Schnelle Erkennung von SARS

Nov 14, 2023

Nature Biomedical Engineering Band 6, Seiten 944–956 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Schnelle Nukleinsäuretests sind für die Überwachung von Infektionskrankheiten von zentraler Bedeutung. Hier berichten wir über einen Assay für schnelle COVID-19-Tests und seine Implementierung in einem Prototyp eines mikrofluidischen Geräts. Der Assay, den wir DISCoVER (für Diagnostik mit enzymatischer Coronavirus-Berichterstattung) genannt haben, umfasst eine extraktionsfreie Probenlyse über lagerstabile und kostengünstige Reagenzien, eine multiplexierte isotherme RNA-Amplifikation gefolgt von einer T7-Transkription und eine Cas13-vermittelte Spaltung eines gequenchten Fluorophors . Das Gerät besteht aus einer schwerkraftbetriebenen Einweg-Mikrofluidikkartusche, die in ein kompaktes Instrument eingesetzt wird, um den Test automatisch durchzuführen und die Fluoreszenz innerhalb von 60 Minuten auszulesen. DISCoVER kann das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) im Speichel mit einer Empfindlichkeit von 40 Kopien μl–1 nachweisen und war bei der Validierung (gegenüber quantitativer PCR) unter Verwendung der aus 63 extrahierten Gesamt-RNA zu 94 % empfindlich und 100 % spezifisch Nasenabstrichproben (33 SARS-CoV-2-positiv, mit Zyklusschwellenwerten von 13–35). Das Gerät identifizierte alle getesteten klinischen Speichelproben korrekt (10 SARS-CoV-2-positiv von 13, mit Zyklusschwellenwerten von 23–31). Schnelle Point-of-Care-Nukleinsäuretests können den Einsatz molekularer Diagnostik erweitern.

Der schnelle Point-of-Care-Nukleinsäurenachweis ist ein entscheidender Bestandteil einer robusten Testinfrastruktur zur Kontrolle der Krankheitsübertragung. Ausbrüche wie die Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) haben die Grenzen des zentralisierten diagnostischen Labormodells und seine lange Zeit von der Probe bis zur Antwort deutlich gemacht. Im Labor entwickelte Tests wie die quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR) werden in Einrichtungen durchgeführt, die arbeitsintensive Personal- und Geräteinfrastruktur für die Probenaufnahme, Nukleinsäureextraktion, Thermocycling und Datenanalyse erfordern. Der Probentransport und die Zeit für die Ergebnisberichterstattung tragen ebenfalls wesentlich zu den Durchlaufzeiten zentralisierter Tests bei. Die Entwicklung eines benutzerfreundlichen Mikrofluidikgeräts gepaart mit einer Vor-Ort-Detektion würde ein größeres Volumen und einen größeren Zugang zu schnellen molekularen Tests ermöglichen.

Bisher sind weit über 6 Millionen Todesfälle durch COVID-19 auf über 500 Millionen Infektionen mit dem Erreger, dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), zurückzuführen. Die vielfältigen Herausforderungen einer hohen asymptomatischen Infektionsrate1, unzureichender Tests und des engen Zeitfensters für die hohe Empfindlichkeit molekularer Tests2,3 können durch den breiten Einsatz molekularer Diagnostik vor Ort, beispielsweise am Arbeitsplatz oder im Klassenzimmer, bewältigt werden. Es besteht auch ein enormes Potenzial für gemeinschaftliche Überwachungstests zur Verbesserung der klinischen Arbeitsabläufe, bei denen positive Fälle durch die Überweisung an ein begrenzteres Angebot an Tests von klinischer Qualität bestätigt werden. Alternative Probenahmemethoden und Testtechnologien können ebenfalls zur Diversifizierung der diagnostischen Lieferkette beitragen, da die Standardpipeline für klinische Tests durch Engpässe bei RNA-Extraktionskits oder Abstrichtupfern eingeschränkt sein kann4,5.

