Antimikrobielle Anfälligkeit von Biofilmen durch eine experimentelle evolutionäre Linse

Oct 13, 2023

npj Biofilms and Microbiomes Band 8, Artikelnummer: 82 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Experimentelle Evolutionsexperimente, bei denen Bakterienpopulationen wiederholt einer antimikrobiellen Behandlung ausgesetzt werden, und die Untersuchung des Genotyps und Phänotyps der daraus resultierenden entwickelten Bakterien können dabei helfen, Licht auf die Mechanismen zu werfen, die hinter einer verringerten Anfälligkeit stehen. In diesem Aufsatz geben wir einen Überblick darüber, warum es wichtig ist, Biofilme in die experimentelle Evolution einzubeziehen, welche Ansätze zur Untersuchung der experimentellen Evolution in Biofilmen verfügbar sind und was uns die experimentelle Evolution über Toleranz und Resistenz in Biofilmen gelehrt hat. Abschließend präsentieren wir eine sich abzeichnende Konsensansicht zur antimikrobiellen Empfindlichkeit von Biofilmen, die durch Daten aus experimentellen Evolutionsstudien gestützt wird.

Experimentelle Evolution (Kasten 1) ist die Untersuchung evolutionärer Prozesse, die in Populationen als Reaktion auf vom Experimentator auferlegte und kontrollierte Bedingungen ablaufen1. Während die ersten mikrobiellen experimentellen Evolutionsstudien auf die 1880er Jahre zurückgehen2, wurde die experimentelle Evolution in den 1950er Jahren von Francis J. Ryan3 in die Bakteriologie eingeführt und erlangte durch das von Richard Lenski gestartete Langzeit-Evolutionsexperiment (LTEE) große Bekanntheit in den 1980er Jahren und läuft seit mehr als 75.000 Generationen4,5. Das LTEE und viele andere experimentelle Evolutionsexperimente werden in unstrukturierten Umgebungen durchgeführt, das heißt in Flüssigkultur unter Schütteln, wobei sich die meisten Bakterien im planktonischen Zustand befinden. Allerdings wurden bereits in frühen Evolutionsexperimenten in strukturierten Umgebungen deutliche Unterschiede in der Entwicklung der Fitness (Kasten 1) und der Variabilität innerhalb der Population im Vergleich zu dem beobachtet, was typischerweise in planktonischen Kulturen beobachtet wird6,7.

Biofilme sind strukturierte mikrobielle Gemeinschaften, die entweder an einer Oberfläche haften oder als suspendierte oder eingebettete Aggregate auftreten8. In Biofilmen sind verschiedene Gradienten (Sauerstoff, Nährstoffe, antimikrobielle Wirkstoffe usw.) vorhanden, was zur Entwicklung räumlich strukturierter Nischen mit unterschiedlichen Umweltbedingungen führt.9 Diese Mikroumgebungen bestimmen den Ausgang biofilmbedingter Infektionen mit, da sie sich direkt auf das Bakterienwachstum auswirken und Stoffwechsel sowie auf die Wirkung einer antimikrobiellen Behandlung10,11,12,13.

Die experimentelle Evolution im Allgemeinen14 und spezifische Aspekte der experimentellen Evolution in Biofilmen15 wurden kürzlich besprochen; Für weitere Einzelheiten verweisen wir die Leser auf diese Rezensionen. Nachfolgend finden Sie eine kurze Zusammenfassung, warum Biofilmpopulationen im Laufe der Evolution vielfältiger werden.

Aufgrund ihrer Heterogenität enthalten Biofilme mehrere ökologische Nischen, die nicht alle von bestehenden Genotypen genutzt werden; Diese ungenutzten Nischen bieten Möglichkeiten für neuartige Genotypen16. Darüber hinaus können neuartige Genotypen zusätzliche Nischen schaffen, indem sie die Umgebung verändern („Nischenkonstruktion“)7,17. Aufgrund der räumlichen Heterogenität können Biofilmpopulationen als Ansammlungen unabhängig voneinander entstehender Subpopulationen betrachtet werden, und diese Populationsfragmentierung verringert die effektive Populationsgröße. Da der relative Beitrag der genetischen Drift (Kasten 1) zur Diversität in kleineren Subpopulationen höher ist, führt räumliche Heterogenität letztendlich zu mehr Diversität16,18. Die Populationsfragmentierung ermöglicht auch die Fixierung (Kasten 1) vorteilhafter Mutationen mit relativ geringem Effekt in bestimmten Subpopulationen. Tatsächlich sind vorteilhafte Mutationen, die eine große Wirkung haben, seltener als vorteilhafte Mutationen, die eine kleine Wirkung haben, und es ist unwahrscheinlich, dass erstere in allen Subpopulationen auftauchen; Infolgedessen ist zu erwarten, dass verschiedene vorteilhafte Mutationen mit geringer Wirkung in unterschiedlichen, räumlich getrennten Subpopulationen auftreten und aufrechterhalten werden, was zu einer größeren Diversität innerhalb der Gesamtpopulation führt19. Jüngste experimentelle Arbeiten und Modellierungen haben gezeigt, dass in einer räumlich strukturierten Umgebung die Ausbreitung einer nützlichen Mutation verstärkt wird und dass es weniger wahrscheinlich ist, dass nützliche Mutationen verloren gehen20. Der Grund dafür ist, dass in strukturierten Umgebungen die Selektion die Häufigkeit einer vorteilhaften Mutation in einer bestimmten Subpopulation schneller erhöhen kann als die Migration dieser Mutation in andere Subpopulationen; Infolgedessen ist es wahrscheinlich, dass der Mutant, der diese vorteilhafte Mutation beherbergt, wiederholt in neue Subpopulationen migrieren kann, was letztendlich die Wahrscheinlichkeit eines Verlusts dieser Mutation aufgrund genetischer Drift verringert20. Die Konkurrenz zwischen Mutanten, die verschiedene vorteilhafte Mutationen beherbergen (klonale Interferenz, Kasten 1), verlängert die Fixierungszeiten (d. h. es dauert länger, bis eine bestimmte Mutation alle anderen übertrifft) und klonale Interferenz kommt in räumlich strukturierten Umgebungen häufiger vor (da vorteilhafte Mutationen langsamer auftreten). , „wellenartige“ Ausbreitung in der Bevölkerung)21. Infolgedessen können in Biofilmen mehrere vorteilhafte Mutationen gleichzeitig auftreten, was wiederum zu einer höheren Diversität führt22,23. Die jüngste Beobachtung, dass die In-vitro-Evolution von Pseudomonas aeruginosa unter Bedingungen, die denen in der Lunge von Mukoviszidose-Patienten (CF-Patienten) am ähnlichsten sind (d. h. in einem synthetischen CF-Medium [SCFM]), zu einer geringeren Parallelität (d. h. mehr Diversität) führt ) als die Evolution in einem Minimalmedium, bestätigt die Bedeutung des Vorhandenseins räumlich getrennter Subpopulationen für die Erzeugung von Diversität24,25. Im Gegensatz zum Minimalmedium enthält SCFM Mucin, was die Schaffung räumlich strukturierter Subpopulationen mit kleineren effektiven Populationsgrößen ermöglicht, wodurch die Wahrscheinlichkeit geringer ist, dass in replizierten Populationen die gleichen vorteilhaften Mutationen gefunden werden25.

Schließlich müssen in homogenen Populationen, die einem antimikrobiellen Wirkstoff ausgesetzt sind, alle für eine vollständige Resistenz erforderlichen Mutationen gleichzeitig erworben werden, um eine Ausrottung durch gleichmäßig hohe Konzentrationen des Antibiotikums zu vermeiden. Das Eindringen antimikrobieller Wirkstoffe in den Biofilm kann jedoch behindert werden, was zu Konzentrationsgradienten9,26,27,28,29 führt, die „Zufluchtsorte“ schaffen können, d. h. Teile des Biofilms, in denen die Konzentration antimikrobieller Wirkstoffe geringer ist und die wirken können als „Sprungbrett“, das es Populationen ermöglicht, eine nach der anderen Mutationen zu erwerben30. Weitere wichtige zu berücksichtigende Aspekte sind die häufig in Biofilmzellen beobachteten erhöhten Mutationsraten sowie die erhöhte Rate des horizontalen Gentransfers (HGT) in bakteriellen Biofilmen (ausführlicher in Kasten 2 erörtert). Es ist zu beachten, dass die meisten experimentellen Evolutionsstudien mit einzelnen Arten durchgeführt werden (siehe unten), HGT in diesen Studien normalerweise kein Faktor ist, der evolutionäre Veränderungen vorantreibt.

Biofilm: strukturierte mikrobielle Gemeinschaften (an einer Oberfläche befestigt, suspendierte Aggregate oder in Gewebe eingebettete Aggregate), bestehend aus Mikroorganismen, eingebettet in eine extrazelluläre Matrix aus Polysacchariden, extrazellulärer DNA und anderen Komponenten8.

Klonale Interferenz: die Konkurrenz, die in einer Population zwischen Mutanten auftritt, die verschiedene vorteilhafte Mutationen beherbergen15.

Experimentelle Evolution: die Untersuchung evolutionärer Prozesse, die in vom Experimentator festgelegten Populationen als Reaktion auf Bedingungen oder Behandlungen ablaufen, die vom Experimentator auferlegt und kontrolliert werden14,15.

Fitness: die Fähigkeit, mehr Nachkommen zu zeugen (und dadurch die Häufigkeit im Laufe der Zeit zu erhöhen) als weniger fitte Konkurrenten, idealerweise gemessen in einem direkten Konkurrenztest, bei dem der relative Beitrag der Konkurrenten zur zukünftigen Generation bewertet wird. Fitness wird oft indirekt durch Messung der Wachstumsrate oder Anfälligkeit beurteilt14,15.

