Struktur des Cyanobakterien-Photosystems I im Komplex mit Ferredoxin bei einer Auflösung von 1,97 Å

Oct 15, 2023

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 951 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Photosystem I (PSI) ist eine lichtbetriebene Elektronenpumpe, die Elektronen von Cytochrom c6 (Cyt c6) auf Ferredoxin (Fd) überträgt. Ein Verständnis dieses Elektronentransferprozesses wird durch den Mangel an strukturellen Details zur PSI:Fd-Schnittstelle und den möglichen Bindungsstellen von Cyt c6 erschwert. Hier beschreiben wir die hochauflösende Kryo-EM-Struktur von Thermosynechococcus elongatus BP-1 PSI im Komplex mit Fd und einem locker gebundenen Cyt c6. Seitenkettenwechselwirkungen an der PSI:Fd-Schnittstelle, einschließlich verbrückender Wassermoleküle, werden detailliert visualisiert. Die Struktur erklärt die Eigenschaften von Mutanten von PsaE und PsaC, die die Kinetik der Fd-Bindung beeinflussen, und legt einen molekularen Schalter für die Dissoziation von Fd bei der Reduktion nahe. Kalorimetriebasierte thermodynamische Analysen bestätigen eine einzelne Bindungsstelle für Fd und zeigen, dass die PSI:Fd-Komplexierung ausschließlich durch Entropie gesteuert wird. Es wird ein möglicher Reaktionszyklus für die effiziente Übertragung von Elektronen von Cyt c6 auf Fd über PSI vorgeschlagen.

Die sauerstoffhaltige Photosynthese besteht aus Hell- und Dunkelreaktionen, wobei die erstere mit der Photonenabsorption beginnt und die vom Wasser ausgehende photosynthetische Elektronentransportkette bis zum endgültigen Elektronenträgerprotein Ferredoxin1 (Fd) vorantreibt. Vier große Membranproteinkomplexe, Photosystem II2, Cytochrom (Cyt) b6f3, Photosystem I4 (PSI) und NADH-ähnlicher Komplex I5 (NDH-1), wirken in der Elektronentransportkette innerhalb der Thylakoidmembran. Plastoquinon, Plastocyanin (Pc), Cyt c6 und Ferredoxin (Fd) fungieren als mobile Elektronenträger, um Elektronen zwischen diesen Membrankomplexen zu transportieren. Diese Elektronenträger bilden mit ihren Redoxpartnern vorübergehende Komplexe. Die Elektronentransferereignisse sollten sequentiell ablaufen, mit einem hohen Maß an Spezifität und auf kinetisch effiziente Weise erfolgen. Kurz gesagt, die Geschwindigkeit des Elektronentransfers ist der Schlüssel zur maximalen Leistung der gesamten elektrochemischen Reaktion. Die intermolekulare Wechselwirkung lipophiler organischer Moleküle, Plastoquinon- oder Chinonanaloga, zwischen Photosystem II und Cyt b6f wurde durch Kinetik6 und Röntgenkristallographie7 gut charakterisiert. Aufgrund der großen Molekülgröße der redoxabhängigen Strukturen sind Protein-Protein-Wechselwirkungen der wasserlöslichen Elektronenträger Pc und Fd mit Cyt b6f, PSI und NDH-1 jedoch schwierig zu untersuchen.

PSI führt eine lichtgesteuerte schnelle Ladungstrennung für den Elektronentransfer durch die Thylakoidmembran durch8. Mit einer Quanteneffizienz von nahezu 100 % ist PSI der effizienteste Energiewandler in der Natur9. Mithilfe der Anregungsenergie, die ihm von den umgebenden Antennenpigmenten im PSI-Reaktionszentrum zugeführt wird, findet eine Ladungstrennung an einem Chlorophyll-a/Chlorophyll-a′-Molekülpaar statt, das als P7004 bezeichnet wird. Das aktivierte Elektron wird dann über die Elektronentransferkette (ETC) übertragen und über die [4Fe-4S]-Cluster FA und FB an den nachgeschalteten wasserlöslichen Elektronenakzeptor Fd auf der Stromaseite weitergeleitet10. Das starke Reduktionsmittel Fd liefert Elektronen für eine Vielzahl von Folgereaktionen wie die Produktion von NADPH, die Assimilation von Stickstoff und Schwefel oder die Entsättigung von Fettsäuren11. Oxidiertes P700 wird anschließend durch ein luminales Elektronendonorprotein, Cyt c6 oder Pc, reduziert, wodurch die nächste Runde des Elektronentransfers eingeleitet wird12. Cyanobakterielles PSI ist in erster Linie ein Homotrimer, obwohl auch monomere13 oder tetramere14 Formen vorhanden sind. Jedes PSI-Protomer besteht aus bis zu 12 Untereinheiten, die mehr als 100 prothetische Gruppen beherbergen, die ein Drittel der Gesamtmasse des Komplexes ausmachen15. Die Röntgenstruktur des trimeren cyanobakteriellen PSI von Thermosynechococcus elongatus (ehemals Synechococcus elongatus) wurde 2001 mit einer Auflösung von 2,5 Å bestimmt (PDB-ID: 1JB04), und 2018 die von Synechocystis sp. PCC 6803 auch mit 2,5 Å Auflösung (PDB-ID: 5OY016). Später wurden mehrere andere PSI-Strukturen, darunter PSI vom Typ grüner Pflanzen, komplexiert mit lichtsammelnden Chlorophyllproteinen I (LHCI), mit höherer Auflösung durch Röntgenkristallographie und auch durch kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) entdeckt; nämlich PSI-LHCI aus einer Erbse mit 2,4 Å (PDB-ID: 7DKZ17), PSI-LHCI-LHCII (PDB-ID: 7D0J18) aus Grünalgen und zwei PSI-LHCI-Komplexe aus einer Kieselalge mit einer Auflösung von 2,38 und 2,4 Å (PDB-IDs). : 6LY519, 6L4U20). Nach der Auflösungsrevolution21 in der Kryo-EM wurden zwei weitere Kryo-EM-Strukturen von Cyanobakterien-PSI mit etwas höherer Auflösung veröffentlicht; nämlich trimeres PSI von Halomicronema hongdechloris C2206 bei 2,35 Å (PDB-ID: 6KMW22) und tetrameres PSI von einer heterozystenbildenden Anabaena sp. PCC7120 bei 2,37 Å (PDB-ID: 6K6114).

Um den PSI-bezogenen Transmembran-Elektronentransfermechanismus besser zu verstehen, wurden verschiedene Methoden wie Co-Kristallisation oder chemische Vernetzung auf PSI mit seinen Elektronentransferpartnern angewendet. Fd:PSI wurde 2002 kristallisiert, obwohl es sich um einen nichtkovalenten Elektronentransferkomplex handelte23. Im Jahr 2018 berichtete unsere Gruppe über die erste Röntgenstruktur eines Fd:PSI-Komplexes mit einer Auflösung von 4,2 Å24. Die Struktur bestätigte Fd-Bindungsstellen auf der Stromaseite von PSI, die zuvor durch ortsspezifische Mutagenese25 und kinetische Analyse26 nahegelegt wurden. In dieser Fd:PSI-Röntgenstruktur wurde Gallium-substituiertes Ferredoxin (Ga-Fd), dessen Proteinstruktur mit der von nativem Fd27 identisch ist, verwendet, um den Redoxzustand von gebundenem Fd auch bei Lichteinstrahlung in der oxidierten Form zu fixieren . Kürzlich wurde über mehrere nichtkovalente Elektronentransferkomplexstrukturen von PSI berichtet, die durch Kryo-EM bestimmt wurden, wie z. B. PSI:Fd (PDB-ID: 7S3D28), PSI-IsiA-Komplex mit gebundenem Flavodoxin (PDB-ID: 6KIF29) und das Triple Komplex von Pc:PSI-LHCI:Fd (PDB-ID: 6YEZ30). Allerdings verhinderte die geringe lokale Auflösung der gebundenen mobilen Trägerproteine ​​eine detaillierte Analyse auf Restebene, mit Ausnahme des Pc:PSI-LHCI-Superkomplexes bei 2,74 Å (PDB-ID: 6ZOO31) für den Bindungsmodus des luminalen Elektronendonors Pc. Trotz umfangreicher Bemühungen32, den Elektronentransferkomplex von PSI:Cyt c6 sichtbar zu machen, wurde bisher weder über eine Röntgen- noch Kryo-EM-Struktur des PSI:Cyt c6-Komplexes berichtet.

Um die Protein-Protein-Wechselwirkungen im Elektronenübertragungssystem besser zu verstehen, sind höher aufgelöste Strukturen von PSI zusammen mit seinen Elektronendonoren und -akzeptoren in einem kontrollierten Redoxzustand erforderlich. Hier beschreiben wir zusammen mit thermodynamischen Messungen zur Fd-Bindung an PSI die Struktur von cyanobakteriellem PSI aus Thermosynechococcus elongatus BP-1, gebunden an seine Elektronentransferpartner Fd und Cyt c6, analysiert durch Einzelpartikel-Kryo-EM mit einer Gesamtauflösung von 1,97 A.

Die gereinigte PSI-Trimerprobe wurde durch Detergensaustausch gegen GDN33 und Entfernung überschüssigen freien Detergens durch GraDeR34 für Einzelpartikel-Kryo-EM optimiert, was ein äußerst homogenes Präparat bei hoher Konzentration ergab (ergänzende Abbildung 1a, b). Im ersten Schritt wurden Parameter für die Kryo-Gitter-Vorbereitung für die hochauflösende Bildgebung allein des PSI-Trimers optimiert. Eine optimale Eisdicke und Partikelverteilung wurden bei einer PSI-Trimer-Proteinkonzentration von 30 mg/ml beobachtet, wohingegen sich die Qualität des Kryogitters bei Werten unterhalb oder oberhalb dieser Konzentration verschlechterte. In einem zweiten Schritt wurde Ga-Fd bei dem zuvor für das Kristallwachstum optimierten leicht basischen pH-Wert von 8,0 und einem Molverhältnis von 1,0:1,1 (PSI:Fd)27 zugegeben, während eine unzureichende Ausbeute für die Reinigung von Cyt c6 dessen Molverhältnis einschränkte auf 1,0:0,4 (PSI:Cyt c6), was zu einem Molverhältnis von 1,0:1,1:0,4 (PSI:Fd:Cyt c6) für die Dreifachmischung führt, die für die endgültige Vorbereitung des Kryogitters verwendet wird. Das gesamte Kryo-Gitter-Screening wurde mit einem 200-kV-Kryo-TEM (Talos Arctica, TFS) durchgeführt. Kryo-Gitter, die große Bereiche mit geeigneter Glaseisdicke und hoher Partikeldichte aufwiesen (ergänzende Abbildung 2b), wurden dann auf ein 300-kV-Kryo-TEM übertragen, das mit einem Kalt-FEG, einem Ω-Energiefilter in der Säule und einem K3-Direktelektronendetektor ausgestattet war (CRYO ARM 300, JEOL; Gatan). Die Bildverarbeitung in Relion 3.135 (ergänzende Abbildung 2) ergab eine endgültige 3D-Dichtekarte, die aus 207.142 Partikeln mit einer Gesamtauflösung von 1,97 Å berechnet wurde und von ausreichender Qualität war, um Seitenkettendichten und Wassermoleküle an der PSI:Fd-Bindungsschnittstelle sichtbar zu machen . Ergänzende Tabelle 1 beschreibt Kryo-EM-Datenerfassungs-, Verfeinerungs- und Validierungsstatistiken. Beide nachbearbeiteten Karten mit C3- und C1-Symmetrie wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB36, Zugangsnummer: EMD-31605) hinterlegt. Rohbilder wurden in das Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR37, Zugangsnummer: EMPIAR-10928) hochgeladen.