Wir wollten daher eine Methode entwickeln, die keine RNA-Extraktion oder Abstriche der oberen Atemwege erfordert und in einen schnellen, automatisierten mikrofluidischen Arbeitsablauf integriert werden kann. qPCR-basierte Assays wurden bereits mit direktem Proben-Spike-in entwickelt und nutzen typischerweise eine hohe Temperatur für die Probenlyse6. Andere Ansätze nutzten chaotrope Wirkstoffe, chemische Reduktion und RNase-Inhibitoren6,7,8,9. Darüber hinaus wird berichtet, dass Speichelproben eine Übereinstimmung von 97 % mit Nasopharynxabstrichen (NP) aufweisen10,11.

Der auf Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) basierende Nachweis ist ein vielversprechender neuer Ansatz für die Nukleinsäurediagnostik. Diese Methoden beruhen auf der Guide-RNA-abhängigen Aktivierung von Cas13- oder Cas12-Nukleasen, um unspezifische einzelsträngige RNA- bzw. einzelsträngige DNA-Nukleaseaktivität zu induzieren, um ein blockiertes Reportermolekül zu spalten und freizusetzen12,13,14, 15,16,17,18,19. Der freigesetzte Reporter kann mit einem Fluoreszenzdetektor quantitativ gemessen werden, um das Testergebnis auszulesen. Der CRISPR-basierte Nachweis ist hochspezifisch, aber es kann bis zu 2 Stunden dauern, bis Cas13-Nukleasen allein eine attomolare Empfindlichkeit für diagnostische Anwendungen erreichen20,21. Im Gegensatz dazu führt die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) eine hochempfindliche Nukleinsäureamplifikation in weniger als 20 Minuten mit attomolaren Nachweisgrenzen20 (LODs) durch. Trotz der Empfindlichkeit und Geschwindigkeit von LAMP neigen solche isothermen Methoden jedoch häufig zu unspezifischer Amplifikation22,23.

Um diese Herausforderungen anzugehen, berichten wir in diesem Artikel über DISCoVER (für die Diagnostik mit enzymatischer Coronavirus-Berichterstattung), einen RNA-Extraktions-freien Test, der zwei unterschiedliche Amplifikationsmechanismen für die Empfindlichkeit mit einer Cas13-vermittelten Sonde für die Spezifität kombiniert (Abb. 1). Nach direkter Lyse und Inaktivierung von Speichelproben durch Denaturierung und Reduktion folgt auf die LAMP-Amplifikation die T7-Transkription, um zwei Schichten der Zielamplifikation bereitzustellen. Um virale CRISPR-Tests in einem Probe-zu-Antwort-Format zu demonstrieren, haben wir den DISCoVER-Workflow in ein Mikrofluidiksystem mit einem kompakten Fluoreszenzlesegerät für die Echtzeiterkennung integriert. In einem Point-of-Care-Proof-of-Concept können die Probeninaktivierung und die anschließende Amplifikation und Detektion mit diesem Gerät so gestapelt werden, dass die Inaktivierungszeit im Arbeitsablauf nicht geschwindigkeitsbestimmend ist (ergänzende Abbildung 1).

Patientenproben, wie z. B. Speichel, werden gesammelt und in direktem Lysepuffer hitzeinaktiviert und anschließend auf eine schwerkraftbetriebene Einweg-Mikrofluidikkartusche geladen. Der Inaktivierungsschritt dauert je nach institutionellen Vorschriften 5 bis 20 Minuten37. Die Kartusche wird dann in ein Begleitinstrument eingesetzt, das den DISCoVER-Assay automatisch in einem geschlossenen System durchführt, um eine Kontamination der Reaktion zu minimieren. In Schritt 1 nutzt eine anfängliche rLAMP-Reaktion zwei Mechanismen zur Amplifikation von Zielnukleinsäuren. RFU, relative Fluoreszenzeinheiten. Cas13-Enzyme werden mit einer Leit-RNA so programmiert, dass sie die gewünschten RNA-Moleküle gegenüber unspezifisch amplifizierten Produkten spezifisch erkennen. Die anschließende Aktivierung der Cas13-Ribonukleaseaktivität in Schritt 2 führt zur Spaltung von Reportermolekülen für gesättigte Signale innerhalb von 5 Minuten nach der CRISPR-Erkennung. Einschließlich der Betätigungszeit des Geräts beträgt die Auslesezeit in einem fertigen System 48 Minuten. In der linken Hälfte der Kartusche ermöglichen Guide-RNAs, die auf SARS-CoV-2 abzielen, den schnellen und selektiven Nachweis attomolarer Viruskonzentrationen. Die verspiegelte Hälfte der Kartusche dient der internen Prozesskontrolle und ermöglicht ein negatives Testergebnis, indem sichergestellt wird, dass ausreichend Patientenproben vorhanden sind. Durch die Ausnutzung des Template-Wechsels und der CRISPR-Programmierbarkeit kann das Point-of-Care-System DISCoVER zu einer verbesserten Überwachung verschiedener Krankheitserreger beitragen.

DISCoVER umfasst einen 30-minütigen Amplifikationsschritt, gefolgt von einer 5-minütigen Cas13-Auslesung, und erreicht attomolare Empfindlichkeit bei nicht extrahierten Speichelproben. Wir kombinieren die Amplifikation auch mit einer Prozesskontrolle, die auf dem Nachweis eines menschlichen Referenzgens basiert, um das Vorhandensein von ausreichend Zellmaterial in der Probe zu bestätigen. Wir validierten DISCoVER anhand einer speichelbasierten Probenmatrix, die lebendes SARS-CoV-2-Virus und Gesamt-RNA enthielt, die aus Nasenabstrichen von Patienten mit Zyklusschwellenwerten (Ct) im Bereich von 15 bis 35 extrahiert wurde. Wir beobachteten einen positiven Vorhersagewert (PPV) von 100 % und ein negativer Vorhersagewert (NPV) von 93,75 % für den DISCoVER-Assay im Vergleich zu qPCR. Als Machbarkeitsnachweis für die automatisierte Erkennung wurden künstlich positive Speichelproben auf einem Mikrofluidikgerät mit integrierter Echtzeit-Fluoreszenzdetektion einer End-to-End-Analyse unterzogen. Eine integrierte Prozesskontrolle ermöglichte die Unterscheidung zwischen positiven, negativen und ungültigen Testergebnissen. Um die Robustheit des automatisierten Mikrofluidiksystems weiter zu validieren, wurden künstliche Speichelproben untersucht, die eine attomolare Empfindlichkeit anzeigten. Schließlich wurden vor Ort gesammelte, natürliche klinische Proben auf dem Gerät getestet, um die Fähigkeit des Assays zu demonstrieren, positive und negative Proben realer Patienten zu unterscheiden. Insgesamt ermöglicht das DISCoVER-System einen tragbaren, schnellen und empfindlichen Virusnachweis zur Krankheitserregerüberwachung.

Wir versuchten zunächst, die Nukleinsäure-Nachweiseigenschaften der Enzyme Cas13 und Cas12 zu vergleichen, indem wir die Reporter-Spaltungsaktivität von Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) und dem Lachnospiraceae-Bakterium ND2006 Cas12a (LbCas12a) mit passenden Guide-RNA-Spacer-Sequenzen in einer Verdünnungsreihe ihrer entsprechenden Synthese beurteilten Aktivatormoleküle (Abb. 2a). Wir haben beobachtet, dass der Nachweis von LbuCas13a bei niedrigen Aktivatorkonzentrationen wesentlich schneller erfolgt als der Nachweis von LbCas12a. Bei 100 pM dieser Aktivatorsequenz erreicht LbuCas13a unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen mehr als 30-mal schneller die halbmaximale Fluoreszenz als LbCas12a (Abb. 2b und Methoden). Der LOD von LbuCas13a liegt jedoch nach 60 Minuten immer noch im femtomolaren Bereich (Ref. 24), was bereits über der maximalen Probe-zu-Antwort-Zeit liegt, die für einen Point-of-Care-Assay wahrscheinlich relevant ist.

a, Cas13- und Cas12-Nachweiskinetik bei unterschiedlichen Aktivatorkonzentrationen. Die gestrichelten und schattierten Bereiche kennzeichnen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) bei n = 3 technischen Replikaten. b, Cas13 und Cas12 Zeit bis zur Hälfte der maximalen Fluoreszenz. †, die Zeit bis zur Hälfte der maximalen Fluoreszenz war für einen zuverlässigen Nachweis zu schnell. ††, die Zeit bis zur Halbmaximumfluoreszenz konnte innerhalb der 120-minütigen Testlaufzeit nicht bestimmt werden. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 2 technischen Replikaten. c, Schematische Darstellung der Genomsequenz von SARS-CoV-2, mit Angabe der Positionen der LAMP-Primersätze. d, Repräsentative Fluoreszenzdiagramme der LAMP-Amplifikation von 100 Kopien μl–1 synthetischer SARS-CoV-2-RNA oder NTC. Die schattierten Bereiche bezeichnen den Mittelwert ± Standardabweichung mit n = 3 technischen Replikaten. e, Zeit bis zur Schwelle von neun gescreenten LAMP-Primersätzen, die auf synthetische SARS-CoV-2-RNA oder NTC abzielen. Replikate, die nicht amplifiziert wurden, werden bei 0 Minuten dargestellt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung der amplifizierten technischen Replikate dar, n = 4. f, LOD-Assay von LAMP unter Verwendung des N-Set-1-Primer-Sets. Replikate, die nicht amplifiziert wurden, werden bei 0 Minuten dargestellt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung der verstärkten technischen Replikate dar, n = 4.

Um eine attomolare Empfindlichkeit zu erreichen, haben wir LAMP als kostengünstige und schnelle Methode zur isothermen Verstärkung gewählt. LAMP nutzt eine Reverse Transkriptase, eine strangverdrängende DNA-Polymerase und drei Sätze von Primerpaaren, um virale RNA in DNA-Substrate für LAMP umzuwandeln. Wir haben neun LAMP-Primersätze gescreent, die auf unterschiedliche Regionen über die gesamte Länge des SARS-CoV-2-Genoms abzielen (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 1)25,26,27,28. Bei der Ausrichtung auf genomische RNA-Fragmente von SARS-CoV-2 mit 100 Kopien μl–1 führten alle Sätze zu positiven LAMP-Signalen. Die maximale Fluoreszenz wurde für alle Primersätze innerhalb von 20 Minuten erreicht, und die Zeit bis zum Erreichen des Schwellenwerts wurde wie angegeben über den Einzelschwellenzyklus-Quantifizierungsmodus (Cq) bestimmt (Abb. 2d). LAMP-Primersätze, die auf Orf1ab-Satz 1, N-Satz 1 und N-Satz 2 abzielen, wurden in weniger als 15 Minuten konsistent amplifiziert (Abb. 2e).

Jeder LAMP-Primersatz führte zu einem NTC-Signal (No-Template Control), wenn auch mit einer Verzögerung im Vergleich zum positiven Zustand, der virale RNA enthielt (Abb. 2d). Diese hohe Falsch-Positiv-Rate, die möglicherweise auf die Bildung von Primer-Dimeren zurückzuführen ist, kann grundsätzlich mit einer zweiten Sonde reduziert werden, die die amplifizierte Nukleinsäuresequenz selektiv erkennt. Wir haben daher versucht, die Empfindlichkeit des LAMP-Nachweises mit der Spezifität der Cas13-Zielerkennung zu kombinieren.

Um den Nachweis unspezifischer Amplifikationsprodukte durch Cas13 zu vermeiden, müssen die Guide-RNAs eine minimale Sequenzüberlappung mit den Primersequenzen aufweisen. Aufgrund der Komplexität der LAMP-Konkatemerisierung überlappen LAMP-Primer stark und verstärken kurze Zielregionen, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen24,29. Unsere LAMP-Primersätze generierten Amplikons mit nicht überlappenden Primersequenzen im Bereich von 1 bis 60 nt. N-Set 1, das auf das SARS-CoV-2-N-Gen abzielt, wurde aufgrund seiner kurzen Zeit bis zum Erreichen des Schwellenwerts und einer Amplikongröße, die Cas13-Leit-RNAs aufnehmen kann, für die weitere Verwendung ausgewählt (Abb. 2e und Ergänzungstabelle 1). Als nächstes führten wir eine Verdünnungsreihe genomischer viraler RNA durch und bestimmten die N-Set-1-LOD auf 25 Kopien μl–1 (Abb. 2f), vergleichbar mit früheren Studien, die LODs zwischen 10 und 100 Kopien μl–1 meldeten (Lit. 7, 30,31).

Da Cas13 auf einzelsträngige RNA abzielt (Abb. 2a), während LAMP DNA-Substrate amplifiziert, verwendeten wir die Transkription der LAMP-Produkte, um die Substratkompatibilität zu ermöglichen. Für die anschließende Transkription und den Cas13-Nachweis wurden T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenzen in die LAMP-Primersequenzen eingebaut. Wir haben diese „Umwandlung der LAMP-Amplifikation in RNA“ oder „rLAMP“ genannt. LAMP verwendet drei Primerpaare: Vorwärts- und Rückwärts-Außenprimer (F3/B3) für die anfängliche Zielstrangverdrängung, Vorwärts- und Rückwärts-Innenprimer (FIP/BIP) zur Bildung der Kern-Stamm-Schleifen-Struktur von LAMP und Vorwärts- und Rückwärts-Loop-Primer (FLoop). /BLoop) für eine zusätzliche Schicht schleifenbasierter Verstärkung (Extended Data Abb. 1). Durch mehrere Iterationen der Primerbindung und -verlängerung verstärken sich diese Stamm-Schleifen-Strukturen zu Konkatemeren, die aus invertierten Wiederholungen der Zielsequenz bestehen (Abb. 3a).

a, Schematische Darstellung des rLAMP-Mechanismus für die exponentielle DNA-Amplifikation unter Verwendung von F3/B3- und FIP/BIP-Primern, was zu invertierten Wiederholungsstrukturen höherer Ordnung führt. Rote Pfeile zeigen die Position der T7-Promotorsequenz an, die in den mBIP-Primer eingefügt ist. Bei der T7-Transkription enthält die resultierende RNA eine oder mehrere Kopien der Cas13-Zielsequenz (orange). b, Schematische Darstellung der Position verschiedener T7-Promotorpositionen auf der rLAMP-Hantelstruktur und den Schleifenprimern. c, rLAMP-Zeit bis zur Schwelle von sechs verschiedenen T7-Promotor-Insertionen. Replikate, die nicht amplifiziert wurden, werden bei 0 Minuten dargestellt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung der amplifizierten technischen Replikate dar, n = 4. d, Denaturierung von PAGE-Gelen von mBIP-rLAMP-Produkten zur Überprüfung der T7-vermittelten Transkription. AfeI spaltet in der crRNA-Zielregion von Templatprodukten, was voraussichtlich zu einer einzigen transkribierten Hauptspezies führt. e, Kinetik der T7-Transkription und Cas13-Detektion auf mBIP-rLAMP-Produkten. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 technischen Replikaten. f, Cas13-Nachweis von acht technischen Replikaten der mBIP-rLAMP-Amplifikation auf genomischer RNA, dargestellt als Faltungsänderung über NTC an verschiedenen Reaktionsendpunkten.

Um die RNA-Transkription nach LAMP (rLAMP) zu ermöglichen, haben wir systematisch die Insertion von T7-Promotorsequenzen in drei verschiedenen Regionen von LAMP-Primern getestet: am 5‘-Ende der FIP- und BIP-Primer (5‘-FIP/5‘-BIP), im in der Mitte der FIP- und BIP-Primer (mFIP/mBIP) und am 5′-Ende der Schleifenprimer (FLoop/BLoop) (Abb. 3b). Die Zugabe des T7-Promotors hatte keinen großen Einfluss auf die rLAMP-Zeit bis zum Schwellenwert von N-Satz 1, wenn 100 Kopien μl–1 viraler genomischer RNA vorliegen (Abb. 3c). Um zu bestätigen, dass die Zielsequenzen spezifisch amplifiziert wurden, führten wir einen Restriktionsenzymverdau der LAMP-Produkte unter Verwendung von AfeI durch, das in der Cas13-Guide-RNA-Zielregion innerhalb des rLAMP-Amplikons verdaut (ergänzende Abbildung 2a, b). Das Fehlen einer AfeI-Verdauung unter allen NTC-Bedingungen bestätigte, dass das NTC-Signal aus einer unspezifischen Amplifikation von Sequenzen resultiert, denen die zum Leitfaden passende Zielsequenz fehlt.

Um zu testen, ob der T7-Promotor ordnungsgemäß in das rLAMP-Amplikon eingebaut und funktionsfähig war, führten wir als nächstes eine In-vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase durch. Die Analyse der denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) zeigte, dass die virale Matrize und die NTC-Bedingungen zur RNA-Transkription für alle Primersätze führten (Abb. 3d). Wie erwartet ergab der AfeI-Verdau des mBIP-rLAMP-Produkts ein einzelnes 147-nt-Produkt, das den T7-Promotor enthielt (ergänzende Abbildung 2a). Die anschließende T7-Transkription führte zum erwarteten 85-nt-RNA-Produkt (Abb. 3d).

Als nächstes optimierten wir die Bedingungen des Reaktionspuffers, um die T7-Transkription und den Cas13-Nachweis in einem einzigen Schritt zu unterstützen, gefolgt von einem systematischen Screening der Cas13-Spaltungsaktivität in Gegenwart von rLAMP-Produkten, die T7-Promotorinsertionen in verschiedenen rLAMP-Amplikons enthalten. Wir haben festgestellt, dass die Mitte der Insertionsposition des BIP-Primers (mBIP) zum schnellsten Nachweis führt, und haben daher diesen Primersatz für weitere Studien ausgewählt (ergänzende Abbildung 3 und ergänzende Tabelle 2). Cas13 erkennt das rLAMP-Amplikon schnell mit einer viralen Vorlage und vermeidet gleichzeitig den Nachweis unspezifischer NTC-Amplikons, wodurch in weniger als 2 Minuten eine über zehnfache Signaländerung gegenüber dem NTC-Hintergrund erreicht wird (Abb. 3e). Die Signalsättigung trat innerhalb von 5 Minuten ein und erreichte ein Signal-Hintergrund-Verhältnis von über 40.

Um die Reproduzierbarkeit der DISCoVER-Pipeline zu bestätigen, haben wir den Cas13-Nachweis an acht Replikaten von mBIP-rLAMP-Reaktionen getestet, wobei Aktivator-RNA in einer Konzentration von 100 Kopien μl–1 in einer 20-μl-Reaktion enthalten war. Alle acht Replikate führten zu einem > 25-fachen Anstieg des Signals gegenüber NTC, das weit über die hier verwendete Detektionszeit von 5 Minuten hinaus stabil bleibt (Abb. 3f).

Nachdem wir ein Amplifikations- und Nachweisprotokoll eingerichtet hatten, optimierten wir als Nächstes die Probenverarbeitung, um ein einfaches Hitzeprotokoll in Kombination mit chemischen Reagenzien zu erstellen, um die Virusinaktivierung zu fördern und die Aktivität der im Speichel vorhandenen RNA-abbauenden Nukleasen zu dämpfen32. Wir haben zwei Konzentrationen des lagerstabilen Reduktionsmittels Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) gepaart mit dem Ionenchelator Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Ref. 7,8) sowie im Handel erhältlichen Reagenzien wie QuickExtract-Puffer, die Detergenzien und Proteinasen enthalten, untersucht und DNA/RNA-Schutz, der chaotropes Guanidinthiocyanat enthält.

Um die Kompatibilität dieser inaktivierenden Reagenzien mit rLAMP zu testen, erstellten wir scheinpositive Speichelproben, indem wir die Reagenzien zu wärmebehandeltem Speichel bei 75 °C hinzufügten (Ref. 33) und genomische SARS-CoV-2-RNA in zwei verschiedenen Konzentrationen hinzufügten: 1.000 Kopien µl−1 und 200 Kopien µl−1. In Abwesenheit inaktivierender Reagenzien konnten wir kein rLAMP-Signal erkennen, was auf einen Abbau der RNA im Speichel durch endogene RNasen in der Probe schließen lässt (Abb. 4a). Im Gegensatz dazu wurde genomische RNA ohne Speichel in weniger als 15 Minuten schnell amplifiziert. Nur der niedrige Konzentrationszustand von TCEP-EDTA schützte die Ziel-RNA und bewahrte die rLAMP-Empfindlichkeit in allen vier Replikaten (Abb. 4a). Dieser Reagenziencocktail bricht gleichzeitig Proteindisulfidbindungen und bindet zweiwertige Kationen. Es wird erwartet, dass seine Aktivität die RNase-Aktivität dämpft und gleichzeitig die Mucin-Gel-Bildung stört, wodurch die variable Speichelviskosität reduziert wird und die Probenverarbeitung einfacher wird34,35.

a: Die Bedingungen der direkten Speichellyse wurden auf Kompatibilität mit dem DISCoVER-Workflow getestet. Replikate, die nicht amplifiziert wurden, werden bei 0 Minuten dargestellt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung der amplifizierten technischen Replikate dar, n = 4. IA, Inaktivierungsreagenz; QE, QuickExtract. b, Schematische Darstellung der künstlichen Erzeugung von Speichelproben, der Quantifizierung mittels RT-qPCR und der Detektion mittels DISCoVER zur Bestimmung der analytischen Empfindlichkeit. c: Faltungsänderung im DISCoVER-Signal relativ zu NTC bei SARS-CoV-2-positiven Speichelproben nach 5 Minuten der Cas13-Detektion. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung bei n = 20 biologischen Replikaten. d, Faltungsänderung im DISCoVER-Signal relativ zu NTC bei 30 negativen Speichelproben, die vor November 2019 gesammelt wurden, 5 Minuten nach der Cas13-Erkennung.

Als nächstes versuchten wir, die analytische Sensitivität und Spezifität für DISCoVER anhand von Speichelproben zu bestimmen (Food and Drug Administration, 2020). Zur Bestimmung der LOD wurden Virusbestände seriell in Medium verdünnt und mit qPCR mit umgekehrter Transkription (RT-qPCR) relativ zu einer aus synthetischer genomischer RNA erstellten Standardkurve quantifiziert. Diese bekannten Viruskonzentrationen wurden in negative Speichelproben gegeben, die vor November 2019 unter BSL3-Bedingungen gesammelt wurden, und durchliefen den DISCoVER-Workflow (Abb. 4b). Wir führten 20 DISCoVER-Replikate für eine Reihe von Viruskonzentrationen durch und ermittelten dabei 40 Kopien µl-1 des Virus in direkt lysiertem Speichel (Abb. 4c) als die niedrigste getestete Konzentration, bei der mindestens 19/20 Replikate amplifiziert wurden. Um die DISCoVER-Spezifität zu testen, wurden Speichelproben von 30 verschiedenen SARS-CoV-2-negativen Personen ohne falsch positives Signal getestet (Abb. 4d). Die Zugabe von synthetischer RNA für Influenza A H1N1 und H3N2, Influenza B und menschliches Coronavirus OC43 hemmte weder den Nachweis von SARS-CoV-2 noch führte sie zu einem unspezifischen Nachweis, was die Spezifität dieses Tests weiter validierte (ergänzende Abbildung 4a). . