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Oct 18, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 294 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Konjugation ist ein kontaktabhängiger Mechanismus für den Transfer von Plasmid-DNA zwischen Bakterienzellen, der zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen beiträgt. Hier verwenden wir Lebendzellmikroskopie, um die intrazelluläre Dynamik des konjugativen Transfers von F-Plasmid in E. coli in Echtzeit zu visualisieren. Wir zeigen, dass die Übertragung von Plasmiden in einzelsträngiger Form (ssDNA) und ihre anschließende Umwandlung in doppelsträngige DNA (dsDNA) schnelle und effiziente Prozesse sind, die mit spezifischem Timing und subzellulärer Lokalisierung ablaufen. Insbesondere bestimmt die Umwandlung von ssDNA in dsDNA den Zeitpunkt der Produktion plasmidkodierter Proteine. Die führende Region, die zuerst in die Empfängerzelle gelangt, trägt einzelsträngige Promotoren, die die frühe und vorübergehende Synthese führender Proteine ​​unmittelbar nach Eintritt des ssDNA-Plasmids ermöglichen. Die anschließende Umwandlung in dsDNA schaltet die führende Genexpression aus und aktiviert die Expression anderer Plasmidgene unter der Kontrolle herkömmlicher doppelsträngiger Promotoren. Diese molekulare Strategie ermöglicht die rechtzeitige Produktion von Faktoren, die nacheinander an der Etablierung, Aufrechterhaltung und Verbreitung des Plasmids beteiligt sind.

Die bakterielle DNA-Konjugation ist ein weit verbreiteter horizontaler Gentransfermechanismus, bei dem genetische Informationen durch direkten Kontakt von einer Spenderzelle auf eine Empfängerzelle übertragen werden1,2,3,4. Die Konjugation ist für die Verbreitung verschiedener Stoffwechseleigenschaften innerhalb und zwischen den Arten verantwortlich und für 80 % der erworbenen Resistenzen bei Bakterien verantwortlich5. Das F-Plasmid war das erste entdeckte konjugative Element1,6 und gilt heute als paradigmatischer Vertreter einer großen Gruppe konjugativer Plasmide, die in Escherichia coli und anderen Enterobacteriaceae-Arten weit verbreitet sind und in denen sie mit der Verbreitung von Colicinen, Virulenzfaktoren und Antibiotika verbunden sind Widerstand7,8,9. Aufgrund ihrer grundlegenden und klinischen Bedeutung standen F-ähnliche Plasmide im Mittelpunkt umfangreicher Studien, die ein detailliertes Verständnis der molekularen Reaktionen und Faktoren lieferten, die an ihrer Übertragung durch Konjugation beteiligt sind3,4.

Innerhalb der Spenderzelle werden die Relaxosomenkomponenten, einschließlich des Integrationswirtsfaktors IHF, der plasmidkodierten akzessorischen Proteine ​​TraY, TraM und der multifunktionalen Relaxase TraI, zum Transferursprung (oriT) des F-Plasmids rekrutiert10,11,12. Der Relaxosomenkomplex wird dann durch das Kopplungsprotein TraD in das Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) rekrutiert, was zur Bildung des Präinitiationskomplexes führt13,14,15,16,17. TraI- und TraD-Proteine ​​sind archetypische Komponenten des Kernsatzes von Untereinheiten, die für den Aufbau der aktiven Konjugationsmaschinerie erforderlich sind, und werden in der gemeinsamen Nomenklatur als VirD2 bzw. VirD4 bezeichnet. Es wird vermutet, dass die Bildung des Paarungspaares ein noch nicht charakterisiertes Signal induziert, das den Präinitiationskomplex aktiviert. Anschließend führt TraI einen orts- und strangspezifischen DNA-Schnitt (Nick) in den oriT des Plasmids ein und bleibt kovalent an das 5′-Phosphatende gebunden. TraI dient auch als Helikase, die das zu übertragende ssDNA-Plasmid, den sogenannten T-Strang, extrudiert18,19,20,21,22,23,24,25,26. Zunächst wurde vermutet und später bestätigt, dass zwei Relaxasen erforderlich sind, um diese Funktionen auszuführen27,28. In diesem Stadium dient das 3'OH des T-Strangs dazu, die Rolling-Circle-Replikation (RCR) zu initiieren, die das intakte zirkuläre ssDNA-Plasmid in der Spenderzelle in dsDNA umwandelt3,29,30, während das 5'-Phosphat an TraI bindet wird durch die T4SS-Maschinerie in die Empfängerzelle übertragen. Während die molekulare Struktur des T4SS gut charakterisiert wurde31,32,33,34, bleibt die Art und Weise, wie der T-Komplex (T-Strang-TraI-Nukleoprotein) durch die Membran der Spender- und Empfängerzellenmembranen transloziert wird, unklar.

Das erste übertragene Segment ist die ~13,5 knt führende Region, die Gene trägt, die das SsbF-Protein-Homolog zum chromosomal kodierten essentiellen Einzelstrang-bindenden Protein Ssb, dem PsiB-Protein (Plasmid SOS Inhibition)35,36,37,38, das hemmt, kodieren SOS-Induktion während der Konjugation39,40 und andere Proteine ​​mit unbekannter Funktion. Bemerkenswerterweise ist die führende Region in verschiedenen enterobakteriellen Plasmiden konserviert, die zu verschiedenen Inkompatibilitätsgruppen gehören41,42,43,44,45,46. Die angrenzende und nächste übertragene ~17-Knoten-Erhaltungsregion trägt das ParABS-ähnliche Plasmid-Partitionssystem (SopABC) und die Ursprünge der vegetativen Replikation47,48,49,50. Das letzte übertragene Segment des F-Plasmids ist die große 33,3 knt tra-Region, die alle Proteinfaktoren kodiert, die für die Verarbeitung und Übertragung der Plasmid-DNA erforderlich sind, einschließlich des Relaxosoms, des T4SS und des Ausschlusssystems gegen Selbstübertragung4. Darüber hinaus tragen F-ähnliche Plasmide häufig Frachtgene, die an verschiedenen Stoffwechselfunktionen beteiligt sind, die üblicherweise zwischen der Erhaltungs- und der Tra-Region integriert sind7,9. Sobald sowohl das 5′- als auch das 3′-Ende des T-Strangs in die Empfängerzelle internalisiert wurden, was nun als Transkonjugant bezeichnet wird, wird das ssDNA-Plasmid durch TraI26,27,51,52 zirkularisiert. Das ssDNA-Plasmid wird durch die Komplementärstrang-Synthesereaktion auch in dsDNA umgewandelt. Ob diese DNA-Synthesereaktion beim Eintritt des Plasmids in die Empfängerzelle stattfindet oder nach der Rezirkularisierung des Plasmids initiiert wird, bleibt unklar. Dennoch ist der Abschluss der Umwandlung von ss-zu-dsDNA für die Plasmidreplikation und -partition erforderlich und daher von entscheidender Bedeutung für die Plasmidstabilität in der neuen Wirtszelllinie.

Das oben beschriebene mechanistische Modell ist gut dokumentiert; Allerdings bleiben die Echtzeitdynamik und die intrazelluläre Organisation der Konjugation im lebenden Bakterium weitgehend unbeschrieben. Insbesondere wissen wir sehr wenig über die subzelluläre Lokalisierung und den Zeitpunkt der Reaktionen in der Empfängerzelle, einschließlich des ssDNA-Plasmideintritts, der ss-zu-dsDNA-Umwandlung und der Plasmid-Genexpression. In Bezug auf Letzteres wurde in frühen Arbeiten berichtet, dass einige führende Gene (ssbF und psiB im F-Plasmid sowie ssbColIb-P9, psiB und ardA im ColIb-P9-Plasmid) nach dem Eintritt des Plasmids in die Akzeptorzelle schnell exprimiert werden36,37, 38,42,53,54. In-vitro-Arbeiten von Masai et al.55 zeigten, dass sich die einzelsträngige Form der nichtkodierenden Frpo-Sequenz, die sich in der führenden Region des F-Plasmids befindet, zu einer Stamm-Schleifen-Struktur faltet, die kanonische −10- und −35-Boxen wiederherstellt. Diese Promotorsequenz kann die E. coli-RNA-Polymerase rekrutieren, die die RNA-Synthese in In-vitro-Assays initiiert55. Zu Frpo homologe Sequenzen wurden auch in der führenden Region von ColIb-P956,57 gefunden. Diese Beobachtungen führten zu dem Vorschlag, dass Frpo-ähnliche Sequenzen als ssDNA-Promotoren fungieren könnten, die die frühe Transkription führender Gene initiieren, wenn das Plasmid noch in ssDNA-Form vorliegt. Ob dieser Regulationsmechanismus während der In-vivo-Konjugation stattfindet, muss noch gezeigt werden.

In dieser Studie verwenden wir Live-Cell-Mikroskopie-Bildgebung, um die vollständige Transfersequenz des nativen F-Plasmids zwischen E. coli K12-Stämmen zu visualisieren. Wir untersuchen die Schlüsselschritte der Konjugation mithilfe speziell entwickelter genetischer Reporter, einschließlich einer fluoreszierenden Fusion des chromosomal kodierten Einzelstrang-Bindungsproteins Ssb (Ssb-Ypet) zur Überwachung des ssDNA-Transfers und des mCherry-ParB/parS-Systems zur Offenlegung des ss -zu-dsDNA-Umwandlung und anschließende Plasmidduplikation sowie translationale Fluoreszenzfusionen zur Quantifizierung und Zeitmessung der plasmidkodierten Produktion in der neuen Wirtszelle58,59. Dieser Ansatz deckt die Choreographie von Konjugationsreaktionen in lebenden Bakterien auf und liefert neue Einblicke in das Zusammenspiel zwischen Plasmidverarbeitung und Genexpression.