Entlang der Membranebene betrachtet ähnelt das Fd-gebundene PSI-Trimer der Form eines Kleeblatts mit einem Durchmesser von ~200 Å und einer Gesamtmasse von 1110 kDa (Abb. 1). Da keine signifikanten Unterschiede zwischen der nicht symmetrischen (C1) Dichtekarte bei 2,07 Å und der symmetrischen (C3) Karte bei 1,97 Å Auflösung festgestellt wurden, wurde die letztere Karte für die Erstellung von Atommodellen verwendet. Als Referenzmodelle wurden die Kristallstruktur von PSI, gelöst mit einer Auflösung von 2,5 Å (PDB ID 1JB04), und die von Fd, gelöst mit einer Auflösung von 1,5 Å (PDB ID 5AUI27) von T. elongates, verwendet. Unser Modell (PDB-ID: 7FIX) des PSI:Fd-Komplexes wurde anhand der endgültigen Dichtekarte verfeinert, die bei 1,97 Å mit strenger dreifacher Symmetrie (C3) ermittelt wurde (ergänzende Abbildung 3). In unserem Modell waren alle 12 Untereinheiten jedes T. elongatus-PSI-Protomers (PsaA, PsaB, PsaC, PsaD, PsaE, PsaF, PsaI, PsaJ, PsaK, PsaL, PsaM und PsaX) zusätzlich zu drei gleich gebundenen Fds enthalten die stromale Seite des PSI-Trimers zu PsaA, PsaC und PsaE. Eine Nahaufnahme (Abb. 1a) zeigt das Atommodell von PSI-gebundenem Fd, das gut mit der entsprechenden Dichtekarte übereinstimmt. Der [2Ga-2S]-Cluster von Fd und der [4Fe-4S]-Cluster von FB in der PsaC-Untereinheit, gezeichnet im Kugel-Stab-Stil, wurden in einem Abstand von Kante zu Kante von 8,9 Å positioniert.

Das Modell des Fd-gebundenen PSI-Trimerkomplexes in C3-Symmetrie, dargestellt mit jedem der drei Protomere entweder in grauer Oberfläche oder einer durch die Untereinheitsketten gefärbten Oberfläche (PsaA-blau, PsaB-rot, PsaC-lila, PsaD-hellblau, PsaE). -Grün, PsaF-Gelb, PsaI-Dunkelviolett, PsaJ-Dunkelgrün, PsaK-Rosarot, PsaL-Weiß, PsaM-Orange, PsaX-Rosa, Fd-Cyan) oder im Cartoon-Stil gefärbt. Liganden werden im Kugel- und Stäbchenstil separat dargestellt und je nach Element gefärbt. a Nahansicht der Ferredoxin (Fd)-Bindungsschnittstelle und der entsprechenden Dichtekarte für Fd. b Modellierte Lipidacylketten zwischen PSI-Protomeren und ihre entsprechende Dichtekarte.

Ergänzende Abbildung 4a zeigt die örtliche Auflösung der Dichtekarte sowohl in der Draufsicht als auch in der Seitenansicht. Für jedes PSI-Protomer auf der luminalen Seite des PSI-Trimers an der der Membran zugewandten Seite von PsaB und in der Nähe der N-terminalen Region von PsaF wurde eine kugelförmige Dichte bei einem Kartenschwellenwert beobachtet, der dem des PSI umgebenden Detergensgürtels ähnelte. Die Positionen und Merkmale aller drei Dichten sind identisch, sie waren bereits im ursprünglichen De-novo-Modell vorhanden (ergänzende Abbildung 2e) und stammen höchstwahrscheinlich von lose gebundenem Cyt c6. Bei diesen drei Dichten verbesserte sich die lokale Auflösung oder Definition nicht, wenn sie einer maskierten 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung unterzogen wurden. Die Starrkörpermodellierung der Cyanobakterien-Cyt-c6-Struktur mit Phenix38 zeigte, dass die Dichte für Cyt-c6 ausreichend groß war (ergänzende Abbildung 4b, c). Dennoch veranlasste uns die Mehrdeutigkeit seiner Ausrichtung, den ternären Komplex von Fd:PSI:Cyt c6 nicht in unseren endgültigen Atomkoordinaten (7FIX) zu modellieren, die in Abb. 1 dargestellt sind.

Das vollständige Modell enthält insgesamt 39 Polypeptidketten, 285 Chlorophyll a, drei Chlorophyll a′, 72 β-Carotine, sechs Phyllochinone, neun [4Fe-4S]-Eisen-Schwefel-Cluster, drei Ca2+-Ionen, neun Phosphatidylglycerine, drei Digalactosyldiacylglycerine, 348 Wassermoleküle und 51 Lipide, die ohne Kopfgruppe für PSI aufgebaut sind, und drei Polypeptide und drei [2Ga-2S]-Cluster für Fd. Zu den bemerkenswerten Unterschieden zu unseren Referenzmodellen gehörten die Identifizierung des zuvor als Monogalactosyldiacylglycerol modellierten Lipid II als Digalactosyldiacylglycerol, die Verlängerung der Lipid IV-Acylketten und eine Änderung des PsaL-Rests 143 von Leucin zu Serin, der nun mit dem Eintrag in der Primärsequenzdatenbank für PsaL übereinstimmt (UniProtKB - Q8DGB4). Unsere Karte ermöglichte es uns, die terminalen Regionen um 39 Aminosäurereste zu erweitern, nämlich Lys11–Val12, Gly263–Ile265 in PsaA, Gly740 in PsaB, Thr5–Val19, Ala33, Pro44–Phe54, Gln78–Leu83 in PsaK und Glu3 in PsaL . Wir haben keine Dichte für ein an PsaM gebundenes Chlorophyll (CLA 1601 in 1JB0) beobachtet, das nicht in unserem Modell enthalten war. Darüber hinaus wurden zwei Dichten in PsaK und PsaA teilweise als die neu identifizierten β-Carotine BCR102 von PsaK und BCR855 von PsaA modelliert. Da jedoch beide Dichten keine klaren Polyenketten-Methyl-Höcker aufweisen, können wir nicht ausschließen, dass diese Dichten von anderen ähnlichen Molekülspezies wie Lipiden stammen. Darüber hinaus wurde in PsaJ ein neues Chlorophyll identifiziert und als PsaJ CLA1307 in unser Modell aufgenommen. Schließlich konnten in unser Modell insgesamt 17 neue Lipidacylketten für jede Monomer-Monomer-Grenzfläche eingebaut werden (Abb. 1b). Alle Ergänzungen und Änderungen werden in der ergänzenden Abbildung 5 zusammen mit repräsentativen Karten und Modellen dargestellt (ergänzende Abbildung 6).

Alle Komponenten des ETC, einschließlich [2Ga-2S] von Fd, sowie ihre Dichtekarten mit Ausnahme des Häms von Cyt c6, sind in Abb. 2 dargestellt, wobei ihre intermolekularen Abstände entweder als Mitte-zu-Mitte (P700 zu Phyllochinon) oder berechnet werden Kante an Kante (Phyllochinon zu Fd [2Ga-2S]). Zweig A und B des ETC bestehen beide aus zwei eng gestapelten Chlorophyll-a- und einem Phyllochinon-Molekül, die im gleichen Abstand (8,9 Å) zum [4Fe-4S]-Cluster FX angeordnet sind, der sowohl von PsaA als auch von PsaB koordiniert wird. PsaC beherbergt die [4Fe-4S]-Cluster FA und FB, die beiden letzten Komponenten des ETC, von denen FB der letzte Elektronenakzeptor und der Punkt der Elektronenübertragung zu den angedockten löslichen Elektronenakzeptoren Fd oder Flavodoxin (Fld) ist. Die hohe lokale Auflösung unserer PSI:Fd-Dichtekarte ermöglichte es uns, Co-Faktor-Abstände im ETC mit einem guten Maß an Sicherheit zu messen. Die beobachteten Kantenabstände zwischen Phyllochinonen und den drei [4Fe-4S]-Clustern stimmen gut mit denen überein, die zuvor in der 2,5 Å-Röntgenkristallstruktur (PDB-ID: 1JB0) bestimmt wurden. Der Abstand von 8,9 Å zwischen FB und [2Ga-2S] von Fd ist kurz genug für effizientes Elektronentunneln und entspricht den Abständen, die im PSI-IsiA-Fld-Superkomplex29 gefunden wurden. Darüber hinaus entspricht dieser Abstand auch dem Mittelwert der drei unterschiedlichen Abstände, die in unserer vorherigen PSI:Fd-Röntgenkristallstruktur beobachtet wurden.

Die Abstände zwischen Cofaktoren wurden „Mitte zu Mitte“ von Magnesiumatomen benachbarter Chlorophylle zum Zentrum der Phyllochinon-Carbonylringe für den A-Zweig und den B-Zweig (gestrichelte Linien) oder „Kante zu Kante“ zwischen Phyllochinonen gemessen und Eisen-Schwefel-Cluster (durchgezogene Linien).