Fixierung: Situation, in der eine bestimmte Variante eines Gens (Mutation) die einzige in der Population verbleibt (d. h. alle anderen werden verdrängt)14,15.

Genetische Drift: die zufällige Änderung der Häufigkeit einer bestimmten Variante eines Gens (Mutation) in einer Population14,15.

Minimale Tötungsdauer (MDK): Mindestzeit, die erforderlich ist, um einen Teil der Bevölkerung zu töten; Beispielsweise sind MDK99 und MDK99,99 die Zeiten, die erforderlich sind, um 99 % bzw. 99,99 % der Zellen in einer Population abzutöten31,32.

Minimale Hemmkonzentration (MHK): niedrigste Konzentration eines Antibiotikums, die das Wachstum planktonischer Zellen verhindert31,32.

Mutantenselektionsfenster (MSW): der Konzentrationsbereich, in dem die Fitness eines resistenten Mutanten höher ist als die des Wildtyps79,91.

Persistenz: Phänomen, bei dem in einer Population mindestens zwei Subpopulationen vorhanden sind, von denen eine aus Zellen besteht, die durch das Antibiotikum schnell abgetötet werden, und die andere aus überlebenden toleranten Zellen besteht48. Es gibt keinen Unterschied in der MHK und der MDK99 zwischen anfälligen und persistierenden Stämmen, aber die MDK99,99 für letztere ist wesentlich höher31,32.

Resistenz: Antibiotikaresistente Zellen verfügen über einen oder mehrere Mechanismen, die es ihnen ermöglichen, bei Antibiotikakonzentrationen zu wachsen, die das Wachstum anfälliger Bakterien verhindern würden. Beispiele hierfür sind eine verringerte Aufnahme und ein erhöhter Efflux von Antibiotika, eine Modifikation des Ziels und eine (enzymatische) Inaktivierung des Antibiotikums31,32,125.

Toleranz: Phänomen auf Bevölkerungsebene, das es einer Bevölkerung ermöglicht, die Exposition gegenüber einem Antibiotikum (in Konzentrationen über der MHK) zu überleben, ohne dass ein Resistenzmechanismus involviert ist. Tolerante Zellen wachsen häufig nicht oder nur langsam und können nach Entfernung des Antibiotikums wieder nachwachsen. Es gibt keinen Unterschied in der MHK zwischen einem toleranten und einem anfälligen Stamm, aber der MDK99 ist bei einem toleranten Stamm wesentlich höher als bei einem anfälligen Stamm31,32,125.

Die Rate von Punktmutationen in Bakterien schwankt zwischen 10-10 und 10-9 pro bp pro Replikation93,133, obwohl die Mutationsraten bei Hypermutatoren (Stämme mit erhöhter Mutationshäufigkeit aufgrund von Mutationen in DNA-Mismatch-Reparaturgenen134) 100- bis 1000-fach höher sein können. 135,136).

Die Mutationsraten wurden zwischen Planktonkulturen und Biofilmen für mehrere Organismen (einschließlich Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis) verglichen und es wurde festgestellt, dass sie in Biofilmen wesentlich (4 bis > 100-fach) höher sind104,116,118,137.

Allerdings führen chemische Gradienten in Biofilmen zu physiologischer Heterogenität9, die sich auch in deutlichen Unterschieden in der Genexpression und den Wachstumsraten widerspiegelt, wobei Biofilme oft einen beträchtlichen Anteil langsam wachsender und sich nicht teilender Zellen enthalten138,139. Dies erschwert den direkten Vergleich der Mutationsraten (typischerweise ausgedrückt pro bp pro Replikation) zwischen heterogenen Biofilmen und gut gemischten Planktonkulturen114.

Erhöhte Mutationsraten könnten mit oxidativem Stress zusammenhängen, da in im Biofilm gezüchteten P. aeruginosa PAO1 die Expression von Genen, die für Enzyme kodieren, die Schutz vor oxidativen DNA-Schäden verleihen, herunterreguliert wurde, z. B. die Expression von katA (kodiert für die Hauptkatalase, die für die Umwandlung verantwortlich ist). Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser) wurde um das 7,7-fache herunterreguliert137. Dementsprechend wurde in anderen Studien festgestellt, dass die Produktion von Wasserstoffperoxid wichtig für erhöhte Mutationsraten bei Streptokokken und Staphylokokken ist116,118.

Die Relevanz von oxidativem Stress wird durch Beobachtungen bestätigt, die doppelsträngige DNA-Brüche, die durch endogenen oxidativen Stress verursacht werden, und die anschließende Reparatur dieser Brüche durch Mechanismen, die Mutationen einführen, mit der Biofilmadaption in Verbindung bringen117,122.

Biofilme bieten auch reichlich Gelegenheit für HGT, und ihre Raten sind in Biofilmen typischerweise höher als in planktonischen Kulturen140,141, obwohl sie durch die räumliche Trennung von Spender und Empfänger142, die Art des Plasmids143, die Sequenz und Länge der spezifischen DNA beeinflusst werden können Fragment144 und die gesamte Biofilmarchitektur (einschließlich des Vorhandenseins von Exopolysacchariden in der Matrix)145.

Die antimikrobielle Resistenz wird anhand der minimalen Hemmkonzentration (MHK, Kasten 1) quantifiziert31. Die Fähigkeit resistenter Organismen, bei Konzentrationen oberhalb der MHK für anfällige Organismen zu wachsen, hängt mit dem Vorhandensein eines oder mehrerer Resistenzmechanismen zusammen32 und die Evolutionsverläufe hin zu einem resistenten Phänotyp können komplex sein33. Experimentelle Evolution, bei der Kulturen seriell passagiert werden (in Gegenwart einer konstanten oder allmählich ansteigenden Konzentration eines Antibiotikums), kann in Kombination mit der Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) zur Identifizierung von Resistenzen und Entwicklungen in Richtung Resistenz eingesetzt werden34. Beispielsweise ermöglichte die serielle Passage von Escherichia coli in Gegenwart von Carbapenemen die Identifizierung mehrerer bisher unbekannter Carbapenem-Resistenzmechanismen, darunter Mutationen in mrdA (kodierend für PBP2) und ftsI (kodierend für PBP3), beides Ziele von Carbapenemen, sowie Mutationen in acrB (Kodierung für den mit der inneren Membran verbundenen Teil der AcrAB-TolC-Effluxpumpe)35. Die experimentelle Entwicklung von E. coli in Gegenwart von Chloramphenicol induzierte Mutationen in der DNA-Bindungsregion von marR, die die AcrAB-TolC-Effluxpumpe hochregulieren können, sowie Mutationen in acrB und acrR (eine Unterbrechung von acrR führt zu einer Hochregulierung von acrAB)36. Bei Streptococcus pneumoniae führte die experimentelle Entwicklung in Gegenwart steigender Konzentrationen von Moxifloxacin und Levofloxacin zur Identifizierung neuer Mutationen in gyrB, die in Kombination mit Mutationen in gyrA und parC zu einer hohen Fluorchinolonresistenz führen37. In einer experimentellen Evolutionsstudie mit P. aeruginosa wurden sowohl erwartete (z. B. Mutationen, die nach der Evolution in Gegenwart von Ceftazidim zu einer Überproduktion von AmpC führen, Mutationen in oprD, die nach der Evolution in Gegenwart von Meropenem zur Inaktivierung des Porins führen) als auch neue (z. B. Funktionsgewinnmutationen, die nach der Evolution in Gegenwart von Ceftazidim zur strukturellen Veränderung von AmpC führen, neue Mutationen in gyrA nach der Evolution in Gegenwart von Ciprofloxacin) Resistenzmechanismen wurden identifiziert38. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass metabolische Anpassungen und eine verringerte antimikrobielle Empfindlichkeit Hand in Hand gehen39,40 und mehrere experimentelle Evolutionsstudien mit planktonischen E. coli-Populationen haben dies kürzlich bestätigt. Wenn E. coli in einem Minimalmedium mit Glukose (unterstützt ein schnelles Wachstum durch Atmung oder Fermentation) oder Acetat (unterstützt ein langsameres Wachstum nur durch Atmung) gezüchtet wird, entwickelt sich eine Resistenz gegen Glukose viel schneller, was bestätigt, dass die Umweltbedingungen die Geschwindigkeit der Resistenzentwicklung begrenzen41. Bei den meisten beobachteten Veränderungen handelt es sich um Stoffwechselprozesse, die durch die Antibiotikabehandlung nicht direkt beeinflusst werden. Beispielsweise verbrauchen Kulturen, die sich in Gegenwart von Glukose und Chloramphenicol entwickelt haben, mehr Glukose, sezernieren mehr Acetat und zeigen eine geringere Sauerstoffaufnahme im Vergleich zu Wildtyp-E. coli und E. coli, die nur in Gegenwart von Glukose adaptiert wurden, was auf eine metabolische Umstellung von Atmung auf hindeutet Fermentation. Dieser Wechsel steht im Zusammenhang mit der Überexpression der AcrAB-Effluxpumpe (erforderlich für die Chloramphenicol-Resistenz) und der Umgestaltung des Membranproteoms aufgrund der Konkurrenz um Platz zwischen der Effluxpumpe und den an der oxidativen Phosphorylierung beteiligten Proteinen41. Weitere Belege für die Rolle metabolischer Veränderungen bei der Entwicklung antimikrobieller Resistenzen stammen aus der experimentellen Evolution planktonischer E. coli unter Verwendung sowohl eines herkömmlichen experimentellen Evolutionsprotokolls als auch eines „metabolischen Evolutionsprotokolls“, das durch die Exposition von Bakterien eine gleichwertige Selektionsdynamik für alle Bedingungen gewährleisten soll gegenüber Antibiotika bei unterschiedlichen Temperaturen (d. h. bei zunehmend erhöhten Stoffwechselzuständen)42. Die Evolution unter herkömmlichen Bedingungen führt zu langsamer wachsenden Populationen mit einer erhöhten MHK; Mutationen, die in diesen Populationen häufig vorkommen, liegen in Genen, die mit bekannten Resistenzmechanismen verbunden sind. Eine Untergruppe von Klonen erwirbt jedoch Mutationen in anderen Genen, einschließlich Genen, die mit dem zentralen Stoffwechsel (TCA-Zyklus, Elektronentransport) zusammenhängen. Populationen, die am Ende des „metabolischen Evolution“-Experiments erhalten wurden, weisen im Vergleich zum angestammten Wildtyp-Stamm eine höhere Überlebensrate in Tötungstests auf, ohne dass die exponentielle Wachstumsrate verringert oder die Verzögerungszeit verlängert wird (wodurch eine Toleranz [Kasten 1] aufgrund langsamen Wachstums ausgeschlossen wird). . Die Veränderung von Mutanten in sechs Stoffwechselgenen bestätigte die Relevanz dieser Mutationen weiter, da bei allen Mutanten die MHK für mindestens ein Antibiotikum erhöht war. Der Mechanismus, durch den diese Mutationen für Resistenz sorgen, variiert, aber für mindestens eine von ihnen (sucA, kodierend für das TCA-Zyklus-Enzym 2-Oxoglutarat-Decarboxylase) sorgt die Mutation für Resistenz, indem sie die Basalatmung senkt und dadurch die Antibiotika-vermittelte Induktion der TCA-Zyklusaktivität verhindert. ein Mechanismus, der zuvor in verschiedenen Organismen beobachtet wurde43,44,45. 39 % der in diesen Evolutionsexperimenten identifizierten Mutationen der kodierenden Sequenz können auch in sequenzierten E. coli-Genomen gefunden werden; Darüber hinaus sind in diesen Genomen zahlreiche Mutationen in Stoffwechselgenen vorhanden, und einige sind in klinischen E. coli-Isolaten statistisch angereichert, was darauf hindeutet, dass sie in vivo relevant sind42.

Eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika ist nicht nur auf Resistenzen zurückzuführen, sondern auch Toleranz und Persistenz (Kasten 1) spielen eine wichtige Rolle31,32,46,47,48. Tolerante Zellen überleben die Exposition gegenüber Antibiotika ohne herkömmliche Resistenzmechanismen und nehmen ihr Wachstum nach Entfernung des Antibiotikums wieder auf32. Die Faktoren, die zur Toleranz führen, können genetischer Natur sein (z. B. Mutationen, die zu einer längeren Verzögerungszeit führen49,50) oder umweltbedingten Faktoren (z. B. Produktion einer schützenden Biofilmmatrix51,52, langsames Wachstum aufgrund von Mikroumgebungsbedingungen53,54). Toleranz und Persistenz können beide durch die Mindestdauer für die Tötung quantifiziert werden (MDK, Box 1); Darüber hinaus ist Persistenz typischerweise durch das Vorhandensein einer zweiphasigen Abtötungskurve gekennzeichnet31,32. Die zyklische Exposition planktonischer E. coli-Kulturen gegenüber Ampicillin führte zu einem Anstieg der MDK, und dieser Anstieg war auf eine längere Verzögerungszeit einzelner Zellen zurückzuführen; Es wurden keine Veränderungen der MHK beobachtet, was eine Resistenz ausschließt49. Wenn planktonische Populationen verschiedener ESKAPE-Krankheitserreger zwischen der Exposition gegenüber Aminoglykosiden und dem erneuten Wachstum hin- und herwechselten, wurde bei der Behandlung entwickelter Klone im Vergleich zur Startkultur ein 37- bis 213-facher Anstieg der Anzahl persistierender Zellen beobachtet, wiederum ohne Anstieg der MHK55. WGS von entwickelten Klonen mit hoher Persistenz zeigten, dass dieser Phänotyp auf eine einzelne Mutation in den Genen oppB, gadC oder nuoN zurückzuführen sein kann, die zuvor nicht an der Persistenz beteiligt waren56.

Die experimentelle Evolution hat gezeigt, dass die Entwicklung von Toleranz und Beharrlichkeit „Sprungbretter“ für die Entwicklung von Resistenzen sein können. Bei der Entwicklung planktonischer E. coli-Kulturen in Gegenwart von Ampicillin führten Mutationen in der Promotorregion von ampC, die für eine β-Lactamase kodiert, zu einer Erhöhung der MHK nach 7–17 Zyklen, während ein verzögertes Wachstum bereits nach 3–4 Zyklen beobachtet wurde, d. h Die Entwicklung der Toleranz ging der des Widerstands voraus57. Die WGS der ersten resistenten Klone zeigte, dass alle zusätzliche Mutationen trugen, von denen bei einigen zuvor festgestellt worden war, dass sie die Toleranz durch eine Verlängerung der Verzögerungszeit erhöhen49; Eine zusätzliche Sequenzierung ergab, dass dieselben Toleranzmutationen bereits vor dem Auftreten der ampC-Resistenzmutationen vorhanden waren. Da Mutationen in mehreren Genen zu Toleranz führen können, ist die Zielgröße für Mutationen, die zur Toleranz führen, größer als die für Resistenz (ampC ist das einzige Ziel); Dadurch treten Toleranzmutationen häufiger auf und können früher erkannt werden. Der Beginn von Evolutionsexperimenten mit Wildtypstämmen und Stämmen, die bereits eine Toleranz entwickelt hatten, zeigte, dass sich Resistenzmutationen in toleranten Klonen schneller etablierten. Der Überlebensvorteil, den Resistenzmutationen bei Exposition gegenüber hohen Ampicillinkonzentrationen verleihen, ist vergleichbar mit dem der Toleranzmutationen (als ampC-Resistenzmutationen). führen nur zu einem teilweisen Widerstand). Infolgedessen beginnen Toleranzmutationen nach einigen Zyklen die Bevölkerung zu dominieren, und das Vorhandensein dieser Mutationen verringert die Wahrscheinlichkeit eines Verlusts von Resistenzmutationen während einer Antibiotikabehandlung57. Ähnliche Beobachtungen wurden für P. aeruginosa gemacht: Bei aufeinanderfolgender Exposition passt sich P. aeruginosa schnell an hohe Konzentrationen von Tobramycin an, was zu einem schrittweisen Anstieg der Überlebensrate führt, und nach 7–8 Zyklen hatten alle entwickelten Abstammungslinien deutlich höhere MHK-Werte als der angestammte Stamm58 erreicht. WGS zeigte, dass Allele in einer bestimmten Reihenfolge auftraten und ihre Fixierung erreichten, wobei Mutationen in Genen, die an der Atmung und dem Energiestoffwechsel beteiligt sind (was zu Toleranz führt), typischerweise dem Erwerb von Resistenzmutationen vorausgingen und in regelmäßigen Abständen P. aeruginosa-Wildtyp und Mutanten mit unterschiedlichen Ausmaßen freilegten Die Toleranz gegenüber Tobramycin bestätigte, dass die Resistenzentwicklungsraten in allen Gruppen ähnlich waren, dass aber tolerante Abstammungslinien die anfängliche Selektion mit größerer Wahrscheinlichkeit überlebten. Dies deutet darauf hin, dass Bakterienpopulationen mit hoher Toleranz eine bessere Chance haben, Resistenzen zu entwickeln als Populationen mit geringer oder keiner Toleranz58. Schließlich haben mehrere Studien auf einen Zusammenhang zwischen Persistenz und der Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung hingewiesen, z. B. bei Mycobacterium tuberculosis59, Pseudomonas spp.60 und E. coli61.

Für einen detaillierten Überblick über die verfügbaren Biofilmmethoden verweisen wir auf aktuelle Übersichten62,63,64,65. Wichtig ist, dass der allgemeine Aufbau in den meisten Evolutionsexperimenten zwar ähnlich ist (mit sich wiederholenden Zyklen von Wachstum, Behandlung und Transfer in eine neue Umgebung) (Abb. 1a), das verwendete Modell jedoch tiefgreifende Auswirkungen auf das Ergebnis des Experiments haben kann und nicht auf alle Fälle Das vitro-Modell ahmt die Evolution in vivo nach, z. B. verwenden viele Modelle Oberflächen und Wachstumsmedien, die die In-vivo-Bedingungen nur schlecht widerspiegeln15.

a Schematischer Überblick über den allgemeinen Aufbau experimenteller Evolutionsexperimente zur antimikrobiellen Behandlung von Biofilmen. b P. aeruginosa bildet in SCFM2 leicht Aggregate, was dieses zu einem geeigneten Wachstumsmedium für die Untersuchung der Evolution in einer relevanten Mikroumgebung macht. c Basierend auf der Analyse der gesamten Genomsequenz (Mutationen, die in P. aeruginosa PAO1 nach wiederholter Exposition gegenüber Furanon C-30 auftreten, als Beispiel gezeigt89), kann die Häufigkeit von Mutationen berechnet und die Auswirkung von Mutationen auf die Proteinfunktion (fusA1 als Beispiel gezeigt89) ermittelt werden geschätzt. d Die phänotypische Charakterisierung beginnt typischerweise mit der Bestimmung der antimikrobiellen Empfindlichkeit (hier anhand der Scheibendiffusion dargestellt) und der Anzahl der KBE (die Anzahl der KBE in drei replizierten B. cenocepacia-Populationen nach wiederholten Zyklen der Tobramycin-Exposition wird als Beispiel gezeigt70). Die experimentelle Evolution in Biofilmen führt häufig zum Auftreten kleiner Kolonievarianten (SCV) (P. aeruginosa AA2 als Beispiel, Bild mit freundlicher Genehmigung von Dr. A. Sass). Schließlich treten im Laufe der Evolution Veränderungen im Stoffwechsel auf, die beispielsweise mithilfe der Mikrokalorimetrie gemessen werden können. Als Beispiel wird die Stoffwechselaktivität nach der Behandlung von WT P. aeruginosa PAO1 (links) oder dem gleichen Stamm, der sich in Gegenwart von Tobramycin entwickelt hat (rechts), gezeigt.

In statischen Systemen werden Biofilme gezüchtet und behandelt. Anschließend werden Zellen gesammelt, um einen neuen Zyklus einzuleiten. In dynamischen Systemen wächst ein Biofilm kontinuierlich und wird behandelt, ohne gestört zu werden.

Auf Kunststoff- oder Glasperlen gebildete Biofilme werden häufig zur Untersuchung der Evolution verwendet17,66,67,68,69,70,71,72. Das Kügelchenmodell wurde ursprünglich für die Selektion von Burkholderia cenocepacia22 entwickelt, die sich täglich an einem Kügelchen festsetzt und sich aus ihm ausbreitet. Bei diesem Aufbau wird eine Perle zusammen mit Bakterien inkubiert, die sich an der Perle festsetzen und einen Biofilm bilden. Das Kügelchen, das den Biofilm enthält, wird dann in ein anderes Empfängerröhrchen überführt, das ein neues leeres Kügelchen und frisches Medium enthält, was die Kolonisierung des neuen Kügelchens ermöglicht, ohne den Biofilm zu stören. Es wurden auch Varianten dieses Modells entwickelt, die stärker auf die Untersuchung der Reaktionen auf eine antimikrobielle Behandlung zugeschnitten sind70,73. Obwohl es nur die Untersuchung von oberflächengebundenen Biofilmen ermöglicht, ist es aufgrund der einfachen Handhabung und der Kompatibilität mit verschiedenen Organismen und Wachstumsmedien ein attraktives Modell.

Koloniebiofilme können auf Membranfiltern gebildet werden, die mit dem Testorganismus beimpft und anschließend auf ein geeignetes Wachstumsmedium gelegt werden74,75. Nährstoffe diffundieren durch die Membran und die Bakterien bilden einen Biofilm auf der Filtermembran. Während des Experiments kann der Filter auf eine andere Agarplatte verschoben werden und so können Biofilme leicht antimikrobiellen Wirkstoffen ausgesetzt werden. Am Ende eines Zyklus lösen sich die Bakterienzellen von der Membran und die resultierende Suspension kann zum Animpfen einer neuen Filtermembran verwendet werden.

Das Calgary-Biofilmgerät besteht aus einer 96-Well-Platte und einem Deckel mit Stiften, die jeweils in ein Well eingetaucht sind und die Biofilmbildung unterstützen; Dieses Gerät wurde ursprünglich zur Bestimmung der minimalen Biofilm-Eradikationskonzentration entwickelt76. Während der experimentellen Entwicklung kann der Deckel mit Stiften problemlos auf eine neue 96-Well-Platte übertragen werden und Biofilme können durch Beschallung von den Stiften dispergiert werden. Die resultierenden Zellsuspensionen können dann verwendet werden, um die Biofilmbildung auf Stiften auf einem neuen Deckel zu starten77. Ein konzeptionell ähnliches System (FlexiPeg) wurde kürzlich entwickelt und zur Untersuchung von Wettbewerb und Fitness in Biofilmen verwendet78,79.

In dynamischen Modellsystemen wachsen Biofilme auf einer Oberfläche, während Nährstoffe und Abfallprodukte kontinuierlich hinzugefügt bzw. entfernt werden. Diese Systeme sind zwar technisch anspruchsvoller, haben aber den Vorteil, dass der Biofilm nicht zwischen verschiedenen Behandlungszyklen verteilt werden muss. Beispiele hierfür sind Acryl-Durchflusszellen mit Glasoberfläche80, Sartorius-Bioreaktoren81,82,83 und verschiedene mikrofluidische Geräte84,85,86.

Während in vielen Studien Standard-Wachstumsmedien (z. B. LB-Brühe) verwendet werden, ist es möglich, die In-vivo-Umgebung besser nachzuahmen, indem validierte in-vivo-ähnliche Medien verwendet werden. Dazu gehören verschiedene künstliche CF-Sputummedien87, in denen sich schnell suspendierte bakterielle Biofilmaggregate bilden (Abb. 1b) und die zur Untersuchung der Entwicklung einer Ciprofloxacin-Resistenz88 sowie einer Resistenz gegen die Kombination Tobramycin/Furanon C-3089 in P. aeruginosa-Biofilmen verwendet wurden.

Die Wahl des geeigneten Selektionsdrucks ist eine wichtige Entscheidung in Evolutionsexperimenten und kann das Ergebnis des Experiments tiefgreifend beeinflussen.

Bei der Untersuchung von Anpassungsmechanismen sollte die Antibiotikakonzentration ausreichend hoch sein, um eine Wirkung auf die Bakterien zu haben, darf jedoch nicht zu hoch sein, um das Überleben einer ausreichenden Anzahl von Bakterien zu ermöglichen, um einen nächsten Versuchszyklus einzuleiten. Es liegen keine Informationen darüber vor, welcher Konzentrationsbereich das Mutantenselektionsfenster (MSW, Box 1) für Biofilme darstellt, und verschiedene Aspekte der Biofilmbiologie beeinflussen dieses Fenster wahrscheinlich90,91. Während vorhergesagt wurde, dass das Wachstum von Biofilmen zu Verschiebungen und Verzerrungen des MSW91 führt, zeigten neuere Arbeiten mit E. coli, dass sich die minimalen selektiven Konzentrationswerte (für fünf verschiedene Antibiotika) zwischen Planktonkulturen und Biofilmen nicht unterschieden79. Aufgrund der Unsicherheit hinsichtlich der Biofilm-Haushaltsabfälle werden Antibiotikakonzentrationen häufig auf der Grundlage der MHK70 oder der minimalen Biofilm-Hemmkonzentration74 ausgewählt. Eine alternative Strategie ist die Verwendung antimikrobieller Konzentrationen, die in vivo erreichbar sind, z. B. im Sputum von CF-Patienten nach einer Inhalationstherapie75. Die Selektionsstärke kann die Evolutionsverläufe tiefgreifend beeinflussen, z. B. selektieren subletale Tigecyclin-Konzentrationen für P. aeruginosa-Mutanten mit niedrigeren Tigecyclin-MHK-Werten und höheren MHK-Werten gegenüber anderen Antibiotika als Mutanten, die unter tödlichen Konzentrationen selektiert wurden92. Im Allgemeinen führt die In-vitro-Evolution in Gegenwart eines milden Selektionsdrucks zu einer vielfältigeren Population, während die Einwirkung eines hohen Selektionsdrucks Bakterien mit mittlerer Anfälligkeit eliminiert und nur zum Nachweis der Mutationen führt, die den stärksten Effekt haben93. Die Konzentration eines Antibiotikums an der Infektionsstelle hängt von der Art der Verabreichung ab, und während mit Inhalationstherapie oder topischer Anwendung hohe Konzentrationen erreicht werden können, ist die Antibiotikakonzentration an der Infektionsstelle bei systemischer Verabreichung von Antibiotika oft wesentlich niedriger94,95 . Darüber hinaus können Biofilme als unabhängige pharmakologische Mikrokompartimente betrachtet werden96,97 und Diffusionsbeschränkungen führen häufig zur Bildung von Gradienten der Antibiotikakonzentrationen in einem Biofilm26,27,28,29,98.

Die Evolutionsverläufe unterscheiden sich zwischen Antibiotika verschiedener Klassen. Wenn sich beispielsweise P. aeruginosa in Gegenwart subletaler Tobramycin- oder Tigecyclin-Konzentrationen entwickelte, wurden Mutanten nur bei subletalen Tigecyclin-Konzentrationen ausgewählt92. Während diese Verlaufskurven von der Wirkungsweise der antimikrobiellen Wirkstoffe abhängen, haben verschiedene Klassen bakterizider Antibiotika auch gemeinsame Aspekte, darunter, dass sie meist die Biosynthese von Makromolekülen (DNA, Proteine, Peptidoglycan) hemmen und Veränderungen im Stoffwechsel induzieren, die die Bildung von Makromolekülen fördern reaktive Sauerstoffspezies99.100. Darüber hinaus hängt die Aktivität einiger Antibiotika stark vom mikrobiellen Stoffwechsel ab, während andere Antibiotika für ihre abtötende Wirkung nur schwach vom Stoffwechsel abhängen101; Gegenüber der erstgenannten Gruppe von Antibiotika wird sich schnell eine Toleranz entwickeln, nicht jedoch gegen die letztere102.