Wir haben die dynamische Lokalisierung einer fluoreszierenden endogenen Fusion des chromosomal kodierten Einzelstrang-Bindungsproteins Ssb (Ssb-Ypet) in Spender- und Empfängerzellen während des vegetativen Wachstums und der Konjugation überwacht (Abb. 1a, b und Abb. S1). Während des vegetativen Wachstums bildet Ssb-Ypet diskrete Herde an Mittelzell- und Viertelpositionen im inneren Bereich von Spender- und Empfängerzellen (Abb. 1c und Abb. S2a, b). Diese Ssb-Herde, im Folgenden als Ssb-Replikationsherde bezeichnet, sind mit der ssDNA verbunden, die den Replikationsgabeln auf die Nukleoid-DNA folgt60,61. Während der Konjugation verändert sich die intrazelluläre Lokalisierung von Ssb dramatisch. Wie bereits berichtet58,59 löst der Eintritt des ssDNA-Plasmids in die Empfängerzelle, jetzt Transkonjugant genannt, die Rekrutierung von Ssb-Molekülen und die Bildung heller membrannaher Herde aus, die wir als Ssb-Konjugatherde bezeichnen (Abb. 1b und Abb. S1). Hier beobachten wir auch die Bildung von Ssb-Konjugationsherden in den Spenderzellen und zeigen so das Vorhandensein von ssDNA-Plasmiden auf jeder Seite der Konjugationspore während des Transfers (Abb. 1b und Abb. S1). Die Fokuslokalisierungsanalyse zeigt, dass der Austritt und Eintritt von Plasmiden an bestimmten Membranpositionen innerhalb der Paarungspaarzellen erfolgt. Ssb-Konjugationsherde sind an der Peripherie der Spenderzelle und vorzugsweise an den Viertelpositionen verteilt (Abb. 1c und Abb. S2a, b), was die bevorzugte Position für den Austritt des ssDNA-Plasmids durch aktive Konjugationsporen widerspiegelt. Im Gegensatz dazu erfolgt der Eintritt von ssDNA-Plasmiden überwiegend in den Polarregionen der transkonjuganten Zellen (Abb. 1c und Abb. S2a, b). Mithilfe unserer Daten können wir auch untersuchen, ob die Konjugation in einem bestimmten Stadium des Zellzyklus stattfindet. Die Analyse der Zelllänge als Indikator für das Zellalter zeigt, dass Spender- und Empfängerzellen, die am Plasmidtransfer beteiligt sind, eine ähnliche Längenverteilung aufweisen wie während des vegetativen Wachstums (Abb. 1d). Dies zeigt, dass die Spender das Plasmid in jedem Stadium ihres Zellzyklus, von der Geburt bis zur Zellteilung, spenden und die Empfänger es erwerben können.

a Repräsentative Mikroskopbilder von Spendern und Empfängern, die das ssb-ypet-Fusionsgen während des vegetativen Wachstums tragen. Die Empfänger produzieren auch das diffuse fluoreszierende Protein mCh-ParB. Maßstabsbalken 1 μm. b Zeitraffer-Mikroskopiebilder des Plasmidtransfers zwischen einem Spender (D) und einem Empfänger (R), der in eine transkonjugante Zelle (T) umgewandelt wird. Maßstabsbalken 1 μm. Weitere Ereignisse sind in Abbildung S1 dargestellt. c 2D-Lokalisierungs-Heatmaps von Ssb-Ypet in Spendern, Empfängern und Transkonjuganten während des vegetativen Wachstums (veg.) und der Konjugation (conj.). Normalisierung durch die Zelllänge von (n) einzelnen Zellen aus mindestens drei biologischen Replikaten. Die Dichteskalenleiste befindet sich auf der linken Seite. d Histogramm der Zelllängenverteilung von Spendern, Empfängern und Transkonjuganten (n analysierte Zellen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten). e Zeitpunkt des Auftretens des konjugativen Ssb-Fokus im Spender im Vergleich zu transkonjuganten Zellen. Histogramme mit Mittelwerten und SD stellen den Anteil der Transferereignisse dar, bei denen der Ssb-Fokus in den Spendern vor (–1 Minute), gleichzeitig (0 Minuten) oder nach (+1 Minute; +2 Minuten) in Transkonjuganten auftritt. Angegeben ist die Anzahl (n) der einzelnen Transferereignisse, die aus drei unabhängigen Experimenten analysiert wurden. f Jitter-Diagramm der Fluoreszenzintensität von Ssb-Ypet-Konjugationsherden bei gleichzeitigem Auftreten. Die Anzahl der aus drei unabhängigen Experimenten analysierten Herde (n) wird mit dem entsprechenden Mittelwert und SEM angegeben. Die P-Wert-Signifikanz des zweiseitigen statistischen Mann-Whitney-Tests wird durch ****(P ≤ 0,0001) angegeben. g Jitter-Diagramme der Lebensdauer konjugativer Ssb-Ypet-Foci in Spender- und transkonjuganten Zellen. Die P-Wert-Signifikanz des zweiseitigen statistischen Mann-Whitney-Tests wird durch ****(P = 0,0001) angegeben. Angegeben ist die Anzahl (n) der analysierten Zellen aus mindestens fünf unabhängigen Experimenten. h Violindiagramme der Fluoreszenzschiefe eines freien mCherry und des Ssb-Ypet in Spendern, Empfängern und transkonjuganten Zellen. Der Median, Quartil 1 und Quartil 3 werden durch die Grenzen der Kästchen angezeigt, der Mittelwert durch einen schwarzen Punkt und die Minima und Maxima durch die Grenzen der Whiskers. Schwarze Punkte über und unter den Maximal- und Minimalwerten entsprechen Ausreißern. Kostenlose mCherry-Daten entsprechen einem repräsentativen Experiment. Andere Diagramme entsprechen demselben Datensatz wie in Panel (c) aus mindestens drei biologischen Replikaten. Angegeben ist die Anzahl der analysierten Zellen (n). i Jitter-Diagramm der Intensität der Replikations- und Konjugationsherde von Ssb-Ypet in transkonjuganten Zellen während der Konjugation. Die Zeit 0 Minuten entspricht dem Auftreten des konjugativen Ssb-Ypet-Fokus bei den Empfängern. Die Anzahl der analysierten Zellen (n) aus drei unabhängigen Experimenten wird mit dem entsprechenden Mittelwert und SEM angegeben. Spender (LY1007), Empfänger (LY358), Transkonjugant (LY358 nach Fwt-Erwerb von LY1007); Das freie mCherry wird aus dem Chromosom im MS388-Gewichtshintergrund (LY1737) produziert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Bei 77,8 ± 7 % (n = 131) der einzelnen Plasmidtransferereignisse, die durch Zeitrafferbildgebung (1 Minute/Bild) sichtbar gemacht wurden, erscheinen Ssb-Konjugatherde in den Spender- und Transkonjugantenzellen im selben Bild (Abb. 1e). In diesen Fällen sind die Ssb-Konjugatherde im Transkonjuganten im Durchschnitt heller als in den Spenderzellen, was die relative Menge an ssDNA-Plasmid auf jeder Seite der Konjugationspore widerspiegelt (Abb. 1f). Bei den verbleibenden 22,2 % der Übertragungsereignisse erscheinen Ssb-Konjugatherde zuerst im Transkonjuganten und dann ein oder zwei Minuten später im Spender (Abb. 1e). Die verzögerte Akkumulation von ssDNA im Spender im Vergleich zum Empfänger wird durch die Quantifizierung einer durchschnittlichen Lebensdauer der Ssb-Ypet-Konjugatherde in den Transkonjuganten von 2,9 ± 1,1 Minuten (n = 294) bestätigt, verglichen mit 2,5 ± 1,1 Minuten (n = 197). ) in den Spenderzellen (Abb. 1g). Diese Daten deuten darauf hin, dass das Auftreten konjugativer Herde in den Paarungspaarzellen asynchron erfolgt und legen eine spezifische Sequenz des ssDNA-Transfers nahe. Das erste Segment des T-Strangs, das durch die Helikaseaktivität von TraI in der Spenderzelle erzeugt wird, verweilt nicht lange genug, um Ssb-Moleküle zu rekrutieren, und wird sofort auf den Empfänger übertragen. Erst nach dieser kurzen Transferphase reichert sich die ssDNA auch auf der Spenderseite an, wo sie entweder dem nicht übertragenen Plasmidstrang oder dem T-Strang oder beiden entsprechen kann. Dies impliziert, dass die Rate der ssDNA-Bildung durch die TraI-Helikase-Aktivität schneller ist als die der ssDNA-Entfernung durch den RCR und den Transfer durch den T4SS (siehe Diskussion).

Die Internalisierung einer großen Menge an ssDNA-Plasmiden provoziert die massive Rekrutierung des intrazellulären Pools von Ssb-Molekülen an der Peripherie der Spender- und Transkonjugantenzellen. Diese Änderung der subzellulären Ssb-Ypet-Verteilung wird durch eine Schiefeanalyse aufgedeckt, die ein unverfälschtes Maß für die Asymmetrie der Fluoreszenzverteilung innerhalb der Zellen liefert, ohne dass eine schwellenbasierte Fokuserkennung erforderlich ist (Abb. 1h). Wildtyp-Zellen, die ein freies mCherry (mCh) produzieren, weisen eine geringe Schiefe auf, die der homogenen Pixelfluoreszenzverteilung im Zytoplasma der Zelle entspricht. Während des vegetativen Wachstums ist die Ssb-Ypet-Fluoreszenz teilweise diffus im Zytoplasma und teilweise lokal in Replikationsherden konzentriert, was zu einer Schiefe von ~1,2 führt. Im Vergleich dazu weist Ssb-Ypet während des Plasmidtransfers eine starke Schiefe von ~4,1 bei Spendern und Transkonjuganten auf, was den erhöhten Anteil von Ssb-Molekülen widerspiegelt, die in Brennpunkten geclustert sind. Daher haben wir uns gefragt, welcher Teil der Ssb-Moleküle in konjugativen Herden enthalten ist und ob ihre Bildung mit einer Erschöpfung von Ssb in replikativen Herden in der transkonjuganten Zelle verbunden ist. Um diese Frage zu beantworten, führten wir während des Plasmidtransfers eine automatische Erkennung und Helligkeitsquantifizierung von Ssb-Ypet-Fokus durch (Abb. 1i). Wir beobachten, dass eine Minute nach Beginn des Plasmideintritts noch Replikationsherde von Ssb-Ypet vorhanden sind, aber die Hälfte ihrer ursprünglichen Intensität aufweisen, während Konjugationsherde 35-mal heller sind. Da die gesamte intrazelluläre Ssb-Ypet-Fluoreszenz während des Transfers unverändert bleibt (Abb. S2c), können diese Variationen auf die Verdrängung von Ssb-Ypet-Molekülen auf das eingehende ssDNA-Plasmid und nicht auf die De-novo-Synthese von Ssb-Ypet zurückzuführen sein. Diese Dynamik spiegelt wider, dass das eingehende ssDNA-Plasmid während des Transfers die meisten Ssb-Ypet-Moleküle in der Akzeptorzelle rekrutiert.

Es wurde geschätzt, dass Ssb in etwa etwa 1320 ± 420 Monomeren pro E. coli-Zelle vorhanden ist und dass ein Dimer von Tetrameren in vivo etwa 170 nt abdeckt61. Folglich gibt es nicht genügend Ssb-Kopien pro Zelle, um die 108.000 Nukleotide des ssDNA-F-Plasmids sowie die wenigen Hundert Nukleotide der mit Replikationsgabeln verbundenen ssDNA (~650 nt bei 22 °C62) aufzunehmen. Tatsächlich ist nicht bekannt, ob das F-Plasmid jemals vollständig in ssDNA-Form im Empfänger vorliegt, da nicht bekannt ist, ob die Komplementärstrang-Synthesereaktion gleichzeitig mit oder nach Abschluss des T-Strang-Transfers stattfindet. Dennoch könnte die beobachtete massive Rekrutierung von Ssb-Molekülen auf der eingehenden ssDNA die Ssb-Verfügbarkeit verringern und eine vorübergehende Störung der DNA-Replikation des Wirtschromosoms hervorrufen. Eine Möglichkeit, diese Frage in vivo zu beantworten, besteht darin, eine fluoreszierende Fusion der β2-Clamp-Replisom-Komponente (mCh-DnaN) zu überwachen, die im Zytoplasma nicht replizierender Zellen diffundiert und während des Fortschreitens der DNA-Replikation diskrete Replikosom-assoziierte Herde bildet60, 61,63. Mikroskopische Bildgebung und Schiefeanalyse zeigten keine Veränderung des DnaN-Lokalisierungsmusters vor, während oder nach der Bildung konjugativer Ssb-Herde (Abb. S2d). Dies weist darauf hin, dass die Ssb-Rekrutierung auf dem eingehenden ssDNA-Plasmid nicht zum Zusammenbruch der Replikationsgabel führt. Ob die Geschwindigkeit der DNA-Replikation während dieses vorübergehenden und kurzen Prozesses beeinflusst wird, bleibt eine Möglichkeit.

Die Umwandlung des neu erworbenen ssDNA-Plasmids in dsDNA durch die Komplementärstrang-Synthesereaktion und die anschließenden Plasmid-Duplikationsereignisse wurden mithilfe des parS/ParB-DNA-Markierungssystems analysiert58,59. Die parS-Bindungsstelle wird in das F-Plasmid eingefügt, während das mit mCherry fluoreszierend markierte ParB-Bindungsprotein (mCh-ParB) nur in Empfängerzellen aus einem Plasmid produziert wird. Unter dem Mikroskop wird die Umwandlung von ss in dsDNA durch das Verschwinden des konjugativen Ssb-Ypet-Fokus und die Bildung eines mCh-ParB-Fokus in den transkonjuganten Zellen angezeigt (Abb. 2a). Wir führten zunächst eine Zeitrafferaufnahme (1 Minute/Bild) durch, um die Erfolgsrate und den Zeitpunkt der Umwandlung von ss in dsDNA nach dem Eintritt in ssDNA zu visualisieren (Abb. 2b). Die Analyse zeigt, dass auf das Auftreten des konjugativen Ssb-Ypet-Fokus die Bildung des mCh-ParB-Fokus in 83,3 ± 2,3 % (n = 311) der analysierten einzelnen transkonjuganten Zellen folgt, was darauf hinweist, dass die überwiegende Mehrheit der internalisierten ssDNA-Plasmide erfolgreich umgewandelt wird in dsDNA-Plasmide (Abb. 2c). Bemerkenswerterweise beobachten wir, dass 40 ± 3,2 % (n = 286) der transkonjuganten Zellen, in denen das neu erworbene ssDNA-Plasmid bereits in dsDNA umgewandelt wurde, anschließend zusätzliche ssDNA erhalten (Abb. 2d und Abb. S3a). Wir quantifizieren, dass 92 ± 3,1 % dieser mehrfachen ssDNA-Erfassungsereignisse von demselben Spender stammen, von denen 79 ± 5,3 % offenbar an derselben Membranposition stattfinden, was darauf hindeutet, dass sie durch dieselbe Konjugationspore erfolgen (Abb. S3a). Die Beweise für mehrfache Übertragungen innerhalb eines etablierten Paarungspaares zeigen, dass ein einzelner Spender nacheinander mehrere Kopien des T-Strangs abgeben kann und dass Transkonjuganten, bei denen die Umwandlung von ss-zu-dsDNA bereits erreicht wurde, nicht sofort resistent gegen De-novo-Plasmide werden Erwerb. Dementsprechend wird erwartet, dass der Aufbau einer Immunität gegen die Konjugation durch transkonjugierte Zellen die Produktion der plasmidkodierten Ausschlussproteine ​​TraS und TraT erfordert.

a Zeitrafferbilder, die den ssDNA-Plasmidtransfer zeigen, der durch die Bildung der Ssb-Ypet-Konjugationsherde sowohl in Spender- (D) als auch in Empfängerzellen (R) berichtet wird, gefolgt von der Umwandlung von ss-zu-dsDNA, die durch das Auftreten eines mCh- ParB-Fokus in transkonjuganten (T) Zellen. Maßstabsbalken 1 μm. b Einzelzell-Zeitrafferquantifizierung des Auftretens des Ssb-Ypet-Fokus (blaue Linie) und der ersten Duplikation des mCh-ParB-Fokus (rote Linie) in Bezug auf die Umwandlung von ss in dsDNA, die durch die Bildung des mCh-ParB-Fokus in transkonjuganten Zellen aufgedeckt wird ( 0 Minuten). Das Erscheinungsbild des Ssb-Ypet-Fokus wurde mithilfe von Zeitraffern von 1 Minute/Bild analysiert, während die erste und zweite Vervielfältigung von mCh-ParB mithilfe von Zeitraffern von 5 Minuten/Bild analysiert wurden. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung, die aus der angegebenen Anzahl analysierter Konjugationsereignisse (n) aus sieben unabhängigen Experimenten berechnet wurden. c Histogramm der erfolgreichen ss-zu-dsDNA-Umwandlung, widergespiegelt durch die Umwandlung der konjugierten Ssb-Ypet-Fokus in einen mCh-ParB-Fokus. Der Mittelwert und die SD werden aus (n) einzelnen Transferereignissen von sechs biologischen Replikaten (schwarze Punkte) berechnet. d Histogramm, das den Prozentsatz der Transkonjuganten mit einem mCh-ParB-Fokus zeigt, der mehrere ssDNA-Plasmide erfasst, wie durch das sukzessive Erscheinen des konjugativen Ssb-Ypet-Fokus deutlich wird. Der Mittelwert und die Standardabweichung werden aus (n) einzelnen transkonjuganten Zellen aus sechs biologischen Replikaten (schwarze Punkte) berechnet. e Streudiagramm, das die Zeitverzögerung zwischen dem Auftreten von Ssb-Ypet- und mCh-ParB-Foci in Transkonjuganten zeigt. Angegeben sind der Mittelwert und die SD, die aus (n) einzelnen Ereignissen (blaue Kreise) aus sieben biologischen Replikaten berechnet wurden. f Streudiagramm, das die Zeitverzögerung zwischen dem Erscheinen des mCh-ParB-Fokus und seiner visuellen Duplikation in zwei Fokussen (erste Duplikation) und in drei oder vier Fokussen (zweite Duplikation) zeigt. Angegeben sind der Mittelwert und die SD, die aus (n) einzelnen Duplikationsereignissen (rote Kreise) von mindestens sechs biologischen Replikaten berechnet wurden. g Einzelzell-Zeitrafferquantifizierung der Anzahl der F-Foci pro Zelle im F-tragenden Spenderstamm während des vegetativen Wachstums und in Transkonjuganten nach der F-Plasmid-Erfassung. Für Spender wird die Anzahl der F-Foci pro Zelle (Anzahl der SopB-sfGFP-Foci) in Bezug auf die Zellgeburt (t = 0 min) angezeigt (graue Kurve). Für Transkonjuganten wird die Anzahl der F-Foci pro Zelle (Anzahl der mCh-ParB-Foci) in Bezug auf das Auftreten des mCh-ParB-Fokus (t = 0 min) angezeigt (schwarze Kurve). Der aus (n) einzelnen Zellen aus vier biologischen Replikaten berechnete Mittelwert und die Standardabweichung werden zusammen mit den linearen Anpassungslinien der Kurven (grün und rot) angezeigt. F-tragender Spenderstamm (LY834), Transkonjugant (LY358 nach Fwt-Erwerb). h 2D-Lokalisierungs-Heatmaps von mCh-ParB-Foci zum Zeitpunkt seines Auftretens (oben) und kurz vor seiner Vervielfältigung (unten). Heatmaps sind Normalisierungen anhand der Zelllänge von (n) einzelnen transkonjuganten Zellen aus sieben biologischen Replikaten. a–f, h Fwt-Spender (LY1007), Empfänger (LY358) und Transkonjugant (LY358 nach Fwt-Erwerb). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unter Berücksichtigung nur erfolgreicher ss-to-dsDNA-Ereignisse berechnen wir eine durchschnittliche Zeitverzögerung von 4 ± 1,6 Minuten (n = 475) zwischen dem Auftreten des konjugativen Ssb-Ypet-Fokus und der Bildung des mCh-ParB-Fokus (Abb. 2e). Dieser Zeitraum spiegelt die Zeit wider, die für den Abschluss einer Reaktionskaskade erforderlich ist, die die Internalisierung des ssDNA-Plasmids, die Einleitung der Replikation der Komplementärstrangsynthese und die Rekrutierung von ParB-Molekülen an der parS-Stelle in dsDNA-Form umfasst. Obwohl unser System es nicht ermöglicht, den Beitrag jedes Schritts zu bewerten, zeigen die Ergebnisse, dass die vollständige Abfolge der Reaktionen innerhalb eines relativ kurzen und konsistenten Zeitraums erreicht wird.

Als nächstes führten wir zunächst eine Zeitrafferaufnahme (5 Minuten/Bild) durch, um den Zeitpunkt der Plasmidduplikation in transkonjuganten Zellen (dh Replikation und visuelle Trennung der Plasmidkopien) zu untersuchen (Abb. 2b). Wir schätzen einen durchschnittlichen Zeitraum von 10,4 ± 4,7 Minuten (n = 158) zwischen der Umwandlung von ssDNA in dsDNA und dem ersten Plasmid-Duplikationsereignis (von einem auf zwei mCh-ParB-Foci) und einen ähnlichen Zeitraum von 10,1 ± 5,1 Minuten (n = 124). zwischen dem ersten und dem zweiten Duplikationsereignis (von zwei auf drei oder vier mCh-ParB-Foci) (Abb. 2f). Wir beschlossen dann, die Rate der Plasmidduplikation in Transkonjuganten mit der Rate der Plasmidduplikation in einem vegetativ wachsenden F-tragenden Spenderstamm zu vergleichen. Zu diesem Zweck haben wir die Anzahl der Plasmidherde pro Zelle von der Umwandlung von ss in dsDNA (Erscheinen des mCh-Fokus) bis zur Zellteilung in Transkonjuganten und von der Zellgeburt bis zur Zellteilung in F-tragenden Spenderzellen aufgezeichnet (Abb. 2g). Die Ergebnisse zeigen, dass die Anzahl von F pro Zelle in transkonjuganten Zellen deutlich schneller ansteigt als in vegetativ wachsenden F-tragenden Zellen (75 % Anstieg der Steigung der Anpassungskurve), jedoch zuvor noch keine ähnliche Endzahl von ~4 ± 1 Kopien pro Zelle erreicht hat Teilung (Abb. 2g). Es ist bekannt, dass die F-Kopienzahl, wie auch die Chromosomenreplikation, durch den Verlauf des Zellzyklus gesteuert wird, wobei die Initiierung erfolgt, wenn eine konstante Masse pro Ursprung erreicht wird64. Daher stimmen unsere Beobachtungen mit der Interpretation überein, dass, wenn eine einzelne Plasmidkopie in einer Empfängerzelle ankommt, die sich in einem beliebigen Zellzyklusstadium befinden kann, die Initiierung der Plasmidreplikation nicht unterdrückt wird, bis die spezifische Anzahl von Plasmidkopien pro Zellmasse wiederhergestellt ist. Diese beschleunigte Plasmidreplikation ermöglicht einen schnellen Anstieg der F-Kopienzahl vor der Teilung der transkonjuganten Zellen und erleichtert so die Aufteilung der Plasmidkopien auf Tochterzellen.

Die Lokalisierungsanalyse zeigt, dass die Umwandlung von ss-zu-dsDNA und das erste Duplikationsereignis an unterschiedlichen subzellulären Positionen stattfinden. Der anfängliche mCh-ParB-Fokus erscheint vorzugsweise im Polarbereich der transkonjuganten Zelle, vergleichbar mit der Eintrittsstelle der ssDNA (vergleiche Abb. 2h mit Abb. 1c und Abb. S3b mit Abb. S2a). Ein auffälliger Unterschied besteht darin, dass mCh-ParB-Foci weniger peripher erscheinen, was darauf hindeutet, dass sie nicht so nahe an der Zellmembran liegen wie Ssb-Ypet-Konjugationsherde (vergleiche Abb. 2h mit Abb. 1c und Abb. S3c mit Abb. S2b). Wir beobachten, dass der mCh-ParB-Fokus anschließend vor der Duplizierung in die mittlere Zellposition wandert (Abb. 2h und Abb. S3b, c). Diese Daten zeigen, dass die beiden an der Plasmidverarbeitung beteiligten DNA-Synthesereaktionen (dh die Umwandlung von ss-zu-dsDNA und die Plasmidreplikation) in der neuen Wirtszelle zeitlich und räumlich getrennt sind. Die Rekrutierung der komplementären Strangsynthesemaschinerie und der ss-zu-dsDNA-Replikationsreaktion erfolgt in der Nähe der polaren Eintrittsposition des ssDNA-Plasmids, während die Plasmidreplikation in der Mittelzellregion erfolgt. Insgesamt zeigen diese Analysen, dass Plasmidverarbeitungsschritte (ssDNA-Eintrag, Umwandlung von ss-zu-dsDNA und Plasmidreplikation) an bestimmten intrazellulären Positionen innerhalb der neuen Wirtszelle stattfinden und einer präzisen Chronologie folgen.

Wir konstruierten transkonjugierte Superfolder-gfp-(sfgfp)-Translationsfusionen am 3′-Ende mehrerer Gene, die sich in den verschiedenen funktionellen Regionen des F-Plasmids befinden, um den Produktionszeitpunkt von Plasmid-kodierten Proteinen in transkonjuganten Zellen zu untersuchen, die wir verwenden, um Einblicke in den Zeitablauf zu erhalten der Plasmid-Genexpression (Abb. 3a und Abb. S4a). Die Gene ygfA, ygeA, psiB, yfjB, yfjA und ssbF befinden sich in der führenden Region und werden in der Reihenfolge nach dem Transferursprung oriT übertragen. Das sopB-Gen ist Teil des SopABC-Partitionssystems und befindet sich in der Erhaltungsregion. Die Gene traM, traC, traS und traT befinden sich in der tra-Region, die Faktoren kodiert, die am Plasmidtransfer beteiligt sind. TraM ist das akzessorische Protein des Relaxosomenkomplexes, das für oriT65 rekrutiert wird; TraC ist die Verkehrs-ATPase, die als Hexamer von Dimeren organisiert ist, die an die zytoplasmatischen Flächen von T4SS66 angedockt sind; TraS und TraT entsprechen dem F-Plasmid-Ausschlusssystem (Immunitätssystem), das vor Selbstübertragung schützt67,68,69.

eine genetische Karte des 108-kb-F-Plasmids mit Angabe der führenden (grün), Tra- (rot) und Erhaltungsregionen (blau) sowie der Positionen der untersuchten Gene (Dreiecke). Sterne stellen den genetischen Ort der PlacIQ1sfgfp-Insertionen dar. b Zusammenfassendes Diagramm des Produktionszeitpunkts jeder Plasmid-kodierten Proteinfusion in transkonjuganten Zellen im Hinblick auf den Zeitpunkt der ss-zu-dsDNA-Umwandlung, widergespiegelt durch das Auftreten des mCh-ParB-Fokus (0 Minuten). Das Diagramm stellt Daten aus dem Fold-Change-Anstieg des sfGFP-Signals aus Abb. S5 dar. Die Farben Orange/Grün, Blau und Rot entsprechen der Produktion von Proteinen aus der Leit-, Erhaltungs- und Transferregion. Der Zeitpunkt der zytoplasmatischen sfGFP-Produktion durch den PlacIQ1-Promotor, der in die intergenen Regionen repE-sopA (repE), tnpA-ybaA (tnpA) und traM-traJ (traM) eingefügt ist, ist grau dargestellt. Angegeben ist die Anzahl (n) der einzelnen transkonjuganten Zellen aus mindestens drei analysierten biologischen Replikaten. c Jitter-Diagramme, die die intrazelluläre grüne Fluoreszenz (SNR) für jede sfGFP-Fusion und jeden Reporter in vegetativ wachsenden Spender- (links) und transkonjuganten Zellen (rechts) beim maximalen SNR-Wert aus Abb. S5 zeigen. Jeder Punkt repräsentiert Daten einzelner Zellen. Mittelwerte und SD werden aus der angegebenen (n=) Anzahl transkonjuganter Zellen aus mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten berechnet. Spender von F-Derivaten (siehe Tabelle S1), Empfänger (LY358). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir führten zunächst Zeitverlaufsexperimente durch, bei denen 1, 2, 4 und 6 Stunden nach dem Mischen von Spender- und Empfängerzellen mikroskopische Schnappschüsse der konjugierenden Population aufgenommen wurden. Für jeden Zeitpunkt wurde die Häufigkeit von Transkonjuganten (T/R + T) direkt auf Einzelzellebene anhand des Anteils der Empfängerzellen gemessen, die diffuse mCh-ParB-Fluoreszenz aufwiesen (R), oder der transkonjuganten Zellen, die mCh-ParB-Foci beherbergten (T). ) und das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der intrazellulären grünen Fluoreszenz wurde automatisch gemessen (Abb. S4b – d). Diese Snapshot-Analyse zeigt, dass alle F-Plasmid-Derivate, die sfGFP-Fusionen tragen, ihre Transferfähigkeit beibehielten und nach 6 Stunden Paarung Häufigkeiten von Transkonjuganten zwischen 57 und 95 % ergaben. Außerdem folgt auf die fusionstragende Plasmidakquisition systematisch ein Anstieg des sfGFP-Signals in transkonjuganten Zellen mit sehr unterschiedlichem Zeitpunkt und Ausmaß (Abb. S4b – d).

Eine bessere Auflösung des Produktionsniveaus und des Timings von sfGFP-Fusionen im Hinblick auf die ss-zu-dsDNA-Umwandlung (Erscheinen des mCh-ParB-Fokus) in einzelnen transkonjuganten Zellen wurde durch Zeitrafferbildgebung der Konjugation in der Mikrofluidikkammer erzielt (Filme). S1, S2). Wir führten einen transkonjuganten Zellnachweis und eine Quantifizierung der intrazellulären sfGFP-SNR-Zellen im Zeitverlauf durch (Abb. S5a – d). Als sich die transkonjugante Zelle teilte, setzten wir die Fluoreszenzquantifizierung in den resultierenden Tochterzellen fort, um die sfGFP-Produktion über einen längeren Zeitraum zu überwachen. Aus diesen Rohdaten haben wir den fachen Anstieg des SNR pro 10-Minuten-Intervall berechnet, wobei ein facher Anstieg über 1 zeigt, dass die Fusionen in den Transkonjuganten erzeugt werden (Abb. S5a – d). Diese Daten wurden schließlich in ein umfassendes Diagramm übersetzt, das die Produktionszeitfenster für jede Fusion in transkonjuganten Zellen im Verhältnis zum ss-zu-dsDNA-Umwandlungsereignis darstellt (Abb. 3b). Diese Analyse zeigt, dass Fusionen, die zu den verschiedenen Plasmidregionen gehören, spezifische Produktionszeitpunkte in Bezug auf die Plasmidverarbeitungsschritte aufweisen.

Bemerkenswerterweise erkennen wir die synchrone Produktion der führenden YgeA-, PsiB-, YfjB-, YfjA- und SsbF-Fusionsproteine ​​bereits vor dem Auftreten des mCh-ParB-Fokus (Abb. 3b und Abb. S5a). Darüber hinaus ist die Produktion dieser Fusionen nur vorübergehend, da sie nach ca. 5 Minuten ihren Höhepunkt erreicht und 25–35 Minuten nach der Umwandlung von ss in dsDNA stoppt. Diese unerwartete Beobachtung weist darauf hin, dass die Produktion führender Fusionen beginnt, wenn das Plasmid noch in der ssDNA-Form vorliegt, und schnell aufhört, nachdem das Plasmid in die dsDNA-Form umgewandelt wurde. Eine interessante Ausnahme ist YgfA-sfGFP, bei dem die Produktion erst im 10–20-Minuten-Intervall nach dem Auftreten des mCh-ParB-Fokus festgestellt wird. Das ygfA-Gen ist dem oriT am nächsten und daher das erste Gen, das auf den Empfänger übertragen wird (Abb. 3a und Abb. S4a). Die Ausrichtung des ygfA-Gens ist jedoch entgegengesetzt zu anderen getesteten Leitgenen, was bedeutet, dass der T-Strang nicht dem Matrizenstrang für die ygfA-Transkription entspricht. Folglich und im Einklang mit unseren Beobachtungen kann die Expression von ygfA erst nach der Synthese des komplementären Matrizenstrangs durch die Umwandlung von ss in dsDNA erfolgen.

Auf die Umwandlung von ss in dsDNA folgt die Produktion von Erhaltungs- und Tra-Proteinen, beginnend mit SopB und TraM, dann TraC und schließlich TraS- und TraT-Fusionen (Abb. 3b und Abb. S5b, c). Es wird erwartet, dass die Herstellung dieser Fusionen die Anwesenheit des Plasmids in dsDNA-Form erfordert, da bekannt ist, dass die entsprechenden Gene durch dsDNA-Promotoren kontrolliert werden (PsopAB für sopB, PM für traM und PY für traC und traST). Doch was könnte die beobachteten Unterschiede in den Produktionszeiten erklären? Wir untersuchten, ob zeitliche Diskrepanzen einfach die Position der Fusionen auf der genetischen Karte des F-Plasmids erklären könnten. Diese Möglichkeit wurde durch die Beobachtung ausgeschlossen, dass die Insertion des konstitutiven Fluoreszenzreporters PlacIQ1sfGFP (sfgfp-Gen unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors PlacIQ1) in die intergenen Regionen repE-sopA, tnpA-ybaA und traM-traJ zu ähnlichen sfGFP-Produktionszeiten führte das 0–10-Minuten-Intervall nach dem Erscheinen des mCh-ParB-Fokus (Abb. 3b und Abb. S5d). Stattdessen schlagen wir vor, dass die unterschiedlichen Produktionszeitpunkte von Erhaltungs- und Tra-Genen die Aktivität und Regulierung der Promotoren der entsprechenden Gene widerspiegeln. Das sopAB-Operon steht unter der Kontrolle des PsopAB-Promotors, der durch SopA-Bindung unterdrückt wird. Daher wird erwartet, dass der PsopAB-Promotor in transkonjuganten Zellen ohne SopA vollständig unreprimiert und aktiv ist und so die schnelle Produktion des SopAB-Partitionskomplexes ermöglicht, der für die Plasmidstabilität und Vererbung über Zellteilungen hinweg erforderlich ist. Das traM-Gen wird durch den PM-Promotor kontrolliert, der schwach, aber konstitutiv aktiv ist, noch bevor er durch Bindung des TraY-Proteins vollständig aktiviert wird70. Im Gegensatz dazu muss der PY-Promotor, der die Expression der traC-, traS- und traT-Gene steuert, durch das TraJ-Protein aktiviert werden, das vom traJ-Gen unter der Kontrolle seines eigenen Promotors PJ kodiert wird und sich stromaufwärts von PY4 befindet. Die Notwendigkeit dieser Aktivierungskaskade erklärt wahrscheinlich die verzögerte Produktion von TraC, TraS und TraT. Die zusätzliche Verzögerung zwischen der Produktion von TraC- und TraS/TraT-Fusionen könnte möglicherweise den relativen Abstand dieser Gene zum PY-Promotor widerspiegeln (5,9 kb für traC und 20,4 kb für traST). Es ist wichtig zu betonen, dass das F-Plasmid eine natürlich vorkommende Insertion der IS3-Insertionssequenz in das finO-Gen des FinOP-Fruchtbarkeitshemmsystems trägt, was zur Hochregulierung und konstitutiven Expression von tra-Genen führt71. Daher wird erwartet, dass andere IncF-Plasmide, in denen das FinOP-Regulationssystem noch aktiv ist, andere Zeitabläufe und Produktionsniveaus der Tra-Proteine ​​aufweisen als hier berichtet.

Bemerkenswerterweise erreichen die intrazellulären Spiegel von Tra-Proteinen in transkonjuganten Zellen zwischen 60 und 90 Minuten nach der Umwandlung von ss in dsDNA ein Plateau und bleiben während unserer Beobachtungen stabil (Abb. 3b und Abb. S5c). Dies bedeutet, dass die transkonjuganten Zellen zu diesem Zeitpunkt die Transfermaschinerie und das Ausschlusssystem hergestellt haben und höchstwahrscheinlich in kompetente Plasmidspender umgewandelt wurden. Zur Unterstützung dieser Interpretation werden TraM, TraC, TraS, TraT und SopB in vegetativ wachsenden F-tragenden Spenderzellen in ähnlichen Mengen nachgewiesen (Abb. 3c und Abb. S4c, d, S5b, c). Dies ist nicht der Fall für YgeA-, PsiB-, YfjB-, YfjA- und SsbF-Leitproteine, deren intrazelluläre Spiegel 25–35 Minuten nach der Umwandlung von ss in dsDNA in den Transkonjuganten zu sinken beginnen und die in vegetativ wachsenden Spenderzellen nicht nachgewiesen werden ( Abb. 3c und Abb. S4b,S5a). Diese Ergebnisse stimmen mit der Interpretation überein, dass führende Proteine ​​schnell und nur vorübergehend beim Eintritt des ssDNA-Plasmids in die Empfängerzellen produziert werden und nicht, wenn das Plasmid während der vegetativen Replikation in dsDNA-Form gehalten wird.

Zusammen mit früheren Arbeiten37,38,54,56 unterstützt die frühe und vorübergehende Expression führender Gene in transkonjuganten Zellen die Existenz spezifischer Sequenzen, die als einzelsträngige Promotoren fungieren würden, um die Transkription führender Gene aus dem internalisierten ssDNA-Plasmid zu initiieren. Mithilfe einer bioinformatischen Analyse identifizierten wir eine Region stromaufwärts der Gene ssbF, yfjA, yfjB, psiA und psiB, die wir Frpo2 nannten und die 92 % Identität mit der zuvor gemeldeten Frpo-Region (umbenannt in Frpo1) aufweist, die sich stromaufwärts von ygeA und ygeB befindet und zuvor charakterisiert wurde in vitro55 (Abb. 4a). Die Vorhersage der DNA-Faltung mit mFold (http://www.unafold.org) zeigt, dass sich die einzelsträngige Form von Frpo2 zu einer äußerst stabilen Stamm-Schleifen-Struktur falten kann, die auch kanonische −10- und −35-Boxen trägt, ähnlich wie Frpo1 Region (Abb. S6a)55. Wir untersuchten die Auswirkung von Frpo1- oder Frpo2-Deletionen auf die Expression der Downstream-Gene in transkonjuganten Zellen mittels Lebendzellmikroskopie. Die mikroskopische Analyse von transkonjuganten Zellen, die F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp, F ΔFrpo2 ssbF-sfgfp oder F ΔFrpo2 yjfA-sfgfp erhielten, ergab keinen signifikanten Anstieg der sfGFP-Fluoreszenz vor oder nach der Umwandlung von ss in dsDNA in den transkonjuganten Zellen (Abb. 4b).

eine genetische Karte der führenden Region, die die Position der Gene (grün für untersuchte sfGFP-Fusionen und weiß für die anderen Gene) und Frpo1- und Frpo2-Promotoren (rot) (oben) zeigt. Das untere Diagramm zeigt die Stamm-Schleifen-Struktur, die durch die ssDNA-Formen der Frpo1- und Frpo2-Sequenzen gebildet wird (detailliert in Abb. S6). b Histogramme der intrazellulären sfGFP-Faltenzunahme in Transkonjuganten nach dem Erwerb von F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp, F ΔFrpo2 ssb-sfgfp und F ΔFrpo2 yfjA-sfgfp. Mittelwert und SD werden aus den angegebenen (n) einzelnen transkonjuganten Zellen berechnet, die aus mindestens drei unabhängigen Experimenten analysiert wurden. Die mit dem Fwt-Plasmid aus Abb. S5a erhaltenen Werte sind als Referenz grün dargestellt. Spender von F ΔFrpo1 ygeA-sfgfp (LY1368), F ΔFrpo2 ssb-sfgfp (LY1365), F ΔFrpo2 yfjA-sfgfp (LY1364) und dem Empfänger (LY318). c Histogramme von Fwt, Deletionsmutanten F ΔFrpo1, F ΔygeA, F ΔFrpo1 ΔygeA, F ΔFrpo1 ΔygeAB, FΔFrpo2 und FΔssbF Häufigkeit des Transkonjuganten (T/R + T), geschätzt durch Plattierungstests. Mittelwert und SD werden aus drei unabhängigen Experimenten berechnet (dargestellt als einzelne schwarze Punkte). P-Wert-Signifikanz ns und ****P ≤ 0,0001 wurden aus einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett ermittelt. Spender von Fwt (LY875), F ΔFrpo1 (LY824), F ΔygeA (LY160), F ΔFrpo1 ΔygeA (LY1424), F ΔFrpo1 ΔygeAB (LY1425), F ΔFrpo2 (LY823), F ΔssbF (LY755), Empfänger (MS428). d Einzelzell-Zeitrafferquantifizierung des Auftretens des Ssb-Ypet-Fokus (blaue Linie) und der ersten Duplikation des mCh-ParB-Fokus (rote Linie) in Bezug auf die Bildung des mCh-ParB-Fokus in transkonjuganten Zellen (0 Min.), die das FΔssbF-Plasmid erhalten. Angegeben ist die Anzahl der analysierten Konjugationsereignisse (n) aus fünf unabhängigen biologischen Replikaten. Die in Abb. 2b mit dem Fwt-Plasmid erhaltenen Ergebnisse sind zum Vergleich grau dargestellt. e Streudiagramm, das die Zeitverzögerung zwischen dem Erscheinen des Ssb-Ypet-Fokus und dem Erscheinen des mCh-ParB-Fokus in transkonjuganten Zellen nach dem Erwerb des F ΔssbF-Plasmids zeigt. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung, die aus (n) einzelnen SS-zu-DsDNA-Konvertierungsereignissen (blaue Kreise) aus fünf biologischen Replikaten berechnet wurden. Die P-Wert-Signifikanz ns (> 0, 05 nicht signifikant) wurde aus dem zweiseitigen statistischen Mann-Whitney-Test anhand der mit dem Fwt-Plasmid erhaltenen Ergebnisse ermittelt (Abb. 2e). f Streudiagramm, das die Zeitverzögerung zwischen dem Erscheinen des mCh-ParB-Fokus und seiner visuellen Duplikation in zwei Fokussen (erste Duplikation) und in drei oder vier Fokussen (zweite Duplikation) in transkonjuganten Zellen nach Erwerb des F ΔssbF-Plasmids zeigt. Angegeben sind der Mittelwert und die SD, die aus (n) einzelnen Duplikationsereignissen (rote Kreise) aus acht biologischen Replikaten berechnet wurden. P-Wert-Signifikanz **P = 0,0023 und ***P = 0,0007 wurden aus dem zweiseitigen statistischen Mann-Whitney-Test im Vergleich zu den mit dem Fwt-Plasmid erhaltenen Ergebnissen erhalten (Abb. 2f). Spender F ΔssbF (LY1068), Empfänger (LY358). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend untersuchten wir den Einfluss von Frpo1- und Frpo2-Deletionen auf die Effizienz der Konjugation nach drei Stunden Paarung, wie durch Plattierungstests geschätzt (Abb. 4c). F ΔFrpo1 weist eine deutlich reduzierte Häufigkeit von Transkonjuganten von 25,2 ± 2,9 % im Vergleich zu 92,6 ± 6,6 % beim Fwt auf. Vergleichbare Ergebnisse wurden für F ΔFrpo1 ΔygeAB (32,7 ± 7,1) und F ΔFrpo1 ΔygeA (14,5 ± 0,4) erhalten. Überraschenderweise verringert die einzelne Deletion von ygeA die Konjugationseffizienz noch weiter (3,9 ± 1,9 %), und trotz unserer mehrfachen Versuche konnte die Deletion von ygeB allein nie konstruiert werden. Im Gegensatz dazu haben die Deletionen von Frpo2 oder ssbF keinen signifikanten Einfluss auf die Konjugationseffizienz. Diese Ergebnisse zeigen, dass Frpo1 und Frpo2 für die frühe Expression der Downstream-Gene beim Plasmideintritt in Empfängerzellen während der Konjugation in vivo erforderlich sind. Allerdings scheinen Gene unter der Kontrolle von Frpo1 eine wichtigere Rolle bei der Konjugation zu spielen als solche unter der Kontrolle von Frpo2.

Die schnelle und vorübergehende Expression führender Gene beim Plasmideintritt lässt stark darauf schließen, dass führende Proteine ​​in den frühen Schritten der Plasmidetablierung in der neuen Wirtszelle eine wesentliche Rolle spielen. Die in verschiedenen enterobakteriellen Plasmiden konservierte führende Region kodiert ein Homolog des Einzelstrang-bindenden Proteins Ssb, das auf dem E. coli-Chromosom kodiert41,43,54,72,73,74. Das chromosomal kodierte ssb-Gen ist in allen Bakterienorganismen konserviert und essentiell, was die Frage nach der Daseinsberechtigung von Plasmid-geborenen ssb-Homologen aufwirft. Frühe Studien zeigen, dass das vom F-Plasmid kodierte SsbF teilweise bedingte Mutationen des chromosomalen ssb-Gens ergänzen kann73,75. Konsequenterweise führten wir eine gleichzeitige Visualisierung von SsbF-mCh durch, das aus einem pTrc99a-ssbF-mch-Plasmid und dem chromosomal kodierten Ssb-Ypet hergestellt wurde (Abb. S7a) und beobachteten eine ähnliche intrazelluläre Positionierung (Abb. S7b), die durch Kolokalisationsanalyse bestätigt wurde (Abb. S7c). . Dies weist darauf hin, dass sowohl das Plasmid SsbF als auch das Wirts-Ssb für die ssDNA rekrutiert werden, die den Replikationsgabeln in vegetativ wachsenden Zellen folgt. In ähnlicher Weise bildet SsbF-sfGFP auch Herde in transkonjuganten Zellen, die das F-ssbF-sfgfp-Plasmid erworben haben, hauptsächlich während der ersten und zweiten Plasmidduplikationsereignisse (Abb. S7d, e). Dennoch ist die Rolle von SsbF während der Konjugation noch unklar und seine Deletion aus dem F-Plasmid hat keinen signifikanten Einfluss auf die Konjugationseffizienz (Abb. 4c).

Um weitere Einblicke in die Rolle von SsbF während der Konjugation zu erhalten, haben wir die Dynamik des ssDNA-Eintritts, der Umwandlung von ss in dsDNA und der Duplikation des F ΔssbF-Plasmids erneut untersucht. Die Bildanalyse mit Zeitraffermikroskopie zeigt, dass die Deletion von SsbF keinen Einfluss auf die Dynamik der Ssb-Ypet-Konjugatherde (Abb. 4d) oder den Zeitpunkt der Umwandlung von ss in dsDNA hat (vergleiche Abb. 4e mit Abb. 2e). Allerdings verzögert die SsbF-Deletion den Zeitpunkt der Plasmidduplikation in transkonjuganten Zellen dramatisch (vergleiche Abb. 4f mit Abb. 2f). Die Zeitverzögerung zwischen dem Auftreten von mCh-ParB und der ersten Duplikation wird um ~58 % erhöht (von 10,4 ± 4,7 für Fwt auf 16,4 ± 9,5 für F ΔssbF), und die Zeit zwischen dem ersten und zweiten Plasmidreplikationsereignis wird um ~29 erhöht % (von 10,1 ± 4,7 für Fwt bis 13 ± 8 für F ΔssbF). Dies weist darauf hin, dass SsbF eine Rolle bei der Erleichterung der ersten Runden der Plasmidduplikation in der neuen transkonjuganten Zelle spielt, möglicherweise durch Vergrößerung des zellulären Pools an Einzelstrang-Bindungsproteinen, die für die DNA-Replikation verfügbar sind. Diese Funktion erscheint entbehrlich, da das Fehlen von SsbF die Plasmidduplikation verzögert, jedoch keinen Einfluss auf die endgültige Effizienz der Konjugation hat, zumindest wenn die Konjugation unter optimalen Bedingungen zwischen E. coli MG1655-Stämmen durchgeführt wird.

Unser aktuelles Wissen über Konjugation stammt hauptsächlich aus experimentellen genetischen, biochemischen und strukturellen Studien, die ein gut dokumentiertes Verständnis der molekularen Reaktionen und Faktoren lieferten, die am DNA-Transfer beteiligt sind, während genomische und rechnerische Studien die Vielfalt konjugativer Plasmide und ihre Bedeutung für die Epidemiologie aufdeckten der Verbreitung von Antibiotikaresistenzen. Erst vor kurzem hat die Anwendung der optischen Mikroskopie begonnen, Einblicke in die Organisation der Konjugation auf zellulärer Ebene zu liefern58,59,76,77,78,79,80,81,82. In dieser Studie bietet die Mikroskopie lebender Zellen in Kombination mit speziell entwickelten Fluoreszenzreportern einen einzigartigen Blick auf die zelluläre Dynamik der Konjugation und liefert gleichzeitig Einblicke in den Zeitpunkt und die Lokalisierung jedes wichtigen Schritts.

Wir berichten über das Vorhandensein von ssDNA-Plasmid sowohl auf der Spender- als auch auf der Empfängerseite während des Plasmidtransfers. Bemerkenswert ist, dass das ssDNA-Plasmid nicht zufällig positioniert ist, sondern stattdessen bestimmten subzellulären Orten innerhalb der Paarungspaarzellen zugeordnet ist. Der Austrittspunkt des ssDNA F-Plasmids befindet sich vorzugsweise auf der Seite der Spenderzelle und vorzugsweise an Viertelpositionen. Dieses Muster könnte die intrazelluläre Position der T4SS-Maschinerie des F-Plasmids widerspiegeln, die unseres Wissens noch beschrieben werden muss. Diese Möglichkeit würde geschwächt, wenn die F-Plasmid-T4SS-Maschinerie homogen in der gesamten Peripherie der Zellen lokalisiert wäre, wie im Fall der pTi- und R388-Plasmide79,81. Alternativ könnte die seitliche Lokalisierung aktiver Konjugationsporen den erleichterten Zugang zu F-Plasmidmolekülen widerspiegeln, die ebenfalls an Viertelpositionen positioniert und von den Zellpolen ausgeschlossen sind83,84. Im Gegensatz dazu gelangt die ssDNA hauptsächlich in die Polarregion der Empfängerzellen. Dies könnte darauf hindeuten, dass der Pol der Empfängeroberfläche der bevorzugte Ort für den F-Pilus des Spenders ist. Bindung oder Stabilisierung des Paarungspaares. Letztere Möglichkeit wird durch die Tatsache verstärkt, dass die Paarungspaarstabilisierung während der F-Konjugation eine Wechselwirkung zwischen dem an der Oberfläche der Spenderzellen exponierten Plasmidprotein TraN und dem äußeren Wirtsmembranprotein OmpA der Empfängerzellen beinhaltet82,85. OmpA erwies sich als angereichert und weniger mobil in den Polarregionen von E. coli-Zellen86, was möglicherweise die Stabilisierung des Paarungspaares und der Konjugationspore an dieser Stelle begünstigt.

Der unerwartete Befund, dass die ssDNA zuerst in der Empfängerzelle erscheint und sich später während der Konjugation im Spender anreichert, liefert auch Einblicke in die Aktivität von TraI und seine Koordination mit der Übertragung des T-Strangs durch das T4SS oder die RCR des Nicht- übertragener Strang. Vor Beginn des DNA-Transfers wird das an das oriT des Plasmids gebundene Relaxosom durch das TraD-Kopplungsprotein an T4SS angedockt und bildet so den Vorinitiationskomplex (Abb. 5a(i)). Es wird angenommen, dass der Kontakt mit der Empfängerzelle ein Signal induziert, das den Präinitiationskomplex aktiviert. Wir entdecken die Existenz eines kurzen Zeitraums, in dem ein Teil des T-Strangs bereits in die Empfängerzelle übertragen wurde, während im Spender keine ssDNA vorhanden war (Abb. 5a(ii). In diesem Stadium fehlt ssDNA im Spender Dies impliziert, dass die gesamte von TraI erzeugte ssDNA entfernt wurde, sowohl durch Übertragung des T-Strangs durch T4SS als auch durch Komplementierung des nicht übertragenen ssDNA-Strangs durch RCR. Nach diesem vorübergehenden Schritt reichert sich die ssDNA auch im Spender an. Dies legt nahe, dass die ssDNA durch die TraI-Helikaseaktivität im Spender schneller erzeugt wird, als sie durch Transfer und RCR-Synthese entfernt wird (Abb. 5a (iii)).

a(i) Vor Beginn der Konjugation wird der an den Transferursprung des Plasmids gebundene Präinitiationskomplex an das Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) angedockt. (ii) Die Bildung des Paarungspaares überträgt ein Signal, das den Präinitiationskomplex aktiviert. Die Entwindung des dsDNA-Plasmids durch die Helikaseaktivität von TraI erzeugt das erste Segment des T-Strangs, der sofort in die Empfängerzelle übertragen wird, wo er Ssb-Moleküle rekrutiert, während der nicht übertragene Strang durch Rolling-Circle-Replikation ergänzt wird ( RCR) in der Spenderzelle. (iii) Die Helikaseaktivität von TraI erzeugt ssDNA mit einer höheren Rate als der T-Strang durch T4SS übertragen wird oder der nicht übertragene Strang durch RCR ergänzt wird, was zur Akkumulation von ssDNA-Plasmiden führt, die mit Ssb-Molekülen im Spender beschichtet sind Zelle. b Beim Eintritt des ssDNA-Plasmids in die Empfängerzelle bilden die führenden Frpo1- und Frpo2-Sequenzen Stamm-Schleifen-Strukturen, die als Promotoren dienen und die Transkription der nachgeschalteten führenden Gene initiieren, was schnell zur Produktion führender Proteine ​​führt. Die anschließende Umwandlung von ss in dsDNA inaktiviert Frpo1 und Frpo2 und lizenziert die Expression anderer Plasmidgene unter der Kontrolle herkömmlicher dsDNA-Promotoren. Die Produktion von Erhaltungs-, Transfer- und anderen Plasmid-kodierten Proteinen führt schließlich zur Entwicklung neuer Funktionen durch die transkonjugierte Zelle.

Unter der Annahme, dass die Lebensdauer der Ssb-Ypet-Foci in Transkonjuganten von 2,9 ± 1,1 Minuten die Zeit widerspiegelt, die erforderlich ist, um die Internalisierung des 108.000 nt ssDNA F-Plasmids abzuschließen, haben wir eine s−1-Transferrate von 620 ± 164 nt berechnet. Dies stimmt einigermaßen mit der historischen Rate von 770 nt s−1 überein, die anhand der 100 Minuten geschätzt wurde, die für die Übertragung des gesamten 4,6-Mb-E.-coli-Chromosoms erforderlich waren87. Außerdem wurde die Geschwindigkeit der DNA-Synthese durch das DNA-Polymerase III-Holoenzym während der RCR auf 650–750 nuc s−1 88 geschätzt. Im Vergleich dazu wurde die Geschwindigkeit der TraI-Helikase-Aktivität auf 1120 ± 160 bp s−189 gemessen. Diese Schätzungen stützen die Ansicht, dass die ssDNA-Akkumulation im Spender für die schnellere Rate der TraI-Helikase-Aktivität verantwortlich ist als die Rate des T-Strang-Plasmidtransfers oder der RCR. Daher ist es möglich, dass im Gegensatz zu dem zuvor vorgeschlagenen, aber nie nachgewiesenen Vorschlag die Helikaseaktivität der Relaxase nicht streng mit der Aktivität der DNA-Translokation durch T4SS gekoppelt ist.

Die Mikroskopie lebender Zellen deckt die globalen chronologischen Konjugationsschritte auf, wie in Abb. 5b zusammengefasst. Die Plasmidverarbeitung in der transkonjuganten Zelle ist ein relativ schneller Prozess, da der Eintritt des ssDNA-Plasmids und seine Umwandlung in dsDNA im Durchschnitt in etwa 4 Minuten abgeschlossen ist. Am wichtigsten ist, dass das ss-zu-dsDNA-Konvertierungsereignis das entscheidende Ereignis ist, das das Programm der Plasmid-Genexpression bestimmt. Führende Gene gelangen als erste in die Empfängerzelle und werden auch als erste vom F-Plasmid in ssDNA-Form exprimiert. In Übereinstimmung mit früheren Vorschlägen55,56,57 zeigen wir, dass die frühe Expression führender Gene von Sequenzen abhängt, die als einzelsträngige Promotoren fungieren, wenn das Plasmid noch in ssDNA-Form vorliegt. Wie zuvor für Frpo1 beschrieben, schlagen wir vor, dass sich die hier identifizierten hochhomologen Frpo2-Sequenzen zu stabilen Stamm-Schleifen-Strukturen falten, die −35- und −10-Konsensusboxen rekonstruieren, was zur Initiierung der Transkription führt.

Die Expression führender Gene ist ebenfalls vorübergehend, da die Umwandlung von ss-zu-dsDNA die Produktion führender Proteine ​​durch die Inaktivierung von Frpo1- und Frpo2-Promotoren abschaltet und gleichzeitig die Expression von Erhaltungs-, Transfer- und anderen Plasmidgenen unter der Kontrolle herkömmlicher dsDNA-Promotoren lizenziert, die häufig deren eigenen unterliegen Besonderheiten der Regulierung. Die Erhaltungs- und Transferproteinspiegel in Transkonjuganten erreichen je nach Protein in etwa 30 bis 90 Minuten einen Steady-State, der dem von vegetativ wachsenden F-haltigen Zellen entspricht. Interessanterweise haben unsere früheren Arbeiten gezeigt, dass Tetracyclin-Resistenzfaktoren, die durch das Tn10-Transposon kodiert werden, das in die intergenische Region ybdB-ybfA des F-Plasmids eingefügt wird, ebenfalls unmittelbar nach der Umwandlung von ss in dsDNA produziert werden und innerhalb von etwa 90 Minuten das Niveau der resistenten Zelle erreichen58. Diese Ergebnisse deuten übereinstimmend darauf hin, dass diese Zeitskala dem Zeitraum entspricht, den die transkonjuganten Zellen benötigen, um plasmidkodierte Funktionen zu erlangen, einschließlich Plasmiderhaltung, Konjugationsfähigkeit, Immunität gegen Selbstübertragung und zusätzliche Resistenz, die möglicherweise vom Plasmid getragen wird.

Die Regulierung der Plasmid-Genexpression durch Plasmidverarbeitung ist eine elegante Möglichkeit, die sequentielle und zeitnahe Produktion von Plasmidproteinen in der transkonjuganten Zelle sicherzustellen und insbesondere die Produktion von Leitfaktoren auf ein enges Zeitfenster nach dem Eintritt des ssDNA-Plasmids zu beschränken. Die De-novo-Proteinsynthese ist jedoch möglicherweise nicht die einzige Möglichkeit, die transkonjugierte Zelle mit plasmidkodierten Proteinen zu versorgen. Aktuelle Arbeiten von Al Mamun et al. berichtet, dass die Übertragung des F-ähnlichen Plasmids pED208 (IncFV) mit der Translokation mehrerer Plasmid-kodierter Proteine ​​einhergeht, darunter TraI, ParA, ParB1, das Ssb-Homolog SsbED208, ParB2, PsiB und PsiA90. Die Proteintranslokation wurde mit geringer Häufigkeit (10–5 Rekombinanten pro Spenderzelle zwischen einer und fünf Stunden Paarung) mithilfe eines hochempfindlichen Cre-Rekombinase-Assays nachgewiesen. Eine Proteintranslokation könnte auch während der Übertragung des nativen F-Plasmids auftreten, konnte jedoch nicht allein unsere Beobachtungen erklären. Tatsächlich zeigt unsere mikroskopische Analyse, dass YgeA-, PsiB-, YfjB-, YfjA- und SsbF-führende Fusionen in Spenderzellen unter der mikroskopischen Nachweisschwelle liegen, in allen transkonjuganten Zellen jedoch in signifikanten intrazellulären Mengen quantifiziert werden. Dies impliziert, dass die in den transkonjuganten Zellen beobachteten Mengen an führenden Proteinen nicht nur von Spenderzellen stammen können, sondern aus der De-novo-Proteinsynthese resultieren, die, wie wir zeigen, von den Frpo1- und Frpo2-Sequenzen abhängt. Daher ist es wahrscheinlich, dass die direkte Proteintranslokation und die De-novo-Synthese gleichzeitige Mechanismen sind, die das Vorhandensein führender Faktoren und damit verbundener Funktionen unmittelbar nach Eintritt des ssDNA-Plasmids in die transkonjugierte Zelle sicherstellen. Dies deutet weiter auf die entscheidende Rolle der führenden Region bei der Konjugation hin. Mehrere Elemente unterstützen diese Ansicht. Die führende Region ist in einer Vielzahl konjugativer Plasmide41,42,43,44,45,46 konserviert. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die führenden Regionen von Plasmiden, die zu einem breiten Spektrum von Inkompatibilitätsgruppen (IncF, IncN, IncP9 und IncW) gehören und unter Verwendung der Relaxase als phylogenetischem Marker als MOBF-Plasmide klassifiziert wurden, das bevorzugte Ziel für gegen gerichtete CRISPR-Cas-Systeme sind Konjugation8,91,92. Kürzlich wurde gezeigt, dass die führende Region ein wichtiges evolutionäres Ziel für die Verbreitung des pESBL (IncI)-Plasmids ist93. Bezüglich des F-Plasmids können wir betonen, dass Frpo1 und Frpo2 auf Nukleotidebene eine Ähnlichkeit von 92 % aufweisen und nur etwa 5 kb voneinander entfernt sind. Dies impliziert, dass Frpo1- und Frpo2-Sequenzen in dsDNA-Form während der vegetativen Plasmidreplikation ein potenzielles Substrat für die homologe Rekombination wären, was zur Löschung des dazwischen liegenden Segments führen würde. Das dazwischenliegende Segment trägt jedoch die flmAB-Gene, funktionelle Homologe zum hok/sok-Toxin-Antitoxin-System des R1-Plasmids94, die wahrscheinlich die Stabilität der führenden Region gewährleisten.

Trotz dieser Fülle an Beweisen ist es derzeit schwierig, die Bedeutung der Leitregion zu verstehen, da die molekularen Funktionen der meisten Leitproteine ​​noch unbekannt sind. Unsere Daten zeigen, dass Gene stromabwärts von Frpo1 (ygeA und ygeB) eine entscheidende Funktion bei der Konjugation haben. Im Gegensatz dazu scheinen Gene, die sich stromabwärts von Frpo2 befinden (ssbF, yfjA, yfjB, psiB, psiA und flmC), entbehrlich zu sein, da Deletionen von Frpo2, ssbF oder psiB44 keinen signifikanten Einfluss auf die Gesamtkonjugationseffizienz haben, die durch Plattierungstests untersucht wird. Es wurde jedoch gezeigt, dass SsbF und PsiB die konjugationsinduzierte SOS-Induktion in der Transkonjugantenzelle43,54,90 unterdrücken, was wahrscheinlich eher für die Physiologie und Proliferation des Transkonjuganten als für den Plasmidtransfer an sich wichtig ist. Eine mögliche Einschränkung der Konjugationsstudie besteht darin, dass Transfereffizienztests im Allgemeinen zwischen identischen oder eng verwandten Bakterienstämmen unter optimalen Medium- und Temperaturbedingungen durchgeführt werden. Dies untergräbt wahrscheinlich die Rolle von Genen, die nicht unbedingt notwendig sind, aber die Konjugation erleichtern oder optimieren oder die Proliferation der transkonjuganten Zelle unterstützen könnten. Daher ist es möglich, dass die Bedeutung der führenden Faktoren am besten unter ungünstigeren Bedingungen, zwischen phylogenetisch entfernten Bakterien oder auf der evolutionären Ebene, zum Vorschein kommt. In der Zwischenzeit könnte Echtzeitmikroskopie dabei helfen, den möglicherweise subtilen Einfluss dieser Gene auf die Konjugationssequenz in lebenden Zellen aufzudecken.

Bakterienstämme sind in Tabelle S1 aufgeführt, Plasmide in Tabelle S2 und Oligonukleotide in Tabelle S3. Die Fusion von Genen mit fluoreszierenden Tags und die Deletion des Gens auf dem F-Plasmid verwendeten die λRed-Rekombination95,96. Modifizierte F-Plasmide wurden durch Konjugation auf den Hintergrundstamm K12 MG1655 übertragen. Wo mehrere genetische Modifikationen am F-Plasmid erforderlich waren, wurden die kan- und cat-Gene mithilfe einer ortsspezifischen Rekombination entfernt, die durch die Expression der Flp-Rekombinase aus dem Plasmid pCP2095 induziert wurde. Das Klonen von Plasmiden wurde von Gibson Assembly durchgeführt und durch Sanger-Sequenzierung (Eurofins Genomics Biotech) verifiziert. Stämme und Plasmide wurden durch Sanger-Sequenzierung (Eurofins Genomics) verifiziert. Die Zellen wurden vor der Bildgebung bei 37 °C in einem M9-Medium, ergänzt mit Glucose (0,2 %) und Casaminosäure (0,4 %) (M9-CASA), und für Konjugationseffizienztests in Luria-Bertani (LB)-Brühe gezüchtet. Gegebenenfalls wurden Nahrungsergänzungsmittel in den folgenden Konzentrationen verwendet: Ampicillin (Ap) 100 µg/ml, Chloramphenicol (Cm) 20 µg/ml, Kanamycin (Kn) 50 µg/ml, Streptomycin (St) 20 µg/ml und Tetracyclin (Tc) 10 µg/ml.

Übernachtkulturen in LB von Empfänger- und Spenderzellen wurden auf einen A600-Wert von 0,05 verdünnt und gezüchtet, bis ein A600-Wert zwischen 0,7 und 0,9 erreicht war. 25 µl Spender- und 75 µl Empfängerkulturen wurden in ein Eppendorf-Röhrchen gemischt und 90 Minuten bei 37 °C inkubiert. Etwa 1 ml LB wurde vorsichtig hinzugefügt und die Röhrchen wurden erneut 90 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Konjugationsmischung wurde vortexiert, seriell verdünnt und auf LB-Agar X-Gal 40 µg/ml IPTG 20 µM, ergänzt mit dem geeigneten Antibiotikum, ausplattiert, um Empfänger- oder Spenderpopulationen auszuwählen. Die Empfängerkolonien (R) wurden dann auf LB-Agar mit 10 µg/ml Tetracyclin ausgestrichen, um Transkonjuganten (T) zu selektieren, und die Häufigkeit der Transkonjuganten wurde aus (T/R + T) in Abb. 4c berechnet.

Übernachtkulturen in M9-CASA wurden auf einen A600-Wert von 0,05 verdünnt und gezüchtet, bis A600 = 0,8 erreicht war. Konjugationsproben wurden durch Mischen von 25 µl des Spenders und 75 µl des Empfängers in einem Eppendorf-Röhrchen erhalten. Für Zeitrafferexperimente wurden 50 µl der Reinkultur oder Konjugationsmischung in eine B04A-Mikrofluidikkammer (ONIX, CellASIC®) geladen97. Die Nährstoffversorgung wurde während des gesamten Bildgebungsprozesses bei 1 psi und die Temperatur bei 37 °C gehalten. Die Zellen wurden 90 bis 120 Minuten lang alle 1 oder 5 Minuten abgebildet. Für die Schnappschuss-Bildgebung wurden 10-µl-Proben der Klonkultur oder des Konjugationsgemischs auf ein M9-CASA-1-%-Agarose-Pad auf einem Objektträger98 getupft und direkt abgebildet.

Die konventionelle Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung wurde mit einem Eclipse Ti2-E-Mikroskop (Nikon) durchgeführt, das mit einem x100/1,45-Öl-Plan-Apo-Lambda-Phasenobjektiv und einer ORCA-Fusion-Digital-CMOS-Kamera (Hamamatsu) ausgestattet war und NIS-Software zur Bildaufnahme verwendete . Die Aufnahmen wurden mit 50 % Leistung einer Fluo LED Spectra X-Lichtquelle bei Anregungswellenlängen von 488 und 560 nm durchgeführt. Die Belichtungseinstellungen betrugen 100 ms für Ypet, sfGFP und mCherry und 50 ms für den Phasenkontrast.

Die quantitative Bildanalyse wurde mit der Fiji-Software mit dem MicrobeJ-Plugin99 durchgeführt. Für die Snapshot-Analyse wurde die Umrisserkennung der Zellen automatisch mit MicrobeJ durchgeführt und mithilfe der manuellen Bearbeitungsschnittstelle überprüft. Bei Zeitrafferexperimenten erfolgte die Erkennung von Zellen halbautomatisch über die Schnittstelle zur manuellen Bearbeitung, die es ermöglicht, die zu überwachenden Zellen auszuwählen und die Zellumrisse automatisch zu erkennen. Innerhalb der Konjugationspopulationen wurden mithilfe der Option „Typ“ von MicrobeJ die Kategorien „Donor“ (kein mCh-ParB-Signal), „Empfänger“ (diffuses mCh-ParB-Signal) oder „Transkonjugant“ (mCh-ParB-Foci) zugewiesen. Empfängerzellen wurden anhand des Vorhandenseins roter Fluoreszenz oberhalb des bei den Spendern festgestellten Autofluoreszenz-Hintergrundniveaus der Zelle erkannt. Unter diesen Empfängerzellen wurden Transkonjuganten identifiziert, indem MicrobeJ eine automatisierte Erkennung der ParB-Fluoreszenzherde (Maxima-Erkennung) durchführte. Dieser Ansatz wurde unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Ssb-Ypet oder sfGFP-Fusionen in Spender- und Empfängerzellen verwendet. Innerhalb der verschiedenen Zelltypen wurden die Parameter mittlere Intensitätsfluoreszenz (au), Schiefe, Signal/Rausch-Verhältnis (SNR) oder Zelllänge (µm) automatisch extrahiert und mit MicrobeJ grafisch dargestellt. SNR entspricht dem Verhältnis (mittleres intrazelluläres Signal/mittleres Rauschsignal), wobei das mittlere intrazelluläre Signal das Fluoreszenzsignal pro Zellfläche und das Rauschen das außerhalb der Zellen gemessene Signal ist (aufgrund der vom umgebenden Medium emittierten Fluoreszenz). Im Gegensatz zur Gesamtmenge an Fluoreszenz pro Zelle, die von der Zellgröße/dem Zellalter abhängt und den Hintergrund berücksichtigt, eignet sich die quantitative SNR-Schätzung besser für eine unvoreingenommene Quantifizierung der intrazellulären Fluoreszenz über die Zeit. Ssb-Ypet-, SsbF-mCh- und mCh-ParB-Foci wurden mit der MicrobeJ Maxima-Erkennungsfunktion erkannt und die Fokuslokalisierung und Fluoreszenzintensität wurden automatisch extrahiert und aufgezeichnet. Diagramme mit Zeitrafferdaten wurden entweder auf das erste Bild ausgerichtet, in dem die transkonjugierte Zelle einen konjugativen Ssb-Ypet-Fokus (ssDNA-Erfassung) oder einen mCh-ParB-Fokus (ss-zu-dsDNA-Umwandlung) aufweist, wie in der entsprechenden Abbildungslegende angegeben. Da die Konjugation in der Population asynchron erfolgt, ist es wichtig, dass Zeitrafferfilme nicht immer die gesamte Sequenz des DNA-Transfers erfassen, d. Bemerkenswert ist, dass die Verwendung von Zeitraffern von 1 Minute/Bild geeignet war, das Auftreten/Verschwinden von Ssb-Ypet im Verhältnis zur mCh-ParB-Bildung zu analysieren (Abb. 2b – e), jedoch ein Ausbleichen von mCh-ParB hervorrief und somit die Analyse von mCh-ParB behinderte Duplikationsereignisse auf lange Sicht. Anschließend haben wir 5 Minuten/Frame-Zeitraffer verwendet, um die ersten und zweiten Duplikationsereignisse von mCh-ParB im Verhältnis zur mCh-ParB-Fokusbildung zu analysieren (Abb. 2b, f). Auch die Charakterisierung der verschiedenen Übertragungsparameter erfolgte mittels spezifischer Analyse. Beispielsweise wurden Zeitverzögerungen berechnet, indem die Anzahl der Bilder zwischen den beiden betrachteten Ereignissen gezählt wurde (Auftreten und Verschwinden von Ssb-Ypet in Abb. 2e, 4e; mCh-ParB-Fokusbildung und erste oder zweite Duplikationen in Abb. 2f, 4f). Im Gegensatz dazu zeigen Abb. 2b, 4b wurden durch Kommentieren des Vorhandenseins/Fehlens von Ssb-Ypet- oder mCh-ParB-Foci in jedem Zeitrafferbild generiert.

Die P-Wert-Signifikanz wurde durch die Durchführung spezifischer statistischer Tests mit der GraphPad Prism-Software analysiert. Einzelzelldaten aus der quantitativen Mikroskopieanalyse wurden aus der MicrobeJ-Schnittstelle extrahiert und an GraphPad übertragen. Die P-Wert-Signifikanz quantitativer Einzelzelldaten wurde mithilfe eines ungepaarten, nicht parametrischen zweiseitigen statistischen Mann-Whitney-Tests ermittelt, der den Vergleich von Unterschieden zwischen unabhängigen Datengruppen ohne Normalverteilungsannahme ermöglicht. Die P-Wert-Signifikanz für die Häufigkeit von Transkonjuganten, die durch Plattierungstests erhalten wurden, wurde mithilfe der Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett bewertet, der es ermöglicht, die statistische Signifikanz von Unterschieden zu bestimmen, die zwischen den Mittelwerten von drei oder mehr unabhängigen Versuchsgruppen beobachtet wurden gegen einen Kontrollgruppenmittelwert (entsprechend dem Fwt). Bei Bedarf werden P-Wert und Signifikanz auf den Abbildungstafeln und in der entsprechenden Legende angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten zum Verständnis und zur Bewertung der Schlussfolgerungen dieser Forschung sind im Haupttext und in den Zusatzinformationen verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument in der Quelldatendatei bereitgestellt. Rohe Mikroskopiedaten sind auf Figshare verfügbar (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21206444). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Autoren danken dem National BioResource Project und dem Coli Genetic Stock Center für die Bereitstellung von Stämmen, A. Ducret für die wertvolle Hilfe bei MicrobeJ und N. Fraikin für hilfreiche Diskussionen. Diese Forschung wurde von der Foundation for Medical Research mit der Fördernummer FRM-EQU202103012587 an CL und AC finanziert; die französische Nationale Forschungsagentur, Fördernummer ANR-18-CE35-0008 an CL, YY und KG; und die Universität Lyon würdigen durch die Finanzierung des CVCL auch die Schlumberger-Stiftung für Bildung und Forschung (FSER 2019).

Molekulare Mikrobiologie und Strukturbiochemie (MMSB), Université Lyon 1, CNRS, Inserm, UMR5086, 69007, Lyon, Frankreich

Agathe Couturier, Chloé Virolle, Kelly Goldlust, Annick Berne-Dedieu, Audrey Reuter, Sophie Nolivos, Sarah Bigot und Christian Lesterlin

Universität Paris-Saclay, CEA, CNRS, Institut für Integrative Biologie der Zelle (I2BC), 91198, Gif-sur-Yvette, Frankreich

Yoshiharu Yamaichi

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CL und SB konzipierten, gestalteten und überwachten die Durchführung der Studie; AC, CV, KG, AB-D., AR, SN und SB führten die Experimente durch und analysierten die Daten. CL und SB haben das Papier geschrieben und CL hat die Zahlen vorbereitet. CL und YY stellten die Finanzierung bereit.

Korrespondenz mit Sarah Bigot oder Christian Lesterlin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Couturier, A., Virolle, C., Goldlust, K. et al. Echtzeit-Visualisierung der intrazellulären Dynamik des konjugativen Plasmidtransfers. Nat Commun 14, 294 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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Eingegangen: 05. Oktober 2022

Angenommen: 11. Januar 2023

Veröffentlicht: 18. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-35978-3

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