In unserer Struktur sind drei Fd-Moleküle fest an die Stromaseite des PSI-Trimers gebunden. Selbst in der Karte, die mit einem Dichteniveau nahe dem Rauschen konturiert wurde, kann keine weitere Dichte erkannt werden, die auf zusätzliche Fd-Moleküle hinweist, die an anderen Stromastellen des PSI gebunden sind. Jedes Fd-Molekül bindet auf identische Weise an ein PSI-Protomer und stellt engen Kontakt zu den Untereinheiten PsaA, PsaC und PsaE her, wohingegen keine direkte Wechselwirkung mit PsaD oder PsaF gefunden werden konnte. Die lokale Auflösung von ~2,5 Å und genau definierte Kartenmerkmale an der PSI:Fd-Grenzfläche ermöglichten es uns, Aminosäureseitenketten und mehrere Wassermoleküle zuverlässig zu modellieren. Aminosäurereste und Wassermoleküle, die an der direkten Wechselwirkung an der PSI:Fd-Schnittstelle beteiligt sind, wurden mit dem DIMPLOT-Programm der LigPlot+39, 40-Suite definiert. Basierend auf der DIMPLOT-Analyse wurden insgesamt 18 Reste innerhalb der PSI-Untereinheiten (Arg36, Arg40, Thr60 von PsaA; Ile11, Gly12, Gln15, Arg18, Lys34, Ala35, Ala56, Pro58 von PsaC; Arg3, Ile37, Arg39, Ser53, Asn56) gefunden , Thr57, Asn59 von PsaE) und 20 Reste innerhalb von Fd (Ser60, Asp61, Asp67, Ile70 von PsaA; Phe38, Ser39, Cys40, Ala44, Cys45, Thr47, Phe64, Tyr97 von PsaC; Glu23, Tyr24, Asp27, Glu31, Cys40 , Arg41, Ala42, Ser63 von PsaE) wurden als an Bindungswechselwirkungen beteiligt identifiziert (Abb. 3 und ergänzende Abb. 7). Es wurde neu identifiziert, dass vier Reste (Glu23, Asp27, Phe38, Thr47) in Fd an der Bindungswechselwirkung beteiligt sind, wohingegen vier Reste von Fd, denen zuvor eine Wechselwirkung mit PSI zugeordnet wurde (Gln62, Asp66, Glu71, Tyr81),24 nicht gefunden wurden Tun Sie dies in dieser Studie. In der Nähe der Bindungsoberfläche wurden insgesamt sechs verbrückende Wassermoleküle (HOH202 zu Fd:PsaA, HOH203, HOH204, HOH205 zu Fd:PsaC, HOH101, HOH201 zu Fd:PsaE) identifiziert, die potenzielle Wasserstoffbrückenbindungen zwischen PSI und Fd bieten. Ein Vergleich der Ergebnisse der Röntgenkristallographie, der NMR-übertragenen Kreuzsättigung und dieser Studie zur Frage, welche Fd-Reste bei der Bindung mit PSI interagieren, ist in Abb. 4 dargestellt.

Jede an der Bindung beteiligte Schnittstelle wird separat im Open-Book-Stil dargestellt. Direkt interagierende Aminosäurereste und Wassermoleküle werden markiert. a, b Für Fd:PsaA, c, d für Fd:PsaC, e, f für Fd:PsaE. Neu identifizierte, an der Wechselwirkung beteiligte Reste sind rot markiert. Alle Proteinoberflächen sind entsprechend dem elektrostatischen Potential gefärbt (positiv in Blau, negativ in Rot).

Die interaktiven Reste wurden durch co-kristallisierte PSI:Fd-Röntgenbeugung (PDB-ID: 5ZF024), b-Kryo-EM (diese Studie) und c-NMR-übertragene Kreuzsättigung bestimmt. Durch jede Methode bestimmte eindeutige Rückstände werden durch die entsprechenden Beschriftungen hervorgehoben (Rückstände auf der dorsalen Seite wurden weggelassen).

Zwei wichtige PSI:Fd-Bindungsschnittstellen sind in Abb. 5 dargestellt. Ein Paar von Kation-π-Wechselwirkungen zwischen Phe38 von Fd mit Lys34 von PsaC und Arg41 von Fd wurde identifiziert (Abb. 5a). Arg39 von PsaE, das über hydrophobe Wechselwirkungen mit Arg41 von Fd interagiert, geht zusätzliche Wechselwirkungen mit Asp27 und Tyr24 von Fd ein. Der Rest Gln15 von PsaC bildet die meisten intermolekularen Wechselwirkungen zwischen PSI und Fd und befindet sich möglicherweise strategisch in der Nähe von elektronenspendenden und -aufnehmenden Clustern (Abb. 5b). Gln15 von PsaC ist an hydrophoben Wechselwirkungen mit Cys45 und Phe64 von Fd beteiligt und geht außerdem eine Wasserstoffbrücke zu Ala44 ein. Darüber hinaus ist Gln15 von PsaC über eine Wasserstoffbrücke zu HOH205 mit dem C-terminalen Tyr97 von Fd verbunden. Tyr97 führt wiederum eine Kation-π-Wechselwirkung mit Arg18 von PsaC durch. Tyr97 von Fd weist eine genau definierte Dichte auf, was angesichts der bekannten Flexibilität des C-Terminus überraschend ist (ergänzende Abbildung 8), was auf starke Wechselwirkungen zwischen Fd Tyr97 und PsaC hinweist.

ein Nexus von Wechselwirkungen, die zur Bindungsaffinität von PSI mit Fd beitragen. Die entscheidenden PSI-Reste Lys34 von PsaC und Arg39 von PsaE und ihre jeweiligen Fd-Bindungspartner sind hervorgehoben. PsaC im violetten Band, PsaE im grünen Band, Fd im cyanfarbenen Band und ihre interagierenden Restseitenkettenatome in Kugel und Stab mit ihrer entsprechenden Dichte in der Silhouette. b Zentrum der Wechselwirkungen um Gln15 von PsaC und mit Cys45, Phe64 und Tyr97 von Fd. Diese Reste unterliegen bei der Fd-Reduktion einer Konformationsänderung. PsaC im violetten Band, Fd im cyanfarbenen Band und interagierende Seitenkettenatome in Kugel und Stab mit ihrer entsprechenden Dichte in der Silhouette. Grenzflächenwasser 205 wird als rote Kugel dargestellt. Der Eisen-Schwefel-Cluster FB von PSI und der Gallium-Schwefel-Cluster von Fd sind im Kugel- und Stabformat dargestellt.

Um dynamische Strukturänderungen bei der Komplexbildung zwischen PSI und Fd zu visualisieren, verwendeten wir Python-Skript-„Modevektoren“, die auf dem PyMOL Molecular Graphics System (Version 2.3.2, Schrödinger, LLC) ausgeführt werden. In Abb. 6 wurden Atommodelle von PSI vor (PDB-ID: 1JB0) und nach der Fd-Bindung (aktuelle Studie, PDB-ID: 7FIX) basierend auf den α-Kohlenstoffpositionen des stabilen PsaA/PsaB-Heterodimers überlagert. Verschiebungen von α-Kohlenstoffen >0,7 Å vor und nach der Komplexbildung werden für ein Protomer durch Pfeilspitzen hervorgehoben. Da einzelne Seitenketten an der Kristallpackung für Röntgenstrukturen von PSI oder Fd beteiligt sein können, haben wir für Vergleiche absichtlich die α-Kohlenstoffpositionen der Hauptkettenstrukturen verwendet und die Cα-Stab-Modelle ohne Seitenketten wurden in Abb. 6 dargestellt Die Analyse zeigt, dass Störungen, die durch die Fd-Bindung und das Vorhandensein von Cyt c6 verursacht werden, nicht auf die Stromaseite beschränkt sind, sondern sich auch auf die Lumenseite ausbreiten. Beim Vergleich des Atommodells von Fd in unserer komplexen Struktur (PDB-ID: 7FIX) mit dem Atommodell von freiem Fd (PDB-ID: 5AUI27) durch die Anzeige von Verschiebungen von >0,7 Å am α-Kohlenstoff (Abb. 6c) stellten wir fest: dass die proximale Region des Clusters ungestört blieb, während drei distale Regionen (in gestrichelten Kreisen) nach der Bindung an PSI strukturelle Veränderungen erfuhren.

a, b, d Die Fd-Bindung induzierte strukturelle Verschiebungen in einem PSI-Protomer aus drei verschiedenen Blickwinkeln. Das Atommodell von Fd-freiem PSI (PDB-ID: 1JB04) wurde mit unserem Modell von PSI:Fd (PDB-ID: 7FIX) basierend auf den Cα-Rückgratkoordinaten des PsaA/PsaB-Heterodimers überlagert. Rote Pfeile stellen Verschiebungen über 0,7 Å dar. c Strukturelle Verschiebungen von Fds im freien und PSI-gebundenen Zustand. Das Atommodell von ungebundenem Fd (PDB-ID: 5AUI27, orange gefärbt) wurde mit PSI-gebundenem Fd (cyanfarben) überlagert. Rote Pfeile markieren Hauptkettenverschiebungen über 0,7 Å.

Messungen der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) wurden durchgeführt, um thermodynamische Parameter für die Wechselwirkung zwischen Ga-Fd und dem PSI-Trimer zu erhalten. Um eine mögliche Beeinträchtigung der ITC-Messungen durch freie Waschmittelmizellen41 zu vermeiden, wurden die PSI-Trimer-Proben mit dem GraDeR34-Ansatz vorbereitet, wie dies auch für die Einzelpartikel-Kryo-EM durchgeführt wurde. Repräsentative Ergebnisse der ITC-Thermogramme, der Bindungsisotherme der Wechselwirkungen zwischen Ga-Fd und PSI-Trimer und thermodynamischen Parametern sind in Abb. 7 und Tabelle 1 dargestellt. Die ITC-Analysen zeigen, dass der Bindungsstöchiometriewert ~3 (2,9 ± 0,2) beträgt. , was darauf hinweist, dass Fd in einem Verhältnis von 1:1 an jedes PSI-Protomer gebunden ist; was mit unserer Kryo-EM-Dichtekarte übereinstimmt. Der Kd-Wert lag im submikromolaren Bereich (758,0 ± 123,5 nM), was darauf hindeutet, dass die Interproteinaffinität zwischen Ga-Fd und PSI stark ist. Eine Reihe von Titrationen von Ga-Fd zu PSI-Trimer erzeugte positive ITC-Peaks, gefolgt von einer allmählichen Sättigung (Abb. 7a), was auf die endothermen intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Ga-Fd und PSI hinweist. Insgesamt zeigten die Fd-PSI-Wechselwirkungen einen thermodynamisch ungünstigen positiven ΔH-Wert (1,1 ± 0,1 kcal/mol) und einen stärker günstigen positiven TΔS-Wert (9,5 ± 0,1 kcal/mol), was zeigt, dass die Komplexbildung entropiegetrieben ist.

a Repräsentative Ergebnisse von ITC-Thermogrammen, b Die Bindungsisotherme, angepasst unter Verwendung eines Satzes von Stellen.

