildung 13c).

PAM-Gerüste immobilisieren und trennen mikrobielle Konsortien im mikroskopischen Raum, was konkurrierendes Wachstum verhindert und gleichzeitig einen effizienteren Massentransfer von Metaboliten zwischen Arten ermöglicht. Kreise und Dreiecke stellen von Mikroben abgesonderte Metaboliten dar. b Zellbeladene Kern-Schale-Mikrogele werden gestaut und in Gerüste gedruckt. Heterogene und homogene Gerüste sind definiert als: eine gemischte Population von Mikrogelen, die jeweils zwei verschiedene Mikroorganismenarten enthalten, und eine homogene Population von Mikrogelen, die eine Mischung aus zwei Mikroorganismen enthält. c–e Ein Mutualismusmodell mikrobieller Konsortien. c Schematische Darstellung der Verwandtschaft zwischen Chlorella vulgaris und Bacillus subtilis. d Bioremediation von Methylorange durch heterogene Gerüste, homogene Gerüste und Gerüste, die Monokulturen von Mikroalgen bzw. Bakterien immobilisieren, n = 3 unabhängige biologische Experimente. e Charakterisierung des Gerüstzerfalls in 72 Stunden. Das geschlossene Symbol markiert ein ungebrochenes Gerüst, wohingegen das offene Symbolgerüst deutlich zerfällt. Bei allen Experimenten werden die Gerüste einer zyklischen Licht-/Dunkelheitsbedingung von 12:12 Stunden ausgesetzt und bei 25 °C inkubiert. f–h Ein wettbewerbsfähiges Wachstumsmodell mikrobieller Konsortien. f Das synthetische mikrobielle Konsortium aus gentechnisch veränderten Escherichia coli und Meyerozyma guilliermondii zur Herstellung von 2-PE aus Glucose60. Überexprimierte Gene sind rot markiert. Das gekreuzte Gen tyrA wird ausgeschaltet. g Die Produktion von 2-PE aus heterogenen Gerüsten über 6 Tage, normalisiert durch die jeweiligen Gerüstgewichte, n = 3 unabhängige biologische Experimente. h Vergleich der Bioverarbeitung im Hinblick auf die normalisierte 2-PE-Produktion über 3 Tage, n = 3 unabhängige biologische Experimente. *p = 0,021, ns = 0,069, ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test. Für beide Gerüste wird die Produktion durch entsprechende Gerüstgewichte normalisiert; Für die Flüssigkultur werden CMC-haltige Konsortien direkt in Medien inokuliert, deren Zellbeladung mit der der Gerüste übereinstimmt, und die 2-PE-Produktion wird auf die durchschnittlichen Gerüstgewichte aus heterogener und homogener Kombination normalisiert. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt und die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Schließlich testeten wir ein synthetisches Pilz-Bakterien-Konsortium, um Glukose zu 2-Phenylethanol (2-PE) zu fermentieren (Abb. 5f). In dieser enzymatischen Kaskade (Abb. 5f und ergänzende Abb. 14) wird die Kohlenstoffquelle zunächst von Escherichia Coli in das Zwischenprodukt L-Phenylalanin umgewandelt, das von Meyerozyma guilliermondii, einer Hefeart, von der berichtet wird, weiter zu 2-PE metabolisiert wird produzieren und vertragen eine hohe Konzentration von 2-PE5460. Da beide Mikroorganismen Glukose als Kohlenstoffquelle nutzen, bilden sie eine Konkurrenzbeziehung. In einer Flüssigkultur, in der zwei Mikroben einfach miteinander vermischt werden, würde M. guilliermondii im Laufe von 96 Stunden immer die dominierende Art werden, unabhängig vom anfänglichen Inokulationsverhältnis (ergänzende Abbildung 15). Um den Bioproduktionsprozess von 2-PE aus konsortialhaltigen Gerüsten zu charakterisieren, haben wir zunächst die Kinetik der 2-PE-Produktion mit den heterogenen Gerüsten in synthetischen Medien gemessen. Eine gemischte Population von Mikrogelen bzw. eingekapselten E. coli oder M. guilliermondii wurde zu Gerüsten verarbeitet und im Kulturmedium inkubiert, um Glucose zu 2-PE zu fermentieren (ergänzende Abbildung 16). Das Ergebnis zeigt (Abb. 5g) eine sigmoidale Kinetik, die etwa am zweiten Tag ihren Höhepunkt erreichte und nach drei Tagen der Fermentation allmählich abflachte. Als nächstes verglichen wir die Ausbeute an 2-PE zwischen zwei verschiedenen Gerüstsätzen (Abb. 5h). Bemerkenswerterweise wurde in der Fermentationsbrühe, die heterogene Gerüste enthielt, innerhalb von drei Tagen eine mehr als sechsfach höhere 2-PE-Konzentration nachgewiesen als in ihren homogenen Gegenstücken. Wir fanden auch heraus, dass im Vergleich zur Flüssigkultur mehr 2-PE aus den homogenen Gerüsten vorhanden war (Abb. 5h), was möglicherweise auf den engeren physischen Kontakt zweier Mikroorganismen zurückzuführen ist, der durch die Wachstumsbeschränkung in Mikrogelen entsteht. Zuletzt untersuchten wir die Wiederverwendbarkeit von Gerüsten für die 2-PE-Chargenproduktion (ergänzende Abbildung 16). Gerüste konnten während der ersten Charge (3 Tage) ihre Integrität bewahren; Trotz des allmählichen strukturellen Zusammenbruchs waren die Gerüste nach 4 Batch-Prozessen in Folge (insgesamt 12 Tage) nicht vollständig gefährdet. Allerdings verringerte sich die Produktion von 2-PE erheblich (ergänzende Abbildung 16g), insbesondere bei heterogenen Gerüsten, die bei der zweiten Charge um 70 % zurückgingen, während sie bei homogenen Gerüsten um 20 % sank. Die 2-PE-Produktion für beide Gerüste verschlechterte sich von Charge zu Charge und kam nach der dritten Charge fast vollständig zum Erliegen; Dennoch lieferten die heterogenen Gerüste immer noch mehr 2-PE (ergänzende Abbildung 16g). Die nachlassende Leistung von Gerüsten könnte dadurch verursacht werden, dass Zellen austreten und sich wieder an der Innenfläche des Gerüsts anlagern, wodurch das Wachstumsgleichgewicht zweier Mikrobenarten gestört wird, da sie zwischen den Chargen nicht vollständig durch frische Medien entfernt werden können.