Schließlich kann das Behandlungsregime einen Einfluss auf den eingeschlagenen Evolutionsverlauf haben. Die Konzentration des antimikrobiellen Wirkstoffs kann im Verlauf des Evolutionsexperiments konstant gehalten werden70,75 oder Bakterien können allmählich steigenden antimikrobiellen Konzentrationen ausgesetzt werden82,85 und die Exposition kann kontinuierlich69,74,75,82,85 oder intermittierend70,77,103,104 erfolgen. Das Nachwachsen des Biofilms nach jedem Behandlungszyklus stellt sicher, dass während des gesamten Experiments Biofilme mit ähnlicher Zelldichte untersucht werden, und die Nachwuchsphase kann die Abnahme der Antibiotikakonzentration zwischen zwei Behandlungen nachahmen. Darüber hinaus kann eine kontinuierliche Exposition zu einer wachstumsabhängigen Selektion führen, die vermieden werden kann, indem die Behandlungen durch Runden antibiotikafreien Wachstums getrennt werden42.

Die experimentelle Entwicklung der antimikrobiellen Empfindlichkeit wurde in komplexeren Umgebungen noch nicht umfassend untersucht, obwohl mehrere Studien zeigen, dass Evolutionsexperimente mit polymikrobiellen Biofilmen machbar sind; Beispiele hierfür sind ein Dual-Spezies-Biofilm (Acinetobacter sp. + Pseudomonas putida), der sich auf Benzylalkohol entwickelt hat105, die Entwicklung von P. aeruginosa in Gegenwart von Staphylococcus aureus106 oder Mitgliedern des CF-Mikrobioms107 und eine Modellbakteriengemeinschaft mit 34 Arten, die wiederholt Streptomycin ausgesetzt wurde108. Beispiele für In-vivo-Studien umfassen die serielle Vermehrung von S. pneumoniae durch wiederholte murine Nasenbesiedlung109 und die Anpassung von Shewanella oneidensis an das Leben im Darm von Zebrafischlarven110. Kürzlich wurde ein Caenorhabditis-elegans-Infektionsmodell verwendet, um zu zeigen, dass die wiederholte Exposition von B. cenocepacia gegenüber der Antivirulenzverbindung FR900098, einem Inhibitor des Nicht-Mevalonat-Signalwegs, nicht zu Veränderungen in der Empfindlichkeit gegenüber dieser Verbindung führte111.

Bei der Auswahl von Isolaten für experimentelle Evolutionsstudien und bei der Analyse der Ergebnisse sollte die Variabilität zwischen den Stämmen berücksichtigt werden. Beispielsweise können klinische P. aeruginosa-Isolate auf der Grundlage der In-vitro-Biofilmmorphologie und der Transkriptionsprofile in verschiedene Cluster eingeteilt werden, und Stämme in verschiedenen Clustern weisen nur ein eingeschränktes Kern-Biofilm-Transkriptionsprofil auf. Diese Unterschiede scheinen eher vom genetischen Hintergrund der einzelnen Stämme als vom Reifestatus des Biofilms geprägt zu sein112. Auch die Toleranz wird zu einem großen Teil durch den individuellen Stammhintergrund bestimmt und diese stammabhängige Toleranz ist auch antibiotikaabhängig, wobei eine Kreuztoleranz zwischen klinischen P. aeruginosa-Isolaten für Ciprofloxacin und Tobramycin, nicht jedoch für Colistin, beobachtet wird113. Diese Variabilität zwischen den Stämmen kann einen tiefgreifenden Einfluss auf die Evolutionsverläufe während der experimentellen Evolution haben und wird wahrscheinlich die Aufklärung des Beitrags spezifischer Toleranz- und Resistenzmechanismen zur verringerten Anfälligkeit erschweren. Gleichzeitig unterstreicht es die Vielseitigkeit bakterieller Krankheitserreger, parallele Lösungen zu finden.

Veränderungen der antimikrobiellen Empfindlichkeit werden nicht nur beobachtet, wenn Populationen in Gegenwart eines antimikrobiellen Wirkstoffs entwickelt werden, sondern wurden auch in einigen experimentellen Evolutionsstudien beobachtet, in denen Biofilme in Abwesenheit von Antibiotika entwickelt werden (z. B. in E. coli114 und P. aeruginosa74,115). Diese Veränderungen sind wahrscheinlich das Ergebnis höherer Mutationsraten in Biofilmen (Kasten 2) und in Kombination mit einer Reihe anderer Mechanismen, die an der verringerten Anfälligkeit12,39 beteiligt sind, trägt die daraus resultierende Vielfalt zum Überleben der Bevölkerung bei („Versicherungshypothese“)15,116,117,118. Im nächsten Abschnitt konzentrieren wir uns jedoch auf experimentelle Evolutionsstudien, die Veränderungen in der antimikrobiellen Empfindlichkeit von Biofilmen untersuchen, die während der Exposition gegenüber Antibiotika auftreten.

Eine nicht erschöpfende Übersicht über Gene, die in P. aeruginosa-Biofilmen während der experimentellen Evolution in Gegenwart von Antibiotika mutiert sind, ist in Tabelle 1 dargestellt.

In P. aeruginosa PAO1-Kolonie-Biofilmen, die sich auf Polycarbonatmembranen bildeten, führte die Exposition gegenüber subinhibitorischen Konzentrationen von Ciprofloxacin schnell zu einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber diesem Antibiotikum74. Nach 7 Passagen war die Größe der resistenten Subpopulationen in Biofilmen signifikant größer als in Planktonpopulationen und die mittlere MHK von Ciprofloxacin gegenüber ausgewählten Kolonien, die aus durch Ciprofloxacin entwickelten Biofilmen stammten, stieg während der experimentellen Entwicklung signifikant an; Letzteres wurde bei Kolonien, die aus Planktonkulturen stammten, nicht beobachtet (obwohl die Klone mit den höchsten MHK-Werten aus Planktonkulturen stammten)74. Sowohl die Anzahl der Mutationen als auch das Mutationsspektrum unterschieden sich zwischen den entwickelten Populationen: Eine signifikant höhere Anzahl nicht-synonymer Mutationen wurde in den mit Ciprofloxacin entwickelten Populationen beobachtet, Übergänge waren in planktonischen Populationen häufiger und Transversion und Indels waren in Biofilmen häufiger (letzteres). möglicherweise mit einer höheren Aktivität von Insertionssequenzen unter sauerstofflimitierten Bedingungen verbunden119,120). Mutationen in mexR (Regulator der Effluxpumpe MexAB-OprM), nfxB (MexCD-OprJ) und mexS (MexEF-OprN) waren häufig in Biofilmen, die sich in Gegenwart von Ciprofloxacin entwickelten, während Mutationen in nalC und nalD (Regulatoren von MexAB-OprM) sowie in gyrA und gyrB wurden häufig in durch Ciprofloxacin entwickelten Planktonpopulationen gefunden. Darüber hinaus wurden in mehreren Biofilmen, die sich in Gegenwart von Ciprofloxacin entwickelten, niederfrequente Mutationen in Genen gefunden, die mit dem Stoffwechsel zusammenhängen; Zu den mutierten Genen gehören PA1252 (Malatdehydrogenase), nuoJ und PA1054 (NADH-Dehydrogenase)74. Weitere Mutationen im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel, die in Ciprofloxacin-exponierten Biofilmen identifiziert wurden, umfassen Mutationen in Genen, die mit dem TCA-Zyklus (z. B. sdhA) und dem Metabolismus und Transport von Polyamin und Arginin (z. B. argS) in Zusammenhang stehen, sowie in Genen, die für verschiedene Sigma-Faktoren kodieren (einschließlich rpoN). und rpoS)121. Die letztgenannten Mutationen könnten helfen, die verlängerte Verzögerungsphase und die erhöhten Verdopplungszeiten zu erklären, die bei Ciprofloxacin-resistenten Klonen beobachtet wurden, die aus entwickelten Biofilmen gewonnen wurden. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass im Biofilm gezüchtete P. aeruginosa-Zellen, die subinhibitorischen Ciprofloxacin-Konzentrationen ausgesetzt sind, häufiger Mutationen tragen, die zu einer geringen Resistenz führen, was wiederum die schrittweise Entwicklung einer Ciprofloxacin-Resistenz in vivo beschleunigen könnte74. Interessanterweise erhöhte das Fehlen der wichtigsten P. aeruginosa-Katalase KatA unter den gleichen Versuchsbedingungen den Anteil der Ciprofloxacin-resistenten Population in Biofilmen und es wurden mehr Mutationen in entwickelten ΔkatA-Biofilmen beobachtet75, was wiederum die Rolle unterstreicht, die oxidativer Stress bei der Erzeugung von Diversität spielen kann Biofilme122. Dennoch zeigt die Beobachtung, dass Ciprofloxacin-resistente Mutanten auch nach der Entwicklung von Biofilmen unter anaeroben Bedingungen auftreten, dass oxidativer Stress nicht der einzige Mechanismus ist75.

Unter Verwendung eines Bead-basierten Modells wurden P. aeruginosa PA14-Biofilme in Abwesenheit oder Anwesenheit steigender Tobramycin-Konzentrationen entwickelt. Im Biofilm, der sich in Gegenwart von Tobramycin entwickelte, stiegen die MHK-Werte um das 16-fache und am Ende des Experiments hatten alle Tobramycin-exponierten Biofilme Mutationen in fusA1 (kodierend für den Elongationsfaktor G)73 erworben. Während fusA1-Mutationen auch in Tobramycin-exponierten Planktonpopulationen auftraten, dominierten sie in allen endgültigen Biofilmpopulationen, während ihre Häufigkeit in planktonisch entwickelten Populationen variabler war. Die Untersuchung weiterentwickelter mutierter Klone ergab, dass fusA1-Mutationen allein zu einem zwei- bis vierfachen Anstieg der Tobramycin-MHK und mindestens einem sechsfachen Anstieg der Tobramycin-Konzentration, in der Biofilme überlebten, führten. P. aeruginosa-Biofilmpopulationen erwarben außerdem häufig Mutationen in den orfKHLN-Genen (die für O-Antigen-Biosyntheseenzyme kodieren) und Mutanten mit Mutationen in orfN und fusA1-Mutationen waren resistenter als Mutanten mit Mutationen in fusA1 allein.

Schließlich wurde kürzlich die experimentelle Evolution in Biofilmen und Planktonkulturen von P. aeruginosa genutzt, um den Mechanismus der Resistenz gegenüber dem manipulierten kationischen antimikrobiellen Peptid WLBU2123 zu identifizieren. WGS ergab, dass überlebende Populationen mindestens zwei Mutationen in drei wichtigen Funktionskategorien aufwiesen, nämlich LPS-Modifikation (pmrB), O-Antigen-Biosynthese (orfN) und Biofilmbildung (wspF und morA). Während bekannt ist, dass pmrB und orfN an der Resistenz gegen kationische Peptide beteiligt sind, war das Auftreten von Mutationen in Genen des WSP-Signalwegs (sowohl in Biofilmen als auch in Planktonkulturen ausgewählt) unerwarteter. Resistente Klone mit wsp-Mutationen zeigten eine stärkere Aggregation, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte Aggregat- und/oder Biofilmbildung selbst zur WLBU2-Resistenz beitragen könnte123.

Eine nicht erschöpfende Übersicht über Gene, die in A. baumannii-Biofilmen während der experimentellen Evolution in Gegenwart von Antibiotika mutiert sind, ist in Tabelle 1 dargestellt.

Mithilfe eines Strömungsmodells, bei dem A. baumannii-Biofilme in Kunststoffschläuchen gebildet werden, die an eine peristaltische Pumpe angeschlossen sind, wurde die Wirkung der Exposition gegenüber Ciprofloxacin (0,5 x MHK) und Tetracyclin (0,25 x MHK) untersucht124. Zellen, die aus Biofilmen stammten, die Antibiotika ausgesetzt waren, hatten eine höhere MHK, wobei 93 % der Isolate aus mit Ciprofloxacin behandelten Biofilmen eine erhöhte Resistenz gegen Ciprofloxacin zeigten und 53 % der Isolate aus mit Tetracyclin behandelten Biofilmen eine erhöhte Resistenz gegen Tetracyclin zeigten; 80 % der Isolate aus mit Ciprofloxacin behandelten Biofilmen zeigten ebenfalls eine erhöhte Resistenz gegenüber Tetracyclin, eine Kreuzresistenz wurde jedoch bei Isolaten aus mit Tetracyclin behandelten Biofilmen nicht beobachtet. Mutationen, die in Zellen aus mit Ciprofloxacin behandelten Biofilmen selektiert werden, könnten oft direkt mit Resistenzen in Verbindung gebracht werden, z. B. Mutationen in smpB (dessen Deletion zu einer erhöhten Resistenz gegen Fluorchinolone führt, möglicherweise aufgrund einer vorbeugenden Wirkung auf die Chromosomenfragmentierung) und in adeS (was dazu führt). Überexpression des AdeABC-Effluxsystems)124. Mutationen in zwei Genen, die zum K-Locus (Produktion von Kapselpolysaccharid) gehören, wurden in Proben gefunden, die einem der beiden Antibiotika ausgesetzt waren, und diese Mutationen waren oft mit Antibiotikaresistenz-Phänotypen verbunden. In Isolaten aus mit Tetracyclin behandelten Biofilmen waren häufig mehrere Gene mutiert; Diese Mutationen korrelierten häufig positiv mit einer erhöhten Biofilmbildung und nicht mit einer erhöhten Resistenz gegen Tetracyclin und umfassen eine große Deletion von 8706 bp in einer Region, die für Proteine ​​kodiert, die an der Regulierung der c-di-GMP-Spiegel beteiligt sind124.

Das oben erwähnte Bead-Modell wurde auch verwendet, um die Entwicklung von A. baumannii-Biofilmen in Gegenwart von Ciprofloxacin69 oder Tobramycin73 zu untersuchen. Ein Vergleich von Planktonkulturen und Biofilmen, die steigenden Konzentrationen von Ciprofloxacin ausgesetzt waren, zeigte, dass sich in Planktonkulturen schnell eine hohe Resistenz entwickelte (ca. 160-facher Anstieg der MHK), während Mutanten mit niedrigen Resistenzniveaus (ca. 6-facher Anstieg der MHK) auftraten Biofilme69. Mutationen, die die Repressoren adeL (Regulator der AdeFGH-Effluxpumpe) oder adeN (Regulator der AdeIJK-Effluxpumpe) stören, dominieren in Biofilm- bzw. planktonischen Klonen, was auf das Vorhandensein lebensstilspezifischer Effluxsysteme schließen lässt, wie sie bereits in anderen Organismen identifiziert wurden125. Interessanterweise traten Mutationen in adeS (Regulator der AdeABC-Effluxpumpe) in exponierten Biofilmen auf, wurden jedoch anschließend durch adeL-Mutationen verdrängt, was in einer anderen Studie mit A. baumannii nicht beobachtet wurde124. Während einige Mutationen in planktonischen Populationen schnell eine Fixierung erreichten (darunter eine einzelne hochfrequente Mutation in gyrA in genetischen Hintergründen, die eine adeN-Mutation enthielten), blieb in Biofilmen eine größere Diversität erhalten. A. baumannii-Biofilme, die unter Tobramycin-Selektion vermehrt wurden, zeigten einen 8- bis 32-fachen Anstieg der MHK und auch bei dieser Art traten Mutationen in fusA1 in allen Replikatpopulationen auf, die Tobramycin ausgesetzt waren73. Im Gegensatz zu P. aeruginosa-Biofilmen häuften sich in mit Tobramycin behandelten A. baumannii-Biofilmen schnell Mutationen in ptsP (kodierend für Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase) an, und fusA1- und ptsP-Mutationen erreichten ähnliche Häufigkeiten in behandelten Biofilm- und Planktonpopulationen. Entwickelte mutierte Klone mit nur einer Mutation in fusA1 zeigten einen 4-fachen Anstieg der MHK, während fusA1-ptsP-Doppelmutanten einen 8-fachen Anstieg zeigten. Im Gegensatz zu fusA1 (einem essentiellen Gen) handelt es sich bei ptsP-Mutationen wahrscheinlich um Mutationen mit Funktionsverlust, da es sich um Indels handelt, die zu einer Rasterverschiebung führen. Darüber hinaus traten sechs Mutationen in cyoAB (kodierend für zwei Untereinheiten der Cytochrom-bo3-Ubiquinoloxidase, die an der Elektronentransportkette beteiligt sind) nur in Biofilmen auf; Diese Mutationen wurden jedoch bei höheren Tobramycin-Konzentrationen durch den fusA1-ptsP-Genotyp verdrängt73.

E. coli-Biofilme, die in Durchflusszellen in Gegenwart von Rifampicin oder Kanamycin gezüchtet wurden, wurden verwendet, um die Frage zu beantworten, wie das Wachstum in einem Biofilm resistente Zellen vor der Verdrängung durch leistungsfähigere, nicht resistente Zellen in Abwesenheit von Antibiotika schützen kann80. Aufgrund physikalischer Einschränkungen und der Heterogenität des Biofilms kann man vernünftigerweise davon ausgehen, dass einzelne Zellen nur mit einer Teilmenge anderer Zellen konkurrieren müssen15, während Zellen in unstrukturierten Planktonpopulationen einem globalen Wettbewerb ausgesetzt wären, bei dem sie mit allen anderen Zellen konkurrieren müssten126. Das Inokulum enthielt bereits geringe Mengen an Kanamycin- und Rifampicin-resistenten Mutanten und während der Biofilmbildung in Abwesenheit von Antibiotika erhöhte sich deren Anzahl um das etwa 45-fache. Die Behandlung mit Rifampicin führte zur Fixierung der Rifampicin-Resistenz (d. h. die gesamte Population wurde resistent), während die Behandlung mit Kanamycin zu einer Population mit 52 % resistenten Zellen führte. Als die Behandlung beendet wurde, änderte sich der Anteil der resistenten Zellen nicht, aber als Biofilmzellen auf planktonische Kulturen übertragen wurden, kehrte die Kanamycin-Resistenz (jedoch nicht die Rifampicin-Resistenz) allmählich auf die ursprünglichen niedrigen Werte zurück80. Diese Studie zeigt, dass Resistenzen in Biofilmen das Ergebnis von De-novo-Mutationen sein können, aber auch auf die Selektion bereits bestehender Mutanten zurückzuführen sein können, die außerhalb der Biofilmumgebung weniger geeignet sind. Bei E. coli-Biofilmen, die auf Silikonscheiben gezüchtet werden und zeitweise hohen (5 x MIC) und sehr hohen (80 x MIC) Konzentrationen von Amikacin ausgesetzt werden, kommt es nach der ersten Behandlung zu einem starken Rückgang der Anzahl der überlebenden Zellen, jedoch der Anzahl der überlebenden Zellen Zellen steigen schnell an (auf ~100 % Überleben bei Exposition gegenüber 5 x MHK und ~1 % Überleben bei Exposition gegenüber 80 x MHK)104. In Planktonkulturen ist der Rückgang nach der ersten Behandlung ausgeprägter und nur etwa 0,1 % der Zellen überleben letztendlich die Exposition gegenüber 5 x MHK (nach drei Zyklen mit Exposition gegenüber 80 x MHK werden keine Überlebenden beobachtet). Dieses erhöhte Überleben in Biofilmen ist mit einem schnellen MHK-Anstieg in behandelten Biofilmen verbunden, während der MHK-Anstieg in Planktonkulturen viel geringer ist. Mutationen in sbmA (kodierend für einen Peptidtransporter der inneren Membran, der zuvor mit einer erhöhten E. coli-Resistenz gegenüber Aminoglykosiden in Verbindung gebracht wurde) wurden in allen behandelten Biofilmpopulationen und zwei von drei behandelten Planktonpopulationen gefunden, jedoch nicht in unbehandelten Kontrollen; Fünf von sechs entwickelten Biofilmpopulationen wiesen mehrere sbmA-Mutationen auf, was auf eine klonale Interferenz schließen lässt. Mutationen in fusA wurden in mehreren Zwischenbiofilmpopulationen und am Ende des Experiments in einer Biofilmpopulation ausgewählt; In planktonischen Kulturen wurden keine fusA-Mutationen selektiert. fusA und sbmA können in Biofilmpopulationen koexistieren, aber fusA-Mutationen treten früher (oder spätestens gleichzeitig) auf als sbmA-Mutationen104. In Abwesenheit von Antibiotika haben fusA-Mutanten eine geringere Fitness als sbmA-Mutanten, was darauf hindeutet, dass erstere in den Zeiträumen zwischen der Behandlung in Planktonkulturen gegenselektiert wurden, während sie in Biofilmen gehalten wurden. Funktionsverlustmutationen im sbmA-Gen führen zu einem moderaten Anstieg der MHK (von 16 auf 24 µg/ml), während fusA-Mutationen zu MHK-Werten von 48 µg/ml führen. Die höchsten MHK-Werte (128 µg/ml) wurden bei Klonen beobachtet, die eine Mutation in fusA in Kombination mit einer Mutation mit Funktionsverlust in sbmA und einer Mutation in fre (kodierend für eine NAD(P)H-Flavinreduktase) aufwiesen; oder es enthielt eine Mutation in fusA in Kombination mit einer Mutation in yfgZ (das für ein Protein kodiert, das an der Reparatur bei oxidativem Stress und der Fe-S-Clustersynthese beteiligt ist). Im Allgemeinen wurden in Planktonkulturen Klone ausgewählt, die Mutationen in einer Vielzahl von Genen aufwiesen, und die MHK dieser Klone waren typischerweise niedriger als bei Klonen, die unter Biofilmbedingungen entwickelt wurden104. Interessanterweise hatten Klone, die aus behandelten Biofilmen gewonnen wurden, nach der Behandlung höhere Überlebensraten, wenn sie in Biofilmen gezüchtet wurden, als wenn sie in planktonischen Kulturen gezüchtet wurden, und die Mehrheit der entwickelten Biofilmpopulationen enthielt Mutationen in fimH, die für das FimH-Spitzenadhäsin von Typ-1-Fimbrien kodierten; Die fimH-Mutanten zeigen eine verstärkte Biofilmbildung und eine verringerte Anfälligkeit für Amikacin. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Biofilmumgebung als solche zu einer höheren Überlebensrate bei der Exposition gegenüber Amikacin beiträgt, indem sie das Auftreten neuer genetischer Resistenzmutationen erhöht, selbst wenn keine Mutationen vorhanden sind, die zu einer erhöhten Toleranz führen104.

Die experimentelle Entwicklung von Salmonella Typhimurium-Biofilmen, die auf Glasperlen und Planktonkulturen gezüchtet wurden, in Gegenwart und Abwesenheit von Azithromycin, Cefotaxim und Ciprofloxacin, zeigte, dass Biofilme und Planktonkulturen im gleichen Zeitraum Resistenzen gegen diese Antibiotika entwickeln72. Der Phänotyp der entwickelten Mutanten unterscheidet sich jedoch je nach Erkrankung; Beispielsweise zeigen Biofilme, die sich in Gegenwart von Cefotaxim entwickelt haben, im Gegensatz zu Planktonpopulationen, die Cefotaxim ausgesetzt sind (die hauptsächlich gegen Cefotaxim resistent werden), Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika72,127. Dieselben Gene waren häufig in entwickelten Plankton- und Biofilmpopulationen mutiert, z. B. Mutationen in acrB und ramR (nach Exposition gegenüber Azithromycin), envZ (Cefotaxim) und gyrA (Ciprofloxacin); obwohl die genaue Mutation manchmal unterschiedlich war (z. B. in ramR: term194Tyr in planktonischen Kulturen vs. Thr18Pro in Biofilmen; in gyrA: Ser83Tyr in planktonischen Kulturen vs. Ser83Phe in Biofilmen)72,127. Diese Mutationen legen nahe, dass Efflux (Azithromycin), verringerte Membranpermeabilität (Cefotaxim) und Zielmodifikation (Ciprofloxacin) die wichtigsten Mechanismen sind, die an der beobachteten verringerten Anfälligkeit beteiligt sind, obwohl viele andere Mutationen identifiziert wurden und WGS eindeutig zeigte, dass verschiedene Mutanten unterschiedliche Wege einschlugen Anpassung.

Aus dem LTEE und vielen anderen Studien haben wir gelernt, dass insgesamt ein hohes Maß an Parallelität in der Diversifizierung besteht und dass die Evolution zwischen replizierten Abstammungslinien und zwischen verschiedenen Experimenten, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden, reproduzierbar zu sein scheint, was darauf hindeutet, dass es sich bei den beobachteten evolutionären Veränderungen nicht um zufällige Artefakte handelt15 . Ein zusätzlicher Beweis dafür liefert ein direkter Vergleich von Mutationen in experimentell entwickelten P. aeruginosa-Isolaten und in klinischen Isolaten, einschließlich solcher aus chronischen Atemwegsinfektionen bei CF. Insgesamt bestätigen diese Vergleiche, dass die in vitro beobachteten Veränderungen für die Entwicklung der Anfälligkeit in vivo relevant sind. Beispielsweise ist die Auswahl verschiedener Ciprofloxacin-Resistenzmechanismen vom Lebensstil abhängig74, was mit der hohen Prävalenz von Mutationen in Ciprofloxacin-Zielgenen in Isolaten aus akuten Infektionen (z. B. Harnwegsinfektionen) übereinstimmt, die bei Isolaten aus chronischen Infektionen weniger häufig vorkommen128 . Ebenso treten Mutationen in den P. aeruginosa-Genen fusA1 und ptsP während der In-vitro-Evolution häufig auf, und identische Mutationen wurden in klinischen Isolaten beobachtet73,89. Die Anpassung von P. aeruginosa an chronische Infektionen kommt nicht nur bei CF vor; Beispielsweise treten auch in Isolaten, die von Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung gewonnen wurden, Mutationen in Genen auf, die häufig in experimentellen Evolutionsstudien identifiziert werden (einschließlich mexA, mexB, oprM und oprF)129.

Indirekte Beweise ergeben sich aus dem Vergleich der Phänotypen von in vitro entwickelten Isolaten mit denen, die während einer chronischen Infektion beteiligt waren54. Beispielsweise weisen P. aeruginosa-Isolate, die von jüngeren CF-Patienten gewonnen wurden, typischerweise eine geringe Resistenz und geringe Toleranz gegenüber Antibiotika auf, und die Häufigkeit arzneimitteltoleranter Isolate nahm mit zunehmendem Alter zu; Eine erhöhte Häufigkeit resistenter Isolate wurde nur bei älteren Patienten beobachtet58. Bei diesen älteren Patienten waren zwei Subpopulationen vorhanden, eine bestehend aus hochresistenten Isolaten und eine bestehend aus hypertoleranten Isolaten, die eine geringe Resistenz beibehielten, was darauf hindeutet, dass auch In-vivo-Toleranz ein „Sprungbrett“ zur Resistenzentwicklung sein kann58. Schließlich wurde kürzlich festgestellt, dass Biofilme auch bei zumindest einigen akuten Atemwegsinfektionen vorhanden sind und dass der Hauptunterschied zwischen akuten und chronischen Infektionen möglicherweise nicht im Zusammenhang mit der planktonischen bzw. biofilmischen Lebensweise, sondern vielmehr mit Unterschieden im Stoffwechsel zusammenhängt130 steht im Einklang mit Beobachtungen aus experimentellen In-vitro-Evolutionsstudien, da Mutationen in stoffwechselbezogenen Genen während der experimentellen Evolution häufig identifiziert werden73,74,121.

Während diese Ähnlichkeiten zwischen der Evolution in vitro und in vivo stark darauf hindeuten, dass in vitro identifizierte genetische Veränderungen für das, was in vivo geschieht, relevant sind, ist die experimentelle Validierung des Zusammenhangs zwischen diesen genetischen Veränderungen (in stoffwechselbezogenen Genen und anderen) einerseits und andererseits eine experimentelle Validierung des Zusammenhangs zwischen diesen genetischen Veränderungen (in stoffwechselbezogenen Genen und anderen) einerseits und andererseits Andererseits bleibt eine verringerte antimikrobielle Empfindlichkeit weiterhin erforderlich.

Veränderungen in der Biofilmbildungskapazität während der experimentellen Evolution können sich auch auf die Anfälligkeit für Biofilme auswirken. In Gegenwart von Daptomycin entwickeln in einem Bioreaktor gezüchtete Enterococcus faecalis-Biofilme schnell eine Resistenz gegen das Antibiotikum, gleichzeitig nahm jedoch die Biofilmbildung bei Daptomycin-resistenten Stämmen zu81. WGS identifizierte Kombinationen von Mutationen, die letztendlich zu einer Zunahme der Biofilmbildung führen. Obwohl diese Zunahme der Biofilmbildung keine Voraussetzung für eine erhöhte Resistenz ist, wurde sie in der Mehrzahl der resistenten Abstammungslinien beobachtet81. Auch während der experimentellen Entwicklung von A. baumannii-Biofilmen (sowohl im Kügelchenmodell69 als auch in einem Strömungssystem124) wurde eine Zunahme der Biofilmbildung beobachtet, wobei Isolate aus unbehandelten und mit Ciprofloxacin behandelten Biofilmen in beiden Studien im Vergleich zu Startkulturen eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung zeigten. Darüber hinaus zeigten viele Isolate aus mit Tetracyclin behandelten Biofilmen im Flusssystem einen zusätzlichen Anstieg der Biofilmbildung124. Während einige Mutationen, die mit einer erhöhten Biofilmbildung verbunden sind, in behandelten und unbehandelten Proben auftraten (z. B. Mutationen in ABUW_0885, die für das biofilmassoziierte Protein Bap kodieren), traten andere (z. B. Mutationen in ABUW_2055, die für ein Fimbrienadhäsin kodierten) nur in unbehandelten Biofilmen auf124. Wie bereits oben dargelegt, wurden fimH-Mutationen in der Mehrzahl der mit Amikacin behandelten E. coli-Biofilmpopulationen sowie in den unbehandelten Kontrollen gefunden; fimH-Mutanten zeigten eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung und ein erhöhtes Überleben, wenn sie hohen Konzentrationen von Amikacin ausgesetzt wurden104. In Studien mit Salmonella Typhimurium-Biofilmen, die auf Glasperlen gezüchtet wurden, wurde ein klarer Kompromiss zwischen antimikrobieller Resistenz und Biofilmbildung beobachtet72,127. Im Verlauf des Experiments stieg die Biofilmbildungskapazität (gemessen durch Kristallviolettfärbung) in Kolonien, die aus unbehandelten Glasperlen gewonnen wurden, und dies war mit einer Missense-Mutation im CytR (von der bekannt ist, dass sie die Biofilmbildung erhöht) verbunden, die bei mehreren unbehandelten Zellen auftrat Abstammungslinien72. Allerdings zeigten Kolonien, die aus Biofilmen gewonnen wurden, die sich in Gegenwart von Antibiotika (insbesondere Azithromycin und Cefotaxim) entwickelten, im Vergleich zu nicht exponierten Biofilmen eine geringere Biofilmbildung und keine von ihnen enthielt Mutationen in cytR72. Die Exposition gegenüber subinhibitorischen Konzentrationen von Cefotaxim selektiert Mutationen in der C-terminalen katalytischen/ATP-bindenden Domäne von EnvZ, die zu niedrigeren Konzentrationen des Porins OmpF und einer verringerten Permeabilität führen. Allerdings reguliert EnvZ auch die Curli-Produktion und es wurde eine verringerte Curli-Produktion und Biofilmbildung bei envZ-Mutanten beobachtet, was auf einen Kompromiss zwischen Biofilmanfälligkeit und Biofilmbildung schließen lässt. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass der Zusammenhang zwischen Veränderungen in der Biofilmbildung und der antimikrobiellen Empfindlichkeit während der experimentellen Evolution komplex und wahrscheinlich arten-, modell- und antibiotikaabhängig ist.

Obwohl in den oben diskutierten Studien unterschiedliche Modellsysteme, Antibiotika, Arten und Stämme verwendet wurden, zeigen sich einige gemeinsame Muster.

Während sich während der experimentellen Evolution sowohl in Plankton- als auch in Biofilmpopulationen eine verringerte Anfälligkeit entwickelt, sind die beteiligten Mechanismen und die Wege zu dieser verringerten Anfälligkeit nicht identisch. Mutationen in Genen, die für Ziele von Antibiotika kodieren, treten häufig in Planktonpopulationen auf, die sich in Gegenwart von Antibiotika entwickelt haben (z. B. Mutationen in gyrA nach der Evolution in Gegenwart von Ciprofloxacin), während entwickelte Biofilmpopulationen auch eine Vielzahl von Mutationen in beteiligten Genen enthalten im Efflux und Stoffwechsel69,74,121. Wenn subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen verwendet werden, wird das Wachstum in gut gemischten Planktonkulturen auf ein hohes Maß an Resistenz selektiert, während das Wachstum in räumlich strukturierten Biofilmen Mutanten mit geringeren Resistenzniveaus begünstigt69,74,121. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, wenn im Laufe der Evolution schrittweise steigende oder tödliche Antibiotikakonzentrationen verwendet werden69,73,88,104. Auch wenn arten- und/oder antibiotikaabhängige Wirkungen noch nicht ausgeschlossen werden können, deutet dies darauf hin, dass das Behandlungsregime selbst eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der endgültigen MHK-Werte in Plankton- und Biofilmpopulationen spielt.

Entwickelte Biofilmpopulationen weisen eine höhere Diversität auf als entsprechende Planktonpopulationen, in denen erfolgreiche Mutationen schnell eine Fixierung erreichen, und die Biofilmumgebung kann vor einer negativen Selektion weniger fitter Mutanten schützen, die in Planktonkulturen schnell verdrängt würden121. Eine aktuelle Studie zeigte jedoch, dass sich die Fitnesskosten für Resistenzen in oberflächenassoziierten E. coli-Biofilmen nicht von denen in planktonischen Kulturen unterscheiden79. Darüber hinaus hat eine weitere aktuelle Studie gezeigt, dass die spezifische Umgebung die Fitness und das Widerstandsniveau im Zusammenhang mit bestimmten Mutationen mitbestimmt131. Es ist eindeutig mehr Arbeit erforderlich, um tiefere Einblicke in Parameter zu gewinnen, die die Fitness in verschiedenen (strukturierten) Umgebungen beeinflussen. Darüber hinaus können Mutationen, die zu einer erhöhten Biofilmbildung führen, die Größe der toleranten Population erhöhen, die die antimikrobielle Exposition überlebt und in der sich anschließend eine Resistenz entwickeln kann104.

Während Mutationen in einigen Genen bei verschiedenen Organismen vorkommen (z. B. Mutationen in fusA wurden bei P. aeruginosa, A. baumannii und E. coli beobachtet), häufen verschiedene Organismen auch Mutationen in verschiedenen Genen an, obwohl der resultierende Phänotyp ähnlich sein könnte (Tabelle 1). Ein Beispiel für eine solche parallele Strategie sind Mutationen in P. aeruginosa orfKHLN und A. baumannii cyoAB: Während diese Gene an sehr unterschiedlichen zellulären Prozessen beteiligt sind (O-Antigen-Biosynthese bzw. Elektronentransport), führen Mutationen in beiden zu einer verringerten Permeabilität für Aminoglykoside und kann zu einer verringerten Aminoglykosid-Empfindlichkeit führen73. Ebenso könnten Mutationen in vielen verschiedenen Stoffwechselgenen oder Sigma-Faktoren zu einem verminderten Wachstum und einer „Lag-Toleranz“ führen. Dies deutet darauf hin, dass die grundlegenden Mechanismen hinter der verringerten Anfälligkeit für Biofilme für verschiedene Antibiotikaklassen und in verschiedenen Organismen ähnlich sein könnten, auch wenn es nicht möglich ist, Mutationen, mutierte Gene oder Unterschiede im Stoffwechsel oder der Genexpression verschiedener Organismen zu identifizieren. Daher stimmen Daten aus der experimentellen Evolution mit der Schlussfolgerung einer aktuellen Studie überein, die keine Beweise für eine gemeinsame genetische oder biochemische Grundlage für die antimikrobielle Toleranz in Biofilmen finden konnte, sondern zu dem Schluss kam, dass viele Gene, Proteine ​​und Stoffwechselwege gemeinsam den physiologischen Zustand bestimmen und Anfälligkeit von Bakterienzellen in einem Biofilm132.

Wir glauben, dass die experimentelle Evolution dazu beigetragen hat und auch weiterhin dazu beitragen wird, das Zusammenspiel von Resistenz, Toleranz und Persistenz aufzuklären, das der verringerten antimikrobiellen Empfindlichkeit von Biofilmen zugrunde liegt und das Ergebnis einer antimikrobiellen Behandlung bestimmt. Die Identifizierung der komplexen Muster von Mutationen, Veränderungen der Genexpression und des Stoffwechsels in verschiedenen Organismen sowie polymikrobiellen Gemeinschaften erfordert jedoch einen interdisziplinären und ganzheitlichen Ansatz und wird von der Verwendung relevanter Modellsysteme stark profitieren.

Die Datenfreigabe ist auf diesen Artikel nicht anwendbar, da während der aktuellen Studie keine Datensätze generiert oder analysiert wurden.

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TC und TB danken der Lundbeck Foundation für ihre Unterstützung. TC dankt FWO-Vlaanderen für seine Unterstützung. MB wurde vom Sonderforschungsfonds der Universität Gent unterstützt.

Labor für Pharmazeutische Mikrobiologie, Universität Gent, Gent, Belgien

Tom Coenye und Mona Bove

Costerton Biofilm Center, Universität Kopenhagen, Kopenhagen, Dänemark

Tom Coenye und Thomas Bjarnsholt

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TC hat die Rezension konzipiert. Alle Autoren haben zum Schreiben und Bearbeiten beigetragen.

Korrespondenz mit Tom Coenye.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Coenye, T., Bové, M. & Bjarnsholt, T. Antimikrobielle Empfindlichkeit von Biofilmen durch eine experimentelle evolutionäre Linse. npj Biofilms Microbiomes 8, 82 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00346-4

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Eingegangen: 07. Juni 2022

Angenommen: 04. Oktober 2022

Veröffentlicht: 18. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00346-4

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