Unsere Kryo-EM-Struktur des PSI:Fd-Komplexes basiert auf einer Dichtekarte mit einer strengen dreizähligen Rotationssymmetrie bei einer Gesamtauflösung von 1,97 Å. Die verbesserte Auflösung könnte das Ergebnis von vier Faktoren sein: (i) außergewöhnliche Reinheit und Homogenität unseres PSI-Präparats bei hoher Konzentration, (ii) ein streng kontrollierter Redoxzustand des transienten PSI:Fd-Elektronentransferkomplexes und das Vorhandensein von Cyt c6 ( iii) optimierte Membranproteinkomplexpräparation unter Verwendung der GraDeR-Methode und (iv) Verwendung eines fortschrittlichen Kryo-Elektronenmikroskops CRYO ARM 300, ausgestattet mit einer Kaltfeld-Emissionskanone, einem Ω-Energiefilter in der Säule und einer K3-Direktdetektionskamera ( JEOL, GATAN). Ein bemerkenswertes Ergebnis unserer hochauflösenden Kryo-EM-Karte ist die Visualisierung mehrerer stäbchenförmiger Dichten zwischen jedem PSI-Protomer (Abb. 1b und ergänzende Abb. 5), was auf eine stabile und spezifische Packung von Lipidschwänzen hinweist. Obwohl Thylakoidmembranen verschiedene Lipide enthalten, darunter PG, MGDG, DGDG und SQDG42, wurden in der ursprünglichen 2,5-Å-Röntgenstruktur4 nur drei Phospholipide und ein Galactolipid beschrieben, die intern an die Hauptuntereinheiten PsaA und PsaB gebunden sind. Insgesamt wurden in unserer Struktur siebzehn neu identifizierte Fettsäureschwänze gefunden, obwohl mehrdeutige Dichten ausgeschlossen wurden, die nicht klar von Chlorophyll-Phytolketten unterschieden werden konnten oder zu kurz oder nicht senkrecht zur Membranebene waren. Diese neu gefundenen Interprotomer-Lipide wurden aufgrund ihrer fehlenden Kopfgruppendichten nicht bestimmten Typen zugeordnet, was auf ihre Mobilität hinweist. Sichtbare Fettsäureschwänze waren fest an hydrophobe Aminosäurereste und Antennenliganden (Chlorophylle und Carotinoide) gebunden, was auf ihre potenzielle Funktion bei der Stabilisierung der Trimerisierung von PSI schließen lässt. Diese Ergebnisse erklären Diskrepanzen zwischen der Anzahl der assoziierten Lipide, die durch strukturelle und biochemische Analysen ermittelt wurden43. Tatsächlich deuten unsere Ergebnisse auf eine zusätzliche Funktion von Lipiden bei der strukturellen Straffung der Protomer-Grenzfläche hin, um eine stabile Bildung von oligomerem PSI zu ermöglichen und hervorstehende Antennenliganden, insbesondere in der Inter-Protomer-Region, aufzunehmen. Bisher wurden diese Aspekte nur für die Struktur von PSII2, 44 im Detail betrachtet.

Hier beschreiben wir die hochauflösende Kryo-EM-Struktur von Cyanobakterien-PSI in Gegenwart von oxidiertem Fd und reduziertem Cyt c6. Die Probe für die Strukturbestimmung wurde durch Mischen der drei Proteine ​​ohne Vernetzung und nur durch kurze Inkubation im Dunkeln vor der Kryo-Gitter-Herstellung vorbereitet. Darüber hinaus verwendeten wir Gallium-substituiertes Fd (Ga-Fd), das strukturell mit dem oxidierten Wildtyp-Fd identisch ist, aber nicht reduziert werden kann27, 45. Der resultierende einheitliche Redoxzustand auf der Akzeptorseite von PSI eliminiert die Möglichkeit unerwarteter Redoxreaktionen zwischen Fd und PSI, ausgelöst durch Lichtabsorption. Daher war der Redoxzustand des Komplexes der von PSI unmittelbar vor der Elektronenübertragung von PSI auf Fd. In dieser Studie konnten wir jedoch für alle drei PSI-Protomere schwache, identisch positionierte zusätzliche Dichten in der Nähe der N-terminalen Region von PsaF visualisieren, die Cyt c6 zugeordnet ist (ergänzende Abbildung 4b, c), die bereits deutlich in vorhanden waren De-novo-3D-Ausgangsmodell unserer Kryo-EM-Struktur (ergänzende Abbildung 2e). Die sehr geringe lokale Auflösung könnte eine Folge der niedrigen Stöchiometrie von 1,0:0,4 (PSI:Cyt c6) in der Mischung sein, die für die Kryo-Gitter-Herstellung verwendet wird. Der zuvor erfolglose Visualisierungsversuch für die Bindung von Cyt c6 an das PSI-Trimer von T. elongatus bei der viel höheren PSI:Cyt c6-Stöchiometrie von 1:10 unter reduzierenden Pufferbedingungen und in Gegenwart eines Vernetzers32 legt jedoch nahe, dass die Stöchiometrie und der Redoxzustand von Der Probenpuffer allein reicht möglicherweise nicht aus, um den einzigen Rauschpegel der hier erfassten zusätzlichen Luminanzdichte zu erklären.

Überraschenderweise wurde Cyt c6 im PSI nicht in der Nähe des primären Elektronenakzeptors von P700 gefunden (Abstand von Mitte zu Mitte P700 zu Cyt c6 ~55 Å), sondern in einem ausreichenden Abstand, um einen produktiven Elektronentransfer zu verhindern. Obwohl die mangelnde lokale Auflösung die Bestimmung der Orientierung von Cyt c6 verhinderte, glauben wir, dass es sich bei der Stelle selbst um eine physiologisch relevante sekundäre Bindungsstelle für Cyt c6 handelt, die deutlich von der Stelle von Plastocyanin abweicht, die in der kürzlich veröffentlichten PSI:Pc-Struktur (PDB) sichtbar gemacht wurde ID: 6ZOO31). In der Struktur von PSI:Pc wurde festgestellt, dass Pc an die durch PsaA- und PsaB-Untereinheiten erzeugte hydrophobe Oberfläche bindet, und die N-terminale Verlängerung von PsaF, die für die Vakuolenpflanze spezifisch ist, platzierte Pc in der Nähe von P700, nahe genug für einen produktiven Elektronentransfer. Da Cyanobakterien keine N-terminale Verlängerung der PsaF-Untereinheit für die produktive Bindung von Pc/Cyt c646 enthalten, erscheint es unwahrscheinlich, dass Cyanobakterien Cyt c6 an einer ähnlichen Position wie höhere Pflanzen binden. Frühere Versuche, PSI mit gebundenem Cyt c6 durch Vernetzung sichtbar zu machen, waren erfolglos32 und unseres Wissens sind die Kryo-EM-Dichten von Cyt c6 in unserer Studie die erste experimentelle Visualisierung von Cyt c6, das an dieser peripheren, nichtproduktiven Stelle an PSI gebunden ist.

Welche physiologische Funktion könnte diese neu entdeckte Cyt-c6-Bindungsstelle haben? Die Cyt c6-Bindungsstelle unterscheidet sich deutlich von der produktiven Pc/Cyt c6-Bindungsstelle. Ergebnisse der kinetischen Elektronentransferanalyse von Grünalgen und höheren Pflanzen deuteten auf zweiphasige46, 47 Merkmale hin: eine schnelle Elektronentransferphase, die für die Reduktion von P700 relevant ist; und eine langsame Phase, die für die Diffusionszeit von Pc/Cyt c6 im Lumenraum zu den PSI-Reaktionszentren verantwortlich ist. Die strukturelle Grundlage dieser zweiphasigen Kinetik wurde der Lys-reichen N-terminalen Verlängerung von PsaF von Grünalgen zugeschrieben. Kürzlich zeigte eine Kryo-EM-Struktur von PSI aus Chlamydomonas reinhardtii eine zusätzliche Dichte auf der luminalen Seite des Komplexes, was auf eine nichtproduktive Bindung von Pc48 schließen lässt. Diese zusätzliche Region bietet Elektronendonorproteinen elektrostatische Interaktionsstellen, die eine Schlüsselrolle dabei spielen, sie zum P700-Reaktionszentrum zu führen. Das heterogene Vernetzungsergebnis und die kinetischen Merkmale deuteten auf die Existenz sowohl produktiver als auch nichtproduktiver Bindungsstellen hin49. Der an Chlamydomonas reinhardtii durchgeführte Vernetzungstest50 ergab ein ähnliches Ergebnis. Insbesondere führten nur 33 % von Cyt c6 einen schnellen Elektronentransfer zu P700 durch, wohingegen die anderen 67 % eine inaktive Vernetzung auf das Vorhandensein einer potenziellen zusätzlichen Bindungsstelle hindeuteten. Solche unproduktiven Bindungsstellen sind möglicherweise für einen Elektronentransfer zu weit von P700 entfernt, garantieren aber dennoch eine kontinuierliche schnelle Versorgung mit Elektronendonoren. Eine mögliche Funktion der hier dargestellten Cyt c6-Bindungsstelle könnte eine nichtproduktive Bindungsstelle sein, analog zu der, die man in Gefäßpflanzen findet.

Die Existenz der Zweiphasenreaktion in Cyanobakterien wurde bestritten, da das cyanobakterielle PsaF nicht die N-terminale Verlängerung enthält, die im PsaF von Grünalgen und höheren Pflanzen zu finden ist12. Kürzlich wurde jedoch eine In-vivo-Studie zur P700-Reduktionskinetik am PSI von Synechocystis sp. PCC6803 zeigte ähnliche kinetische Eigenschaften wie Grünalgen und höhere Pflanzen51. Die Zweiphasenreaktion könnte die Folge einer unproduktiven Bindung der Elektronendonoren (Pc und Cyt c6) auf der Lumenseite des cyanobakteriellen PSI sein. Das Fehlen von Erweiterungen im cyanobakteriellen PsaF macht die Cyt-c6-Bindung möglicherweise spezifisch, aber flexibel, was eine weitere Erklärung für die begrenzte Auflösung von Cyt-c6 in unserer Dichtekarte liefern könnte. Dieser Vorschlag steht im Einklang mit der geringen lokalen Auflösung von gebundenem Pc an der nichtproduktiven Stelle von Chlamydomonas PSI48. Dies könnte auch erklären, warum in der vorherigen Kryo-EM-Studie von Kölsch et al.32 zu T. elongatus PSI durch die Vernetzung von PSI und Cyt c6 in Kombination mit maskierter 3D-Verfeinerung keine potenziellen Cyt c6-ähnlichen Dichten in der entsprechenden Region lokalisiert werden konnten auf der PSI-Luminalseite trotz der viel höheren eingesetzten Stöchiometrie von Cyt c6 zu PSI (10:1). Daher vermuten wir, dass ein offensichtlicher Unterschied zwischen der Studie von Kölsch et al.32 und unserer Studie der Zusatz von Ga-Fd ist. Dies legt nahe, dass der Bindungsstatus des Elektronenakzeptors (in unserem Fall Fd) auf der Stromaseite von PSI entscheidend für die Bindung des Elektronendonorproteins (in unserem Fall Cyt c6) auf der Lumenseite und infolgedessen sein könnte die Fähigkeit, es zu visualisieren. Somit könnte der Elektronentransferstatus auf der stromalen Seite des PSI den Bindungsmodus von Elektronendonoren auf der luminalen Seite über eine auf Konformationsänderung basierende Transmembransignalisierung beeinflussen. Zukünftige Studien, die sich speziell auf die Optimierung der spezifischen Bindung von Cyt c6 bei hoher Belegung konzentrieren, werden hoffentlich diese Aspekte des cyanobakteriellen PSI-vermittelten Elektronentransfers klären.