Insgesamt beschreibt die hier vorgestellte Arbeit einen Ansatz zur Konstruktion lebender Materialien über eine gemeinsame Extrusions-Bioprinting-Routine. Durch eine Mikrogel-Dual-Networking-Methode können kovalent stabilisierte makroskopische funktionelle lebende Materialien gedruckt und problemlos für die Bioremediation und Bioproduktion eingesetzt werden. Wir verwendeten Kern-Schale-Mikrogele als Bausteine ​​und stellten trotz der unvermeidlichen Zellleckage6,7 fest, dass eine solche Strategie dieses Problem im Vergleich zu Nicht-Kern-Schale-Mikrogelen mildern kann. Darüber hinaus wurde unter Verwendung eines Hefe-Monokulturmodells eine stark verzögerte Ethanolproduktion in Nicht-Kern-Schale-Mikrogelgerüsten beobachtet, was auf eine bessere Eignung von Kern-Schale-Mikrogelen für die Zellkultur hindeutet. Darüber hinaus wurden mit Mikroben beladene Mikrogele verwendet, um die Zellgemeinschaften räumlich zu organisieren, wodurch eine heterogene Zellverteilung etabliert werden kann, um die Kommunikation mikrobieller Konsortien zwischen den Spezies zu fördern und gleichzeitig programmierbare Morphologien durch Extrusionsdrucken zu erzeugen. Unsere Ergebnisse zeigen bemerkenswert verbesserte Bioaktivitäten von zwei verschiedenen mikrobiellen Konsortien. Obwohl das proteinbasierte Material aufgrund seiner Anfälligkeit für Proteasehydrolyse möglicherweise nicht die beste Wahl für mikrobielle Anwendungen ist, sehen wir zukünftige Bemühungen, mechanisch robustere Materialien für solche Anwendungen zu verwenden. Wir zeigen auch, dass die Kern-Schale-Mikrogele Säugetierzellsphäroide kultivieren können61; In Kombination mit der Tröpfchen-Mikrofluidik und der Mikrogel-Dual-Networking-Strategie versprechen sie eine Verwendung als Bausteine ​​für den Aufbau von Strukturen mit hoher Zelldichte. Zusammenfassend sind wir davon überzeugt, dass unsere vorgeschlagene Methode ein wertvolles Paradigma für die Konstruktion funktioneller lebender Materialien für die mikrobielle Bioverarbeitung darstellt und auch Potenzial für eine fortschrittliche Biofabrikation birgt55.

Gelatinemethacryloyl (gelMA) wurde gemäß einem veröffentlichten Protokoll33 synthetisiert. Gelatine aus Schweinehaut (Shanghai Aladdin Biochemical Technology) wurde in entionisiertem Wasser bei 50 °C bis zu einer Endkonzentration von 10 % gelöst (Gew./Vol., Konzentrationen sind alle als Gew./Vol. angegeben oder anders angegeben). 0,6 g Methacrylsäureanhydrid (Shanghai Macklin Biochemical) wurden der homogenen Gelatinelösung tropfenweise pro 1 g Gelatine zugesetzt. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 50 °C durchgeführt und durch Zugabe von zwei Volumina vorgewärmtem entionisiertem Wasser beendet. Anschließend wurde die Mischung 3 Minuten lang bei 3500 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden dekantiert und gegen entionisiertes Wasser bei 30 °C unter Verwendung von Dialyseschläuchen mit einem Molekulargewichts-Cut-Off von 12 kDa 7 Tage lang dialysiert. Nach der Dialyse wurde die saure Lösung von gelMA auf pH = 7,4 eingestellt, mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur vollständigen Hydratation zu porösem weißem Schaum lyophilisiert. Die Modifikation der Gelatine wurde durch 1H-Kernspinresonanz (NMR) verifiziert. Gelatine und gelMA wurden rezeptiv in Deuteriumoxid gelöst und Spektren (ergänzende Abbildung 1) wurden bei einer Frequenz von 400 MHz unter Verwendung eines Bruker Avance III HD-Spektrometers mit einer einachsigen inversen Gradientensonde gesammelt. Um den Funktionalisierungsgrad (DoF) abzuschätzen, wurden die integrierten Lysin-Methylen-Protonensignale durch das jeweilige aromatische Protonensignal in den Spektren normalisiert (ergänzende Abbildung 1) und der DoF von gelMA wurde wie folgt berechnet:

Mikrofluidische Geräte wurden nach einem Standard-Softlithographieprotokoll hergestellt56. Kurz gesagt, SU-8-Negativfotolack (Kayaku Advanced Materials) wurde durch Schleuderbeschichtung auf einen Siliziumwafer aufgetragen und auf einer Heizplatte bei 95 °C weich gebacken. Dann wurde eine Fotomaske mit definierter Gerätegeometrie auf dem Wafer platziert und unter kollimiertem UV-Licht (URE-2000/35 L, Institut für Optik und Elektronik, Chinesische Akademie der Wissenschaften) belichtet, um den abgebildeten Kanalbereich auszuhärten, gefolgt von einem Nachbacken bei 95 °C und SU-8-Entwicklung (SU-8-Entwickler, Kayaku Advanced Materials). Mikrofluidische Geräte auf Basis von Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden durch Softlithographie hergestellt. PDMS-Elastomere (DOWSILTM Sylgard 184-Kit) wurden mit Härtungsmitteln im Verhältnis 10:1 (Gew./Gew.) gemischt, bevor sie in einer Petrischale auf den entwickelten Master gegossen wurden. Ungehärtetes PDMS wurde dann entgast und zur Verfestigung bei 65 °C inkubiert. Danach wurde PDMS mit Gerätekanal ausgeschnitten, aus dem die Ein- und Auslässe mit 0,75-mm-Löchern gestanzt wurden. Anschließend wurden die Geräte und Objektträger 1 Minute lang mit Plasma behandelt (PDC-002-HP, Harrick Plasma), miteinander verbunden und 10 Minuten lang bei 65 °C gebrannt. Zur hydrophoben Modifizierung der Kanäle wurden die Gerätekanäle 2 Minuten lang mit 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyltriethoxysilan (Sigma-Aldrich) behandelt.

In dieser Arbeit wurden zwei Probenvorbereitungsmethoden angewendet. Zur Abbildung der Oberflächenmorphologie von Mikrogelen wurde die kritische Punkttrocknung (CPD) verwendet: Zuerst wurde das Trägeröl entfernt und die fotogehärteten Proben wurden direkt in 50 % Ethanol resuspendiert. Mikrogele wurden vor der CPD insgesamt zwei Tage lang schrittweise nacheinander mit 75 % und 100 % Ethanol dehydriert. Mikrogele wurden in mikroporöse Probenkapseln (78 µm, Agar Scientific) überführt, die in ein mit 100 % Ethanol gefülltes Probenschiffchen gegeben wurden. Das Probenschiffchen wurde in einen kritischen Punkttrockner (E3100, Quorum Technologies) eingesetzt und mindestens viermal mit flüssigem CO2 gespült. Nach dem Spülen wurde die Probe zum Trocknen bei 80 bar Druck auf 37 °C erhitzt. Um die Oberflächenmorphologie der PAM-Gerüste abzubilden, wurde die Probe lyophilisiert: Das PAM-Gerüst wurde kurzzeitig in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht direkt in einem Lyophilisator dehydriert. Für die SEM-Bildgebung wurden Proben mit leitfähigen Kohlenstoff-Klebepads auf SEM-Stummeln aus Aluminium montiert und mit einem K575X-Sputterbeschichter (Quorum Technologies) mit 15 nm Iridium beschichtet. Für die Bildgebung wurde ein Rasterelektronenmikroskop FEI Verios 460 verwendet.

Die rheologische Charakterisierung der verklemmten Mikrogeltinte und der PAM-Gerüste wurde unter Verwendung paralleler Plattengeometrie (20 mm Durchmesser, 1 mm Spalt) durchgeführt, die auf dehnungsgesteuerten Rheometern (Thermo Scientific HAAKE MARS 40/60 Rheometer) montiert waren. Gestaute Mikrogele wurden auf die gleiche Weise hergestellt und zu einer identischen Geometrie wie die Platten geformt. PAM-Gerüste wurden durch 300 s blaue Lichtbestrahlung gebildet. Bei der umgekehrten Vernetzungsstrategie ließ man die mit Enzymen resuspendierten verklemmten Mikrogele vor den Messungen 30 Minuten lang in einer verschlossenen Petr-Schale aushärten. Scherverdünnungskurven wurden in dehnungsratenkontrollierten Messungen mit 1 % Dehnung und Scherraten von 0,01 bis 10 s−1 erhalten. Das Erholungsverhalten der Tinte wurde durch einen Schritt-Dehnungs-Sweep durchgeführt, bei dem niedrige Dehnung (1 %) und hohe Dehnung (90 %) alle 100 s mit einer Frequenz von 1 Hz wechselten. Dehnungs-Sweep-Tests wurden mit einer Frequenz von 1 Hz und einer Dehnung von 0 bis 1000 % durchgeführt. Die Module wurden aus dem linearen viskoelastischen Bereich der Dehnungs-Sweep-Diagramme berechnet. Dehnungsdurchlauftests vor und nach dem Glühen wurden nicht gepaart. Die rheologische Charakterisierung der 1 %igen CMC-Polymerlösung wurde mit derselben Maschine mit einer anderen Plattengeometrie (35 mm Durchmesser, 1 mm Spalt) durchgeführt. Scherverdünnungskurven wurden in dehnungsratenkontrollierten Messungen mit 1 % Dehnung und Scherraten von 0,01 bis 100 s−1 erhalten. Der Frequenzdurchlauf wurde mit 1 % Dehnung und einer Frequenz von 0 bis 10 Hz durchgeführt. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Gelatine und gelMA wurden in PBS auf eine Endkonzentration von jeweils 15 % gelöst und bei 37 °C gehalten, um eine thermisch induzierte Gelierung zu verhindern. Eine Stammlösung von 1 % Carboxymethylcellulose (CMC, Shanghai Aladdin Biochemical Technology), versetzt mit 10 U/ml Transglutaminasen (200 U/g, Shanghai Yuanye Biotechnology), wurde bei 4 °C gehalten. Für biologische Experimente wurden alle Polymere in ihrem entsprechenden Kulturmedium gelöst. Als nächstes wurden Gelatine- und GelMA-Lösungen im Verhältnis 1:2 (v/v) gemischt, um eine Polymermischung mit 5 % Gelatine und 10 % GelMA (als Hydrogellösung bezeichnet) zu ergeben, die dann mit 0,5 % LAP versetzt wurde Photoinitiatoren (Shanghai Bide Pharmatech). Unabhängig von der Beteiligung der Zellen wurden alle Polymerlösungen vor mikrofluidischen Experimenten spritzenfiltriert (0,22 µm, Millex-Spritzenfilter). Alle Lösungen wurden in sterile 1-ml-Kunststoffspritzen gefüllt. Die Hydrogellösung wurde auf 37 °C und CMC auf 4 °C gebracht.

Kern-Schale-Tröpfchen wurden in einem strömungsfokussierenden Mikrofluidikchip erzeugt, der durch eine Kanalhöhe von 100 µm und eine Verbindungsabmessung von 150 × 150 µm gekennzeichnet war (ergänzende Abbildung 2a). Hydrogellösung und CMC wurden mit Spritzenpumpen (TYD01-02, Lead Fluid) über die Seitenkanäle bzw. den Mittelkanal in das Gerät verdrängt. An der Geräteverbindung wurde CMC von der Hydrogellösung umhüllt und zusammen wurden sie durch Novec 7500 Fluorkohlenstoff (3 M), der 0,1 % (v/v) Pico-Surf-Tenside (Sphere Fluidics) enthielt und als kontinuierliche Phase fungierte, geschert. Die Flussraten wurden durch Spritzenpumpen auf 40, 8, 2 µL/min für Öl, Hydrogellösung bzw. CMC gesteuert. Da die relativ hohe Konzentration der Hydrogellösung leicht eine thermisch induzierte Gelierung verursachte, wurde ein Heißwasserbeutel auf die Spritzen gelegt und der Schlauch mit einem speziell angefertigten Heizkissen umwickelt.

Die Bildung des ersten kovalenten Netzwerks wurde durch kalziumunabhängige Transglutaminasen katalysiert, wobei Lysin und Glutamin durch eine neue Isopeptidbindung vernetzt wurden. Um die Tröpfchen vollständig zu vernetzen, wurden sie über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Ausgehärtete Tröpfchen wurden durch Zugabe von 20 % (v/v) 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluor-1-octanol (PFO, Shanghai Bide Pharmatech) in Novec 7500 zur Mikrogelsuspension demulgiert. Die Mikrogele agglomerierten schnell, was die Entfernung des größten Teils der Ölphase erleichterte. Anschließend wurden sie 10 Minuten lang bei 2000 U/min (~280 × g) zentrifugiert und das restliche Öl am Röhrchenboden abgesaugt. Mikrogele wurden dann halbgetränkt, d. h. Mikrogele, die aus 1 Stunde Mikrofluidikbetrieb (600 µL dispergierte Phase) erzeugt wurden, wurden direkt mit 150 µL PBS mit 0,5 % LAP in Zentrifugenröhrchen über einen Vortex resuspendiert, um eine zufriedenstellende Druckbarkeit ohne Verlust von Mikrogelen zu erzielen. Um mikroskopisch heterogene Gerüste durch Extrusion zu drucken, wurden Mikrogele unterschiedlicher Zusammensetzung, die beispielsweise mit unterschiedlichen Fluorophoren funktionalisiert waren oder unterschiedliche Mikroben enthielten, vor der Demulgierung gründlich miteinander vermischt.

Zum Extrusionsdrucken von Mikrogelen mit einem kommerziellen 3D-Drucker (EFL-BP-6601, Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, China) wurden Mikrogelaggregate in eine 5-ml-Druckkartusche geladen und manuell entgast. Die verklemmte Mikrogeltinte wurde pneumatisch mit einem Druckdruck von ~50 kPa und einer 18-G-Druckdüse (Innendurchmesser: 840 µm, nicht konisch, Nordson EFD) aufgetragen. Die Schreibgeschwindigkeit wurde durch einen Roboterarm manipuliert und ad hoc an die Extrusionsgeschwindigkeit angepasst. Druckformen wurden in der vom Hersteller des 3D-Druckers bereitgestellten Benutzeroberfläche vordefiniert. Gerüste wurden auf einen sauberen Glasobjektträger gedruckt und 300 s lang mit blauem Licht mit einer Wellenlänge von 405 nm (Lichtintensität 25 mW/cm2, Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, China) bestrahlt, was zu miteinander verbundenen und kovalent stabilisierten Mikrogelgerüsten führte . Bei Gerüsten mit der umgekehrten Vernetzungsstrategie wurden die Tröpfchen zunächst 300 s lang durch blaue Lichtstrahlung ausgehärtet, durch PFO demulgiert und mit einer äquivalenten Menge PBS, versetzt mit 10 U/g Transglutaminasen, resuspendiert, bevor sie extrudiert und zu Gerüsten strukturiert und zugelassen wurden 30-minütiges Tempern zwischen Mikrogelen in einer verschlossenen Petrischale. Fluoreszierende Mikrogele wurden aus einer Mischung von Gelatine mit Fluorophor-markiertem GelMA (grün: ELF-GM-GF-60, rot: ELF-GM-RF-60; Yongqinquan Intelligent Equipment Co., Ltd., Suzhou, China) erzeugt.

Zuerst wurden Tröpfchen unterschiedlicher Größe erzeugt (ergänzende Abbildung 4a), wobei die Gesamtflussrate der dispergierten Phase konstant bei 10 µL/min gehalten wurde, während die der kontinuierlichen Phase variiert wurde. Die Tröpfchen wurden in Chargen alle 30 Minuten gesammelt und dann über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden sie durch PFO demulgiert und mit 75 µL LAP-haltigem PBS resuspendiert. Anschließend wurden die Mikrogele 5 Minuten lang bei 10.000 U/min (~6900 × g) zentrifugiert und am Röhrchenboden gleichmäßig sedimentiert. Das zweite Netzwerk wurde durch Bestrahlung mit blauem Licht für 300 s gebildet. Um die PAM-Gerüste zu verdauen, wurden 100 µL Trypsin (Beyotime Biotechnology) auf die Oberseite des Gerüsts geschichtet und bei 37 °C inkubiert. Alle 15 Minuten wurde das verbleibende Gerüst 1 Minute lang bei 10.000 U/min (~6900 × g) zentrifugiert und der Überstand abgesaugt, gefolgt von der Zugabe von 100 µL frischem Trypsin und der Inkubation. Für Bulk-Hydrogel wurden 240 µL Hydrogellösung mit 0,5 % LAP und 60 µL 1 % CMC, versetzt mit 10 U/ml Transglutaminasen, kräftig gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Vor dem proteolytischen Verdau wurde das Bulk-Hydrogel außerdem einer 300-sekündigen Bestrahlung mit blauem Licht ausgesetzt. Für nicht getemperte Mikrogele wurden mittelgroße Mikrogele erzeugt und auf die gleiche Weise inkubiert; Vor der Demulgierung wurde die Mikrogelsuspension 300 s lang mit blauem Licht bestrahlt und daher waren die Mikrogele nicht zu einem Gerüst verbunden. Die Hydrogelgewichte wurden berechnet, indem das Gewicht der leeren Röhrchen abgezogen und durch das Ausgangsgewicht der Hydrogele normalisiert wurde:

Der in dieser Arbeit verwendete Escherichia coli DH5α trug ein Quorum-Sensing-Plasmid (pTetR-LasR-pLuxR-eGFp), das das Vorhandensein des Signalmoleküls N-(3-Oxodecanoyl)-L-homoserinlacton (3-Oxo-C12-) erkennt. HSL) und Berichte über die Expression von eGFP, die zuvor in einer anderen Arbeit von uns verwendet wurde45. Luria-Bertani (LB)-Medium (1 l): 10 g Trypton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7,0 eingestellt und vor der Verwendung autoklaviert. E. coli wurden vor den Einkapselungsexperimenten im LB-Medium subkultiviert.

Alle Polymere wurden durch LB-Medien gelöst. Mit eGFP transfizierte E. coli-Zellen wurden in der 1 %igen CMC-Lösung suspendiert, bis eine endgültige Zellkonzentration von OD = 0,1 für die Zellkultur erreicht wurde (Abb. 3). Es wurden Tröpfchen erzeugt und sofort durch Bestrahlung mit blauem Licht für 300 s ausgehärtet. Anschließend wurden zellbeladene Mikrogele demulgiert und mit einer überschüssigen Menge LB-Medium, versetzt mit 10–6 mol/L 3-Oxo-C12-HSL (Sigma-Aldrich), vor der Inkubation bei 37 °CE Coli resuspendiert. Die Kultivierung in Nicht-Kern-Schale-Mikrogelen wurde genau auf die gleiche Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die zellhaltige Phase frei von CMC war. 50 µl Mikrogelsuspensionen wurden nach 0, 12 und 24 Stunden aliquotiert und unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX73) abgebildet.

Die Menge an Zellen, die aus den Mikrogelen in ihr Medium gelangten, wurde durch Ausplattierungsexperimente bestimmt. Nach 24 Stunden Zellkultur wurden 100 µL Medien aliquotiert und um das 105-, 106- bzw. 107-fache verdünnt und dann auf LB-Agarplatten ausplattiert. Der CFU wurde nach 24-stündiger Inkulation bei 37 °C durch Umwerben gebildeter Kolonien auf den Platten berechnet. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.

A549 und HEK 293 T stammten von der Narita-Gruppe an der Universität Cambridge und wurden von der American Type Culture Collection erworben. Die Zellen wurden mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GibcoTM 31053044) kultiviert, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS, GibcoTM A3160801), 2 mM L-Glutamin (GibcoTM 25030024), 1 mM Natriumpyruvat (GibcoTM 11360070). ) und 0,5 % (v/v) Penicillin-Streptomycin (GibcoTM 15070063).

Alle Polymere wurden vom Zellkulturmedium gelöst. HEK 293 T-Zellen (10 Millionen/ml) wurden vor der Einkapselung in der 1 %igen CMC-Lösung suspendiert. Zur Verifizierung des Poisson-Prozesses (ergänzende Abbildung 9) wurden zum Vergleich auch A549-Zellen eingekapselt. Tröpfchen wurden durch das oben genannte Protokoll erzeugt. Zellbeladene Tröpfchen wurden nach dem Sammeln durch 300 s blaue Lichtstrahlung ausgehärtet, demulgiert und in DMEM resuspendiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2.

Zellbeladene Mikrogele wurden aliquotiert und nach der Zellverkapselung abgebildet. Die Anzahl der Zellen in jedem Mikrogel wurde manuell gezählt und die Häufigkeit aufgezeichnet. Zur Anpassung an das Poisson-Stochastizitätsmodell wurde die durchschnittliche Anzahl der Zellen in Mikrogelen berechnet und daher konnte das theoretische Poisson-Modell grafisch dargestellt werden:

Dabei stellt k die beobachtete Anzahl der in den Kern-Schale-Mikrogelen eingekapselten Zellen dar und λ die durchschnittliche Anzahl der in Mikrogelen eingekapselten Zellen.

Die Lebensfähigkeit der Zellen von HEK 293 T wurde mit dem Live/Dead-Färbekit (Invitrogen) bewertet. Am Tag 0, 3 und 6 wurden 30 µL Mikrogelsuspension aliquotiert und vor der Bildgebung 30 Minuten lang bei 37 °C in Medium mit 4 µM Calceinacetoxymethyl (Calcein AM) und 2 µM Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) inkubiert durch ein Leica DMI6000B Epifluoreszenzmikroskop.

Das Sphäroidwachstum wurde durch die FIJI-Software anhand ihrer Fläche und Zirkularität quantifiziert. Insbesondere wurden Fluoreszenzbilder von zwei Kanälen, „Live“ und „Dead“, zusammengeführt und in binäre Bilder umgewandelt, wonach die Fläche (A) und der Umfang (P) von Sphäroiden direkt von FIJI gemessen werden konnten. Die Zirkularität von Sphäroiden wurde wie folgt berechnet:

500 µl Mikrogelsuspensionen wurden aliquotiert und 5 Minuten lang bei 3500 U/min (~850 × g) zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Anschließend wurden die Mikrogele 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 100 µL 4 % Paraformaldehyd inkubiert und nach der Inkubation intensiv mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Mikrogele in 100 µL PBS mit 0,1 % Triton X-100 (Fisher Bioreagents BP151-500, Thermo Fisher) resuspendiert. Stammlösungen von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Sigma-Aldrich) und Alexa FluorTM 647 Phalloidin (Invitrogen) wurden zugegeben und um den Faktor 1000 bzw. 40 verdünnt, gefolgt von einer Inkubation für 30 Minuten bei Raum Temperatur. Abschließend wurden die Mikrogele mindestens zweimal gewaschen und in PBS resuspendiert. Die Visualisierung einer Monolayer-basierten Kultur erfolgte nach dem gleichen Protokoll. Die räumliche Organisation von Kernen und f-Aktin wurde mit einem konfokalen Leica TCS SP8-Mikroskop abgebildet. Zur Konstruktion der 3D-Struktur von Sphäroiden wurden alle 10 µm Z-Kanäle gesammelt. Die Abbildung einschichtiger Zellen wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX73) durchgeführt.

Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde von Fleischmann's Rapid Rise gekauft und vor den Zellverkapselungsexperimenten 12 Stunden lang im YPD-Medium aktiviert. YPD-Medium (1 l): Hefeextrakt 10 g, Pepton 20 g und Dextrose 20 g. Kulturmedien wurden vor der Verwendung autoklaviert.

Alle Polymerlösungen wurden durch YPD-Medien gelöst. Zellbeladene Kern-Schale-Tröpfchen wurden mit einer Hefe-OD = 0,8 erzeugt und zur Aushärtung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Zweischichtige 3 × 3-Gittergerüste (Abmessungen: etwa 20 × 20 × 2 mm) wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank von Hand extrudiert und 300 s lang mit blauem Licht bestrahlt, bevor sie zur Ethanolfermentation in 1,5 ml YPD-Medium getaucht wurden. Die Medien wurden 5 Minuten lang mit Stickstoffgas durchperlt, um Sauerstoff zu entfernen, und die Glasfläschchen wurden während der Fermentation verschlossen. Um Mikrogele unterschiedlicher Größe zu erzeugen, wurden zwei Mikrofluidikgeräte und unterschiedliche Flussraten eingesetzt. Die Kern-Schale-Mikrogele A und B wurden mit einem Flussfokussierungsgerät mit einer Verbindungsabmessung von 150 × 150 µm und einer Kanalhöhe von 100 µm erzeugt. Kern-Schale-Mikrogele C wurden mit einem Gerät des gleichen Designs, jedoch mit einer Verbindungsabmessung von 100 × 100 µm und einer Kanalhöhe von 75 µm, erzeugt. Das Volumenverhältnis zwischen Hüllen- und Kernphase wurde wie folgt berechnet:

Dabei ist R1 der Durchmesser des Kern-Schale-Mikrogels und R2 der Kern, gemessen mit der FIJI-Software.

50 µL Medien wurden alle 2 Stunden über einen Zeitraum von 12 Stunden aliquotiert und 5 Minuten lang bei 10.000 U/min (~6900 × g) zentrifugiert. Der Überstand wurde filtriert (0,22 µm) und durch Gaschromatographie (GC, Agilent gc 6890n) unter Verwendung einer DB-1701-Säule (Agilent, 30 m × 0,25 mm) analysiert. Die Ethanolkonzentration wurde aus einer Ethanol-Standardkurve abgeleitet.

Die Mikroalge Chlorella vulgaris wurde von Shanghai Guangyu Biotechnology Co., Ltd. gekauft und direkt subkultiviert. Das Bakterium Bacillus subtilis war ein Geschenk des Labors von Prof. Su Chen an der Nanjing Tech University3. Vor den Einkapselungsexperimenten wurden Bacillus subtilis im LB-Medium bei 37 °C und Chlorella vulgaris im BG11-Medium (Qingdao Haibo Biotechnology) kultiviert und bei 25 °C mit einer Lichtintensität von ~10000 Lux und Hell/Dunkel-Zyklen inkubiert Bedingungen alle 12 Stunden (MQT-60G, Shanghai Minquan Instrument). Medienrezepte für die Bioremediation: Amoxicillin-Bioremediation: 300 mg/L Amoxicillin (Shanghai Yuanye Biotechnology) im BG11-Medium. Bioremediation mit Methylorange3: 100 mg/L Methylorange (Shanghai Aladdin Biochemical Technology), 22,16 mg/L NH4Cl, 6,57 mg/L KNO3, 1,08 mg/L NaNO2, 5,09 mg/ml KH2PO4. Amoxicillin/Methylorange wurde nach dem Autoklavieren in den restlichen Medien gelöst und die gesamten Medien wurden vor den mikrofluidischen Experimenten mit einer Spritze filtriert (0,22 µm).

Alle Polymere wurden alle durch entsprechende Medien ohne Amoxicillin/Methylorange gelöst. Für beide Mikroben wurden zellbeladene Kern-Schale-Tröpfchen mit einer OD = 0,4 erzeugt und zur Aushärtung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Dreischichtige 3 × 3-Gittergerüste (Abmessungen: ca. 20 × 20 × 3 mm) wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank von Hand extrudiert und 300 s lang mit blauem Licht bestrahlt, bevor sie zur Bioremediation in 6 ml-Medium (mit Amoxicillin/Methylorange) getaucht wurden für die biologische Sanierung, BG11-Medium für das Experiment zum biologischen Gerüstabbau). Um heterogene Gerüste zu drucken, wurden Kern-Schale-Mikrogele, die eine Monokultur von Bakterien oder Mikroalgen einschließen, vor der Demulgierung gleichmäßig gemischt und zu Gerüsten zusammengedruckt. Für homogene Gerüste wurden Zellsuspensionen vor der mikrofluidischen Einkapselung im Verhältnis 1:1 (v/v) gemischt. Zur biologischen Sanierung wurden die Gerüste bei 25 °C mit einer Lichtintensität von ~10.000 Lux und Licht-/Dunkel-Zyklen alle 12 Stunden inkubiert. Der Zerfall der Gerüste wurde alle 24 Stunden überwacht.

150 µL Medien wurden 6, 12, 18 und 24 Stunden nach der Inkubation aliquotiert und 5 Minuten lang bei 10.000 U/min (~6900 × g) zentrifugiert. Der Überstand wurde vor der Analyse mit einer Spritze filtriert. Die Konzentration von Methylorange wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV-3600, Shimadzu) gemessen und mit einer Standardkurve in entsprechenden Medien verglichen. Die Konzentration von Amoxicillin wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, LC-20AD, Shimadzu) gemessen, ausgestattet mit einer C18-Säule (Waters SunFire C18-Säule, 5 µm, 4,6 × 250 mm), und mit einer Standardkurve von Amoxicillin in entsprechenden Medien verglichen. Die Konzentration der Proteasen in den heterogenen Medien wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (D799673-0050, Sangon Biotech) und unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers gemessen.

Alle Stämme wurden von Professor Wenming Zhang an der Nanjing Tech University60 erhalten. Stämme: Pilz M. guilliermondii MG57: mgpdc-mgadh-scaro10-scgap-scaro80-mggdh. Die überexprimierten Gene mgpdc, mgadh und mggdh stammten von M. guilliermondii57 und scaro10, scgap und scaro80 stammten von Saccharomyces cerevisiae58,59. Bakterium Escherichia coli YLC20: Escherichia coli W1485, das Plasmide zur Überexpression der Gene aroF und pheA und zum CRISPR/Cas9-Knockout des Gens tyrA enthält.

100-fache Salzlösung (in 1 L): 100 g NaCl, 50 g MgCl2·6H2O, 20 g KH2PO4, 30 g NH4Cl, 30 g KCl und 1,5 CaCl2·2H2O. Die Lösung wurde vor der Verwendung autoklaviert. Spurenelementlösung (TES, in 1 L): 2 g Al2(SO4)3·18H2O, 0,75 g CoSO4·7H2O, 2,5 g CuSO4·5H2O, 0,5 g H3BO3, 24 g MnSO4·7H2O, 2,5 g NiSO4·6H2O, 15 g ZnSO4·7H2O und 3 g Na2MoO4·2H2O. Synthetisches Medium (in 1 L): 3 g MgSO4, 3 g KH2PO4, 1 g NaCl, 5 g (NH4)2SO4, 0,015 CaCl2·2H2O, 0,1125 FeSO4·7H2O, 1 g Trinatriumcitrat, 10 g Hefeextrakt, 0,3 g l -Tyrosin, 0,5 g Hefestickstoffbase und 2,3 g N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethansulfonsäure. Die Lösung wurde autoklaviert und dann mit 45 g separat autoklavierter und durch eine 0,22 µm-Spritze gefilterter Glucose, 0,075 g Vitamin B1 und 0,04 g Kanamycinsulfat versetzt. Danach wurde der Mischung die autoklavierte 100-fache Salzlösung in einer Portion von 10 ml pro 1 l Medium zusammen mit den autoklavierten 1,5 ml/l TES zugesetzt und das Volumen der Mischung auf 1 l eingestellt, um die vollständige Synthese zu ergeben Mittel.

Alle Polymere waren alle in den synthetischen Medien gelöst. Für beide Mikroben wurden zellbeladene Kern-Schale-Tröpfchen mit einer OD = 0,5 erzeugt und zur Aushärtung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Fünfschichtige 3 × 3-Gittergerüste (Abmessungen: ~ 0 × 20 × 5 mm) wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank von Hand extrudiert und 300 s lang mit blauem Licht bestrahlt, bevor sie zur 2-PE-Fermentation in 8 ml-Medium getaucht wurden. Um bei der Flüssigkultur-basierten 2-PE-Fermentation eine äquivalente Zellbeladung sicherzustellen, wurde die gleiche Menge 1 % CMC mit beiden Mikroben (OD = jeweils 0,5 vor dem gleichmäßigen Mischen) aliquotiert und zusammen mit Tröpfchengruppen bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert und inokuliert 8 ml synthetisches Medium gleichzeitig, wenn die Gerüste eingetaucht waren. Homogene und heterogene Gerüste wurden auf die gleiche Weise wie zuvor hergestellt. Alle Gerüste wurden in den ersten 24 Stunden bei 37 °C inkubiert und ab Tag 2 auf 30 °C gebracht. Gerüste wurden nach einer Batch-Fermentation, z. B. in den ersten drei Tagen, vorsichtig herausgenommen und dreimal mit frischem Medium gewaschen, bevor sie zur Wiederverwendung in frisches 8-ml-Medium getaucht wurden, was alle drei Tage für insgesamt drei Wiederverwendungsrunden wiederholt wurde. Die 2-PE-Konzentration wurde nach jeder Charge gemessen. Sowohl heterogene als auch homogene Gerüste wurden wiederverwendet.

Die kinetische Kurve heterogener Gerüste wurde aus 6-tägiger Überwachung der 2-PE-Konzentration in 24-Stunden-Intervallen erhalten. Der Vergleich zwischen heterogenen Gerüsten, homogenen Gerüsten und Flüssigkultur erfolgte am Ende von Tag 3. 150 µL Medien wurden aliquotiert und 5 Minuten lang bei 10.000 U/min (~6900 × g) zentrifugiert. Die Überstände wurden vor der Analyse mit einer Spritze filtriert (0,22 µm). Die Konzentration von 2-PE wurde mittels GC (Agilent gc 6890n), ausgestattet mit einer DB-1701-Säule (Agilent, 30 m × 0,25 mm), gemessen und mit einer Standardkurve verglichen.

Die gesamte Datenverarbeitung und statistische Analyse wurde mit Microsoft Excel 2019 durchgeführt und mit Python-Skripten (Version 3.8.12) unter Verwendung der Bibliotheken NumPy (Version 1.22.1) und Matplotlib (Version 3.5.1) aufgezeichnet. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von mindestens drei biologischen Replikaten dargestellt oder anderweitig im Manuskript angegeben. Alle Bilder wurden von FIJI-ImageJ (v 2.0.0-rc-69/1.52i) verarbeitet und Adobe Illustrator 2019 wurde zum Entwerfen von Illustrationen und Kuratieren von Figuren verwendet.

Fotos, dh Abb. 1c, ergänzende Abbildungen. 6a, 16a sind repräsentative Bilder von gedruckten Gerüsten. Mikroaufnahmen von Tröpfchen und Mikrogelen, Abb. 1b, 3a, b, 2e, 4b und Ergänzung 2b, 3a, b, 7a, 9a, 9c sind repräsentative Bilder von zufällig aliquotierten Proben während eines der unabhängig wiederholten Experimente. Mikroaufnahmen von gedruckten Gerüsten, z. B. Abb. 1c, 2d, f und ergänzende Abbildungen. 3c, 8a–c sind repräsentative Bilder einer lokalen Struktur von Gerüsten mit ähnlicher Morphologie. Die gesamte rheologische Charakterisierung wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und Abb. 2a, b und die ergänzenden Abb. 5a – e, g – i sind repräsentative Darstellungen ähnlicher Ergebnisse. Die zellulären Sphäroiddaten wurden in einem Experiment aus zufällig aliquotierten Mikrogelproben generiert und Abb. 3f und ergänzende Abb. 10 sind repräsentative konfokale mikroskopische Bilder von Sphäroiden mit ähnlichen Zellstrukturen. Alle mikrobiellen Bioverarbeitungsexperimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und ergänzende Abbildung 13 ist ein repräsentativer Satz von Bildern aus dem Experiment zum Gerüstabbau durch das Mikroalgen-Bakterien-Konsortium.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in dieser Studie generierten Daten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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National Key Research and Development Program of China (2021YFC2104300), die National Natural Science Foundation of China (21901117, 32111530117) und State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering (KL20-02) an ZY The Newman Foundation, the Wellcome Trust, der Europäische Forschungsrat im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) über den ERC Grant PhysProt (Vereinbarung Nr. 337969) an TPJK Cancer Research UK (CRUK) und den Cambridge Institute Core Grant (C9545/A29590) an MN; CRUK Early Detection Pump Priming Awards (C20/A20976) an TK und MN Chinese Scholarship Council (YO und HZ).

Chengzhi Guo

Aktuelle Adresse: Department of Chemical Engineering, University College London, Torrington Place, London, WC1E 7JE, UK

Staatliches Schlüssellabor für materialorientierte Chemieingenieurwesen, Hochschule für Chemieingenieurwesen, Nanjing Tech University, 30 Puzhu South Road, Nanjing, 211816, VR China

Yangteng Ou, Yang Zhang, Chengzhi Guo und Ziyi Yu

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Yangteng Ou, Hongjia Zhu, Yanli Zhang und Tuomas PJ Knowles

Cambridge University-Nanjing Centre of Technology and Innovation, 126 Dingshan Street, Nanjing, 210046, VR China

Yangteng Ou

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Shixiang Cao, Wei Yan, Fengxue Xin und Weiliang Dong

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Masashi Narita

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Tuomas PJ Knowles

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YO, TPJK und ZY haben die Experimente konzipiert und gestaltet. YO führte Experimente durch, kuratierte Daten und schrieb das Manuskript. SC, Yang Z., HZ und CG führten Experimente durch. WY und FX lieferten die Informationen und Anweisungen zu den Experimenten mit metabolisch veränderten Mikroorganismen. MN stellte Säugetierzelllinien und eine Gewebekulturanlage zur Verfügung. WD und Yanli Z. halfen bei der Überarbeitung des Papiers. TK und ZY betreuten das Projekt und überarbeiteten das Manuskript. Alle Autoren überprüften die endgültige Version des Papiers und stimmten ihr zu.

Korrespondenz mit PJ Knowles.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Jianhua Qin und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 10. Juni 2022

Angenommen: 21. November 2022

Veröffentlicht: 19. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35140-5

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