Die Bindung von Fd an PSI wurde durch Mutagenese der Stroma-Untereinheiten im Detail untersucht. Diese Studien identifizierten Schlüsselreste, die an den Wechselwirkungen beteiligt sind, die einen schnellen Elektronentransfer zwischen Proteinen ermöglichen (zusammengefasst in der Ergänzungstabelle 2). Unser Atommodell liefert die strukturelle Grundlage für die wichtige Rolle dieser wichtigen Aminosäurereste und kann ihre Mutationseffekte erklären. An der Fd-Bindungsschnittstelle auf PsaE werden die zuvor etablierten Schlüsselinteraktionen von Arg3952, dessen Mutation zu einem Glutamin die Fd-Bindung vollständig stört, nun durch seine elektrostatische Interaktion mit Asp27 und hydrophobe Interaktionen mit Tyr24 und Arg41 von Fd erklärt (Abb. 5a und). Ergänzende Abbildung 7c). An der Grenzfläche zu PsaC ist Lys34 an hydrophoben Wechselwirkungen mit Phe38 von Fd beteiligt, was die Unfähigkeit der PsaC-K34D-Mutante25, 53 erklärt, die entscheidende Kation-π-Wechselwirkung auszubilden, wodurch der schnelle Elektronentransfer vollständig unterbrochen wird (Abb. 5a). Darüber hinaus zeigt Gln15 an der Fd-Bindungsschnittstelle von PsaC in der Nähe des Eisen-Schwefel-Clusters FB umfangreiche direkte Wechselwirkungen mit Ala44, Cy45, Phe64 und auch indirekt mit Tyr97 über das Wassermolekül HOH205 (Abb. 5b), was ebenfalls der Fall war als eines von zwei Schlüsselinteraktionsfeldern für die effiziente Bindung von Fd54 identifiziert (Abb. 5).

Eine wichtige Frage beim PSI-vermittelten Elektronentransfer ist, wie das gebundene Fd nach Aufnahme eines Elektrons eine schnelle Dissoziation von seiner PSI-Bindungsstelle erreicht. Die hochauflösende röntgenkristallographische Struktur von Anabaena Fd im oxidierten und reduzierten Zustand55 legt nahe, dass die wichtigsten Strukturänderungen bei der Reduktion eine Umkehrung der Peptidbindung zwischen Cys45 und Ser46 (T. elongatus-Nummerierung) und eine Verschiebung der Seitenkette mit sich bringen von Phe64 und Seitenkettenbewegung des C-terminalen Tyr97. Der Zusammenhang der Wechselwirkungen zwischen PSI und Fd, der in unserer Struktur rund um Gln15 von PsaC sichtbar gemacht wird, wird durch diese reduktionsinduzierten Konformationsänderungen gestört (Abb. 5b). Das Umdrehen der Peptidebene allein würde die Wechselwirkung zwischen Fd-Cys45 und PsaC-Gln15 unterbrechen und die daraus resultierende Verschiebung von Phe64 könnte auch die Wechselwirkung mit Gln15 stören. Schließlich könnte die Bewegung des C-terminalen Tyr97 wasservermittelte Wasserstoffbrückenbindungen lösen, die mit Gln15 verbunden sind. Der enthalpische Energieaufwand für den Verlust dieses durch Gln15 gebildeten Wechselwirkungszentrums könnte dann ausreichen, um das energetische Gleichgewicht in Richtung Dissoziation zu verschieben. Somit bietet unsere Struktur der PSI:Fd-Grenzfläche in unmittelbarer Nähe von Eisen-Schwefel-Clustern, die am Elektronentransfer zwischen Proteinen beteiligt sind, ein überzeugendes Szenario zur Erklärung des Mechanismus der durch Elektronentransfer induzierten Dissoziation von Fd von PSI.

In dieser Studie verwendeten wir die Kristallstrukturen von Wildtyp-PSI (PDB-ID: 1JB04) und Wildtyp-Fd von T. elongatus BP-1 (PDB-ID: 5AUI27) als Ausgangsreferenz für die Modellierung und Verfeinerung. Obwohl im Vergleich zu unserer vorherigen Analyse24 mittels Röntgenkristallographie bei 4,2 Å Auflösung und NMR (PDB-ID: 5FZ0, BMRB:11596, Abb. 1) einige Unterschiede festgestellt wurden, die auf die signifikante Verbesserung der Auflösung zurückzuführen sind, sind die beobachteten Unterschiede bei den wechselwirkenden Resten zu beobachten zwischen Fd und PSI sind geringfügig und stimmen mit unserer früheren Interpretation überein. Hier konnten wir erstmals Seitenketteninformationen in die Zuordnung der Wechselwirkungen von Fd mit PSI einbeziehen. In unserer vorherigen Röntgenstruktur des PSI:Fd-Komplexes kamen wir zu dem Schluss, dass PsaD nicht mit Fd interagiert, diese Beobachtung stand jedoch im Widerspruch zu den Ergebnissen der ortsspezifischen Mutagenese in Synechocystis PSI56. Unsere aktualisierte hochauflösende Kryo-EM-Struktur bestätigt nun jedoch deutlich das Fehlen einer Wechselwirkung zwischen PsaD und fest gebundenem Fd. Basierend auf unserer Röntgenkristallstruktur des PSI:Fd-Komplexes haben wir zuvor vorgeschlagen, dass cyanobakterielles PsaF als Transmembran-Signalwandler fungieren kann, der durch Fd-Bindung aktiviert wird24. Während die beobachteten strukturellen Veränderungen nur gering sind, ist das Fehlen von Gitterkontakten mit kristallographischen Nachbarn in dieser Studie, die auch strukturelle Veränderungen im PSI bei der Fd-Bindung und in Gegenwart von Cyt c6 sowohl auf der Stroma- als auch auf der Lumenseite sichtbar machte (Abb. 6) , unterstützt unseren früheren auf der Röntgenkristallstruktur basierenden Vorschlag, dass kleine strukturelle Änderungen an der Transmembran die Bindung von Fd an die luminale Seite signalisieren könnten. Auch wenn die physiologische Relevanz der hier festgestellten Strukturveränderungen nicht geklärt werden kann, bleibt die Idee eines Transmembran-Relaissystems zur Koordination des Elektronentransports durch PSI attraktiv.

Überraschenderweise können in der Struktur sechs Wassermoleküle visualisiert werden, die Wasserstoffbrücken zwischen Fd und PSI vermitteln (Abb. 3 und ergänzende Abb. 7). Vor der Komplexbildung müssen sowohl Fd als auch die Stroma-Untereinheiten von PSI vollständig durch Lösungsmittel hydratisiert werden. Nach der Bildung des spezifischen Elektronentransferkomplexes zwischen Fd und PSI müssen Wassermoleküle aus den Hydrathüllen mit Ausnahme der verbleibenden sechs Wassermoleküle von der Grenzfläche ausgeschlossen werden. Um thermodynamische Einblicke in die komplexe Bildung von Fd mit PSI einschließlich hydratisierender Wassermoleküle zu erhalten, wurden ITC-Messungen durchgeführt. Basierend auf der Analyse der thermodynamischen Parameter ähnelt die Bildung des Fd:PSI-Komplexes der des Fd:FNR57- und des Fd:GmHO58-Typs (ΔH > 0 und ΔS > 0), jedoch nicht der des Fd:SiR-Typs59 (ΔH < 0 und ΔS > 0). Die Bindung von Fd an sein Partnerprotein (in diesem Fall PSI) scheint vollständig durch Entropie gesteuert zu werden. Attraktive elektrostatische Wechselwirkungen, polare Wechselwirkungen und kraftgetriebene Wechselwirkungen von Van der Waals könnten zu einem negativen ΔH (ΔH < 0) beitragen, aber die Ablösung von Wassermolekülen, die an Grenzflächen zur Komplexierung von Fd und PSI gebunden sind, erfordert thermodynamisch einen positiven Wert für das Netto-ΔH (ΔH > 0), wie auch bei der Fd:FNR-Komplexbildung beobachtet57, 60. Nichtsdestotrotz kann eine Konformationsstörung, die mit der Verdrängung von Wassermolekülen von der Grenzfläche einhergeht, die Komplexbildung aufgrund der damit verbundenen Entropiezunahme energetisch begünstigen. Die ITC-Analyse zeigt eine starke Interprotein-Affinität zwischen Ga-Fd und PSI mit einem Kd-Wert von ~0,8 μM, was der durch Flash-Absorptionsspektroskopie gemessenen Affinität von nativem Fd zu PSI sehr gut entspricht24. Schließlich betrug die auf der Grundlage der ITC-Messergebnisse berechnete Bindungsstöchiometrie (n-Wert) ungefähr drei, was bedeutet, dass ein Ga-Fd an ein PSI-Protomer in Lösung bindet, was mit den Ergebnissen unserer Kryo-EM-Struktur übereinstimmt.

Basierend auf kinetischen Analysen und unserer aktualisierten Strukturstudie schlagen wir einen Mechanismus der Bildung von Elektronentransferkomplexen vor, der die folgenden fünf Schritte umfasst (siehe auch die Karikatur in Abb. 8). (i) Fd und Cyt c6 befinden sich vor dem Elektronentransfer zunächst in einem freien, ungebundenen Zustand (Abb. 8a). (ii) Sobald innerhalb des PSI ein lichtgetriebenes Ladungstrennungsereignis auftritt, nähert sich oxidiertes Fd dem PSI, um sich an der Stromaseite zu binden und das angeregte Elektron aufzunehmen. Durch die Bindung von Fd ausgelöste feine Strukturveränderungen innerhalb des PSI werden auf die luminale Seite übertragen, um Cyt c6 an der nichtproduktiven Bindungsstelle zu rekrutieren (Abb. 8b). Eine Erhöhung der Affinität nichtproduktiver Bindungsstellen für Cyt c6 kann das PSI-Reaktionszentrum vor einer Überreduktion schützen, wenn FA und FB in einem reduzierten Zustand sind. (iii) PSI reduziert Fd (Beachten Sie, dass Ga-Fd in unserer Struktur nicht reduziert werden kann und daher Fd an PSI gebunden bleibt und Cyt c6 an der nichtproduktiven Stelle gebunden bleibt (Abb. 8c)). (iv) Sobald Fd durch ein angeregtes Elektron reduziert wird und sich dann vom PSI löst, wandert Cyt c6 zur proximalen produktiven Bindungsstelle von P700 für den anschließenden Elektronentransfer (Abb. 8d). (v) Schließlich löst sich das oxidierte Cyt c6 vom PSI und eine weitere Runde von Elektronentransferreaktionen beginnt.

a Reduziertes Cyt c6 und oxidiertes Fd liegen in einem freien, ungebundenen Zustand vor. b Durch lichtinduzierte Ladungstrennung über die Membran bindet sich oxidiertes Fd auf der Stromaseite und öffnet unproduktive Andockstellen für Cyt c6 auf der Lumenseite. Das rosa herzförmige Symbol stellt eine aktivierte Bindungsstelle dar und das „geschlossene“ Verkehrszeichen stellt ein geschlossenes Reaktionszentrum dar. c Cyt c6 ist an luminale, nicht produktive Andockstellen gebunden, während permanent oxidiertes Ga-Fd an der Stromaseite gebunden bleibt, wobei der gestrichelte Linienrahmen die in dieser Studie ermittelte Struktur anzeigt. d Das angeregte Elektron hat PSI mit seinem löslichen Träger Fd verlassen und das reduzierte Cyt c6 hat sich zur produktiven proximalen Bindungsstelle P700* für den Elektronentransfer und die anschließende Ablösung vom PSI bewegt.

Zusammenfassend schlagen wir vor, dass PSI an zwei Arten von Pc- oder Cyt-c6-Bindungsmechanismen an das Reaktionszentrum beteiligt ist. Ein Mechanismus beinhaltet die „Vorbindung“ von Pc an die N-terminale Verlängerung von PsaF, wie bei Chlamydomonas reinhardtii beobachtet. Der alternative Mechanismus beinhaltet eine durch Fd-Bindung induzierte „nichtproduktive“ Bindung, um einen effizienten Elektronentransfer in Cyanobakterien zu ermöglichen. Diese Rekrutierungsmechanismen haben sich möglicherweise weiterentwickelt und bilden die Grundlage für einen effizienten und robusten Elektronentransfer zu P700 in Grünalgen und Gefäßpflanzen.

Thermophile Cyanobakterien des Mutantenstamms Thermosynechococcus elongatus BP-1, genetisch verändert mit einem N-terminalen His10-Tag an der PsaF-Untereinheit sowie einem Chloramphenicol-resistenten Gen als selektierbarem Marker, wurden zur Reinigung beider PSI-Trimere unter Beleuchtung kultiviert und Cyt c6. Die Kultivierung erfolgte unter kontinuierlicher Beleuchtung mit 30 μM Photonen m−2 s−1 bei 50 °C im BG11-Medium, wie zuvor beschrieben61. Eine Gesamtkultur von 16 L wurde geerntet, als die OD730-nm-Absorption einen Wert von eins erreichte. His-markierte PSI-Trimere wurden aus Thylakoidmembranen unter Verwendung der von Kubota et al.43 beschriebenen Methode mit geringfügigen Modifikationen, wie unten beschrieben, gereinigt.

Die geernteten Zellen wurden durch Zentrifugation (8000 × g, 2 Min. bei 4 °C, JLA 9.1000-Rotor, Avanti™ HP-26XP) konzentriert, in Puffer A, der 50 mM MES (pH 6,5), 25 % Glycerin, 20 mM CaCl2 enthielt, resuspendiert 20 mM MgCl2, dann zur Lagerung bei –80 °C eingefroren oder sofort zum Zellaufschluss wie zuvor beschrieben verwendet62. Die Zellen wurden in frisch zubereitetem vorgekühltem Puffer B (dieselben Komponenten wie in Puffer A unter Zusatz von 1 mM Benzamidin, 1 mM 6-Aminohexansäure, 1 mM in Ethanol gelöstem PMSF und 1 mM DNase I) und Thylakoidmembranen aufgeschlossen durch Ultrazentrifugation (40.000 × g, 30 min bei 4 °C, P50AT2-Rotor, HITACHI himac CP80WX) vom löslichen Zellinhalt getrennt.

Thylakoidmembranen wurden in Puffer A bei einer Chlorophyllkonzentration von 1 mg/ml resuspendiert und anschließend wurde eine 10 %ige β-DDM-Stammlösung tropfenweise zugegeben, bis die Konzentration von β-DDM 1 % erreichte. Die Mischung wurde dann im Dunkeln bei 4 °C unter leichtem Rühren 45 Minuten lang inkubiert. Nach der Membransolubilisierung wurden unlösliche Inhalte durch Ultrazentrifugation (50.000 × g, 30 min bei 4 °C, P50AT2-Rotor, HITACHI himac CP80WX) entfernt und der Überstand auf eine offene Säule mit Ni-NTA-Sepharose (Qiagen, Hilden, Deutschland) aufgetragen. . PSI-Trimere wurden mit Puffer C, der 20 mM MES (pH 6,5), 20 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 0,05 % β-DDM und 100 mM Imidazol enthielt, aus der Säule eluiert. Eluierte PSI-Trimere wurden durch Ultrafiltration bei 3000 × g, 4 ° C (Amicon15-Ultrafiltrationsröhrchen, 100 kDa MWCO; Amicon, Miami, FL, USA) auf eine endgültige Chlorophyllkonzentration von etwa 10 mg/ml konzentriert.

Der GraDeR34-Ansatz wurde zum Austausch des Detergens β-DDM gegen Glyco-Diosgenin (GDN) und zur Entfernung überschüssigen freien Detergens angewendet. Um dies zu erreichen, wurde ein Saccharose-Stufengradient mit Saccharosekonzentrationen von 1,7 M, 1,3 M, 0,9 M, 0,5 M und 0,1 M von unten nach oben und einem GDN von 0,1 %, 0,05 %, 0,03 %, 0,01 % usw. hergestellt 0,005 % von unten nach oben. Nach Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation (25.000 × g, 20 h bei 4 °C, P28S-Rotor, HITACHI Himac CP80WX, Ergebnis siehe ergänzende Abbildung 1a) wurden PSI-Trimere aus der entsprechenden Bande gesammelt und eine Entsalzungssäule (PD-10, GE Healthcare, Chicago, IL, USA) wurde zur Entfernung von Saccharose und zum Pufferaustausch verwendet. Die endgültigen PSI-Trimere wurden auf eine Chlorophyllkonzentration von 10 mg/ml in Puffer D (10 mM Tricin, pH 8,0, 10 mM MgCl2 und 0,005 % GDN) konzentriert und wie beschrieben mithilfe der Negativfärbungselektronenmikroskopie auf Reinheit, Stabilität und Monodispersität untersucht unten. Die endgültige PSI-Trimerprobe wurde in 10-μL-Aliquoten in flüssigem Stickstoff unter Verwendung photophober EP-Röhrchen schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Proteinkonzentration des PSI-Trimers wurde anhand des Chlorophyllgehaltsverhältnisses von CPro/CChl = 3,92 bestimmt.

Die Qualität der PSI-Proteinproben wurde durch Negativfärbung beurteilt. Ein Aliquot von 3,5 μl der Endprobe wurde 1/100 verdünnt und auf mit Glimmentladung (5 mA, 10 s, Eiko) kontinuierlich mit Kohlenstofffilm beschichtete Kupfergitter (Nisshin EM, Tokio, Japan) aufgetragen. Die Färbung erfolgte durch Auftragen von 3,5 μl 2 %iger Uranylacetatlösung. Nach 30-sekündiger Inkubation wurde die Färbelösung mit Filterpapier (Whatman Nr. 1; Whatman, Little Chalfont, UK) abgetupft und bei Raumtemperatur getrocknet. EM-Gitter wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop H-7650 HITACHI bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV untersucht, das mit einer 1× 1K Tietz FastScan-F114 CCD-Kamera ausgestattet war. Eine typische negative mikroskopische Aufnahme trimerer PSI-Partikel ist in der ergänzenden Abbildung 1b dargestellt.

Der durch Aufschluss von T. elongatus BP-1-Zellen und Ultrazentrifugation wie oben beschrieben erhaltene Überstand wurde für die Isolierung von Cyt c6 basierend auf einer früheren Reinigungsmethode63 mit einigen Modifikationen verwendet. Dem Überstand wurde bei 25 °C nach und nach festes Ammoniumsulfat (AS) zugesetzt, bis die Sättigung 45 % erreichte. Nach 45-minütigem Rühren bei 25 °C wurde der Niederschlag durch Zentrifugation entfernt (9500 × g, 30 Minuten bei 25 °C, JLA 9.1000-Rotor, Avanti™ HP-26XP). Der resultierende Überstand wurde auf eine hydrophobe Interaktionschromatographiesäule (HiTrap® Phenyl HP) geladen, die mit Puffer, der 10 mM Tricin (pH 7,5) und 45 % AS enthielt, unter Verwendung eines Fast Protein Liquid Chromatography Systems (FPLC, ÄKTA Explorer) voräquilibriert war. Fraktionen, die Cyt c6 enthielten, wurden eluiert, indem die AS-Konzentration auf etwa 20 % gesenkt wurde. Nach der säulenvermittelten Entsalzung (PD-10, GE Healthcare) wurden die Fraktionen gegen einen Puffer ausgetauscht, der 10 mM Tricin (pH 7,5) und 10 mM NaCl enthielt, und auf eine mit voräquilibrierte Anionenaustauschersäule (HiTrap® Q HP) geladen der gleiche Puffer. Gebundenes Protein wurde durch Erhöhen der NaCl-Konzentration auf etwa 100 mM eluiert und Fraktionen mit rosa Färbung wurden gepoolt. Die gepoolte Probe wurde dann einem abschließenden Gelfiltrationschromatographieschritt (Superose® 75 16/60) unter Verwendung eines Laufpuffers unterzogen, der 30 mM Tricin (pH 8,0) und 10 mM MgCl2 enthielt. Die Probenqualität und der Redoxzustand wurden durch Messung des OD553nm/OD273nm-Absorptionsverhältnisses auf der Grundlage eines zuvor veröffentlichten Protokolls64 beurteilt und die Absorptionseigenschaften wurden durch UV-Vis-Absorptionsspektroskopie charakterisiert. Die tiefrosa Farbe und der charakteristische Absorptionspeak bei 553 nm bestätigten den reduzierten Zustand von gereinigtem Cyt c6 im Vergleich zu früheren spektroskopischen Ergebnissen65 von reduziertem Cyt c6. Die SDS-PAGE-Analyse von gereinigtem Cyt c6 ist in der ergänzenden Abbildung 1c dargestellt.

Ein DNA-Fragment, das für natives T. elongatus BP-1-Ferredoxin (Fd) kodiert, wurde unter Verwendung von NcoI-BamHI-Restriktionsstellen in den pET28a-Vektor (Novagen, Madison, WI, USA) kloniert und unter Verwendung des in Luria kultivierten Escherichia coli-Stammes BL21(DE3) exprimiert -Bertani (LB) mittel. Die Reinigung von Fd und die anschließende Substitution seines nativen [2Fe-2S]-Clusters durch den redoxinerten [2Ga-2S]-Cluster wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt27. Kurz gesagt, die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in einem Puffer, der 50 mM Tris (pH 7,5) und 10 % Glycerin enthielt, resuspendiert. Nach dem Zellaufschluss durch Ultraschallbehandlung wurden die resultierenden Lysate 30 Minuten lang bei 45.000 U/min und 4 °C zentrifugiert (P45AT-Rotor, Hitachi CP80WX) und der resultierende Überstand auf eine Anionenaustausch-Cellulosesäule (DE52, Whatman) geladen. Rot gefärbte Fd-haltige Fraktionen wurden mit einem Puffer mit 50 mM Tris (pH 7,5) und 500 mM NaCl eluiert und über Nacht bei 4 °C gegen 3 l Puffer mit 50 mM Tris (pH 7,5) und 50 mM NaCl dialysiert. Das Dialysat wurde dann auf eine HiTrap Q HP-Säule (GE Healthcare) in Puffer mit 50 mM Tris (pH 7,5) aufgetragen und unter Verwendung eines linearen NaCl-Gradienten (0–1 M NaCl) eluiert. Anschließend wurde zur Ammoniumsulfatfällung ein 100 % gesättigter AS-Puffer (50 mM Tris (pH 7,5)) im Verhältnis 1:1 zu den gepoolten Fraktionen gegeben. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert (8000 × g, TOMY) und verworfen. Die Probe wurde schließlich einer Untersuchung unterzogen zur hydrophoben Interaktionschromatographie unter Verwendung einer Phenyl-Sepharose-Säule (GE Healthcare), äquilibriert in Puffer A (50 mM Tris pH 7,5, 40 % gesättigtes Ammoniumsulfat). Die Elution wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–100 % Puffer B (50 mM Tris pH) durchgeführt 7.5) und rot gefärbte Fraktionen wurden gesammelt.

Zur Galliumsubstitution wurden 45 mg Fd durch Zugabe von Chlorwasserstoff (HCl) in einer Konzentration von 6 M auf eine Endkonzentration von 1 M HCl denaturiert. Die trübe Lösung wurde pelletiert (10 min, 10.000 × g bei RT, Zentrifuge von TOMY) und der weiße Niederschlag sofort mit Milli-Q-Wasser gespült, gefolgt von einer Resuspension in einem Puffer, der 100 mM Tris (pH 8,0) enthielt. Die obigen Schritte wurden zweimal wiederholt, um sicherzustellen, dass alle Eisenatome aus dem Fd entfernt wurden. Der endgültige Proteinniederschlag wurde in einem Puffer, der 100 mM Tris (pH 8,0), 6 M Guanidinhydrochlorid und 10 mM Dithiothreitol enthielt, in einer anaeroben Umgebung resuspendiert.

Das denaturierte Fd wurde bei 4 °C rückgefaltet, indem es in einem Rückfaltungspuffer (2 mM GaCl3, 2 mM Na2S, 2 mM DTT und 20 mM Tris, pH 8,0) verdünnt und über Nacht bei 4 °C unter anaeroben Bedingungen inkubiert wurde. Rückgefaltetes Ga-Fd wurde mittels HiTrap-Q-Säulenchromatographie (GE Healthcare) unter Verwendung eines Elutionsgradienten von 0 bis 1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) gereinigt. Elutionsprofile der Proteine ​​wurden durch Absorption bei 280 nm überwacht. Eluierte Fraktionen, die Ga-Fd enthielten, wurden gesammelt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon Ultra-15-Einheit mit einem Cut-off von 10 kDa konzentriert, die in einem Ausschwingrotor (2000 × g, 4 ° C) zentrifugiert wurde. Die konzentrierte Probe wurde dann auf eine Superdex 75 16/60-Säule (GE Healthcare) geladen, die in 100 mM Tris (pH 8,0) mit einer Flussrate von 0,5 ml/min im gleichen Puffer voräquilibriert war. Ga-Fd enthaltende Fraktionen wurden durch Absorption bei 280 nm nachgewiesen und anschließend einem abschließenden Größenausschlusschromatographieschritt unterzogen. Die Konzentrationen von nativem Fd und Ga-Fd wurden aus ihren molaren Extinktionskoeffizienten von ε422 = 9,68 mM/cm bzw. ε280 = 170,2 mM/cm27 berechnet. Die Reinheit von Ga-Fd wurde durch SDS-PAGE-Analyse bewertet, wie in der ergänzenden Abbildung 1d gezeigt.

Alle ITC-Messungen wurden mit einem MicroCal PEAQ-ITC-Gerät (Malvern Panalytical, UK) bei 25 °C durchgeführt. Die Konzentrationen von Ga-Fd in der Spritze und PSI-Trimer in der Zelle betrugen 600 μM bzw. 11 μM. Alle Proteinlösungen wurden einem Pufferaustausch in 30 mM Tricin-NaOH-Puffer (pH 8,0) mit 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl und 0,005 % GDN unter Verwendung von PD-10-Säulen (GE Healthcare Life Sciences) unterzogen und Luftblasen entfernt durch 5-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g vor der ITC. Die folgenden ITC-Parameter wurden verwendet: Titration, 19 Injektionen; anfängliche Verzögerung, 60 s; Abstandszeit, 180 s; Referenzleistung, 10 μcal/s; und Rührgeschwindigkeit 750 U/min. Das Injektionsvolumen betrug 0,4 μL für die erste Injektion und 2 μL für die restlichen Injektionen. Die Verdünnungswärme wurde durch Titrieren von 600 μM Ga-substituiertem Fd in der Spritze in eine nur mit Puffer gefüllte Probenzelle gemessen. Der Wärmefluss und die Bindungsisotherme wurden durch Abzug der Verdünnungswärme berechnet. Die Daten wurden an das in der MicroCal PEAQ-ITC-Analysesoftware integrierte Bindungsmodell mit einem Satz von Standorten angepasst. Thermodynamische Parameter werden als Mittelwert ± SEM angezeigt, der aus drei unabhängigen ITC-Experimenten abgeleitet wurde.

Insgesamt 10 μL gereinigtes PSI-Trimer mit einer Proteinkonzentration von 37 μM (40 mg/ml), 1 μL gereinigtes Ga-Fd in einer Konzentration von 400 μM (4,4 mg/ml) und 2 μL gereinigtes Cyt c6 in Konzentration von 75 μM (0,75 mg/ml) wurden bei Eistemperatur zu einer Endkonzentration von 30 mg/ml PSI-Trimer gemischt. Nach 2-stündiger Inkubation auf Eis im Dunkeln wurde ein Aliquot von 2,6 μl auf ein glimmentladenes (JEC-3000 FC, 30 s, Kohlenstoffträgerfolie nach oben zeigendes) Quantifoil-Kryo-EM-Gitter (R 1,2/1,3 Cu 300) aufgetragen Netz) und in flüssigem Ethan unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), ausgestattet mit Whatman-Filterpapier Nr. 1, zum Blotten bei 4 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit für 3,5 s bei Blotkraft 0 eintauchen und einfrieren. Eingefroren Die Gitter wurden zur Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Das Screening wurde mit einem Transmissions-Kryoelektronenmikroskop von Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, das bei 200 kV betrieben wurde. Kryogitter mit geeigneter Partikelverteilung und Eisdicke wurden aus der Talos Arctica entnommen und für die hochauflösende Datenerfassung weiter verwendet.

Unter Verwendung der Auto-Grid-Adapterkartusche (JEOL, Tokio, Japan) wurde ein einzelnes vorgesiebtes Kryo-Gitter, das als Auto-Gitter zugeschnitten war (Thermo Fisher Scientific), auf ein CRYO ARM 300 (JEOL) Transmissions-Kryo-Elektronenmikroskop übertragen bei 300 kV und ausgestattet mit einer Kaltfeld-Emissionskanone und einem Ω-Filter in der Säule. Die Bildaufnahme erfolgte mittels Flutstrahl-Parallelbeleuchtung im Hellfeld-Bildgebungsmodus. Filme wurden automatisch von SerialEM unter Verwendung von Bildverschiebung (5 × 5 Löcher pro Bühnenposition) und einer K3-Direkterkennungskamera (Gatan, AMETEK, Pleasanton, CA, USA) im CDS-Modus bei einer nominalen Vergrößerung von ×60.000 auf Kameraebene aufgezeichnet. entsprechend einer Pixelgröße von 0,806 Å mit 48 Bildern in 3 s Belichtungszeit, was zu einer Gesamtdosis von 48 e−/Å2 führt. Insgesamt wurden 3018 Filme in einem Defokusbereich von –0,5 μm bis –1,5 μm in Serie gesammelt. Eine typische mikroskopische Aufnahme und Winkelverteilung von Proteinkomplexen sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 2b bzw. 3b.

Die gesamte Bildverarbeitung wurde mit RELION 3.1 und UCSF CHIMERA66 auf einer lokalen GPU-Workstation durchgeführt, die mit zwei GPUs ausgestattet war (siehe ergänzende Abbildung 2a für den Arbeitsablauf). Insgesamt 3018 Filme wurden in sechs Gruppen eingeteilt und eine dosisgewichtete Bewegungskorrektur wurde durch den in Relion implementierten MotionCor267-Algorithmus durchgeführt. Für jeden bewegungskorrigierten Film wurde die Kontrastübertragungsfunktion (CTF) mit CTFFIND468 geschätzt. Nach der CTF-Schätzung wurden 1959 Filme mit einer geschätzten Auflösung von besser als 5 Å und guten Thon-Ringen (ergänzende Abbildung 2c) zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt. Für die De-novo-Erstellung eines ersten Modells wurden 40.483 Partikel mithilfe der Laplace- oder Gaußschen Methode automatisch aus einer der 500 Filmgruppen ausgewählt. Ausgewählte Partikel wurden einer Runde referenzfreier 2D-Klassifizierung unterzogen und das ursprüngliche Modell wurde anhand von 30.580 Partikeln der besten 2D-Klassen berechnet. Ergänzende Abbildung 2e zeigt eine Isoflächenvisualisierung des ursprünglichen Modells bei vier verschiedenen Schwellenwerten. Die automatische Auswahl von Filmen aller sechs Gruppen wurde durchgeführt, indem das ursprüngliche Modell als 3D-Referenz verwendet wurde. Insgesamt wurden 511.737 Partikel aus allen Filmen ausgewählt und eine 2D-Klassifizierung der für jede Filmgruppe ausgewählten Partikel durchgeführt. Gute 2D-Klassen (ergänzende Abbildung 2d) mit insgesamt 366.174 Partikeln wurden ausgewählt, gepoolt und für die 3D-Klassifizierung verwendet. Partikel der besten 3D-Klasse, die in der ergänzenden Abbildung 2f durch eine rote Beschriftung gekennzeichnet sind und 56,6 % (207.142 Partikel) aller Partikel darstellen, wurden für die 3D-Rekonstruktion mithilfe standardmäßiger automatischer Verfeinerung ausgewählt. Anschließend wurden mehrere Runden der CTF-Verfeinerung und des Bayes'schen Polierens durchgeführt, bis sich die Gesamtkartenauflösung nicht mehr weiter verbesserte. Nach standardmäßigen Nachbearbeitungsverfahren ergab die maskierte endgültige Karte eine geschätzte Auflösung von 2,06 Å ohne angewendete Symmetrie (C1) und 1,97 Å mit angewendeter Symmetrie (C3). Hinsichtlich der Strukturmerkmale konnte kein offensichtlicher Unterschied zwischen den C1- und C3-Karten beobachtet werden. Für die Modellerstellung wurde die C3-symmetrische Karte verwendet, da sie eine bessere Euler-Winkelverteilung und einen geringeren Rauschpegel aufwies. Die lokale Auflösungsverteilung (ergänzende Abbildung 4a) der C3-symmetrischen Karte wurde mit RELION berechnet.

Coot69, Phenix, MolProbity70 und UCSF Chimera66 wurden für den Modellbau und die Verfeinerung des realen Raums verwendet. Die Röntgenkristallstrukturen des Synechococcus elongatus PSI-Trimers wurden mit einer Auflösung von 2,5 Å bestimmt (PDB-ID: 1JB04) und die Röntgenkristallstrukturen des T. elongatus BP-1-Ferredoxins wurden mit einer Auflösung von 1,5 Å bestimmt (PDB-ID: 5AUI27). Wird als Startmodell für die Realraumverfeinerung in Phenix 1.19.2 nach manueller Anpassung in UCSF Chimera 1.13.1 verwendet. Coot 0.9.5 wurde zur manuellen Korrektur und Minimierung von Rotamer-, Geometrie- und Ramachandran-Ausreißern im verfeinerten Realraummodell verwendet. Genaue Dateien zur Beschränkung nichtmetallischer Liganden wurden von Grade Server (http://grade.globalphasing.org) heruntergeladen und während der Verfeinerung verwendet. Um das beobachtete Vorhandensein von Magnesium auf beiden Seiten der Chlorringebene zu berücksichtigen, wurde die Chiralitätsbeschränkung der Magnesiumbindungsebene in den Beschränkungen der Chlorophylle (CLA und CL0) gelöscht, um eine sinnvolle Anpassung an die Dichtekarte zu ermöglichen. Darüber hinaus wurden neue Eisen-Schwefel-Cluster-Beschränkungen71 unter Verwendung einer rhomboiden Geometrie zur Verfeinerung von Eisen-Schwefel-Clustern (SF4) angewendet. Die neu geänderten Beschränkungsdateien wurden zusammen mit dem Modell auf die wwPDB-Ablagerungsstelle hochgeladen. Die Visualisierung von Karten und Modellen in allen Abbildungen wurde mit PyMOL 2.3.2, UCSF Chimera 1.13.1 und ChimeraX72 1.2.5 durchgeführt. Für die in Abb. 2 dargestellte Positionierung von Cyt c6 wurde die Phenix-Routine „Dock in Map“ (https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html) mit der Eingabe der entsprechenden lokalen Dichtekarte und der ausgeführt Röntgenkristallstruktur von T. elongatus BP-1 Cyt c6, bestimmt mit einer Auflösung von 1,7 Å (PDB-ID: 6TR165).

Es wurde keine statistische Methode angewendet, um die Größe oder Form der Proteinprobe vorherzusagen, und die Experimente waren nicht randomisiert. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuordnung. Die Reinigungsexperimente von PSI-Trimeren, Ferredoxin und Cytochrom c6 wurden dreimal wiederholt und zeigten nahezu identische Probenmerkmale. Die ITC-Messungen wurden dreimal wiederholt und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten (Supplementary Data 1 zeigt die Quelldaten der in der Arbeit beschriebenen ITC-Messung). Kryo-EM-Daten wurden von einem einzelnen Kryo-Gitter gesammelt. Einzelne Bilder mit einer geschätzten Auflösung von weniger als 5 Å und verschwommenen Thon-Ringen sowie einer unbefriedigenden Eisdicke wurden manuell aus dem Datensatz ausgeschlossen. Detaillierte Statistiken zur Datenerfassung, -verarbeitung und -verfeinerung sind in der Ergänzungstabelle 1 zusammengefasst.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle 3018 rohen Kryo-EM-Filme wurden im Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR) unter der Zugangsnummer EMPIAR-10928 hinterlegt. Die endgültige Kryo-EM-Dichtekarte wurde in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter der Zugangsnummer EMD-31605 hinterlegt. Die Atomkoordinaten des verfeinerten PSI:Fd-Modells wurden in der Protein Data Bank (PDB) unter der Zugangsnummer 7FIX hinterlegt. Alle relevanten Daten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Wir danken Hisako Kubota-Kawai, Yuko Misumi, Hideaki Tanaka, Mika Hirose, Norbert Krauß, Orkun Çoruh und Takayuki Kato für die technische Unterstützung und den wertvollen wissenschaftlichen Input für dieses Projekt. Diese Arbeit wurde vom JST-CREST unter der Fördernummer JPMJCR20E1 (GK) und einem Grants-in-Aid for Scientific Research unter der Fördernummer 21H02417 (GK) von MEXT-KAKENHI, dem Plattformprojekt zur Unterstützung der Arzneimittelforschung und biowissenschaftlichen Forschung, finanziert AMED unter den Fördernummern JP20am0101117 (KN) und JP16K07266 (CG) und JP22ama121001j0001 an Masaki Yamamoto, CG und GK und die Cyclic Innovation for Clinical Empowerment (CiCLE) Fördernummer JP17pc0101020 von AMED an KN und GK sowie die National Research Foundation of Korea ( NRF)-Zuschüsse, die von der koreanischen Regierung unter der Zuschussnummer 2019R1A2C1004954 finanziert werden, Zuschüsse des National Research Council of Science & Technology (NST), die von der koreanischen Regierung unter der Zuschussnummer CCL22061-100 finanziert werden, und des KBSI-Fonds unter der Zuschussnummer C220000, C230130, C280320 und C270100 an Y.-HL und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Graduiertenkollegs 234 „MiCon“ (MMN). Diese Arbeit wird auch durch das Stipendium des China Scholarship Council (CSC) für JLs Studium an der Universität Osaka (CSC-Nr. 201706220064) unterstützt.

Labor für Proteinkristallographie, Institut für Proteinforschung, Universität Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japan

Jiannan Li, Noriyuki Hamaoka, Akihiro Kawamoto, Christoph Gerle und Genji Kurisu

Abteilung für Biowissenschaften, Graduate School of Science, Universität Osaka, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japan

Jiannan Li & Genji Kurisu

Abteilung für Makromolekulare Wissenschaft, Graduate School of Science, Universität Osaka, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japan

Noriyuki Hamaoka & Genji Kurisu

Graduate School of Frontier Biosciences, Universität Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japan

Fumiaki Makino & Keiichi Namba

JEOL Ltd., Akishima, Tokio, Japan

Fumiaki Makino

Forschungszentrum für Biokonvergenzanalyse, Korea Basic Science Institute, Ochang, Chungbuk, 28119, Südkorea

Yuxi Lin & Young-Ho Lee

Pflanzenbiochemie, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Ruhr-Universität Bochum, 44780, Bochum, Deutschland

Matthias Rögner & Marc M. Nowaczyk

Bioanalytische Wissenschaft, Universität für Wissenschaft und Technologie, Daejeon, 34113, Südkorea

Young-Ho Lee

Graduate School of Analytical Science and Technology, Chungnam National University, Daejeon, 34134, Südkorea

Young-Ho Lee

RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research und SPring-8 Center, Suita, Osaka, Japan

Keiichi-Nummer

JEOL YOKOGUCHI Research Alliance Laboratories, Universität Osaka, Suita, Osaka, Japan

Keiichi-Nummer

RIKEN SPring-8 Center, Kouto, Sayo-gun, Hyogo, 679-5198, Japan

Christoph Gerle

Institut für offene und transdisziplinäre Forschungsinitiativen (OTRI), Universität Osaka, Suita, Osaka, 565-0871, Japan

Genji Kurisu

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GK, MR und MMN haben die Studie initiiert; GK und CG gestalteten Forschung; JL, NH, FM, AK und YL führten Experimente durch; JL, NH, YL, Y.-HL und CG analysierten die Daten; KN betreute die Forschung und JL, CG und GK verfassten das Manuskript mit Beiträgen und Kommentaren aller Autoren.

Korrespondenz mit Christoph Gerle oder Genji Kurisu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Mei Li für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Manuel Breuer. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Li, J., Hamaoka, N., Makino, F. et al. Struktur des Cyanobakterien-Photosystems I im Komplex mit Ferredoxin bei einer Auflösung von 1,97 Å. Commun Biol 5, 951 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

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Eingegangen: 13. Juli 2022

Angenommen: 30. August 2022

Veröffentlicht: 12. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03926-4

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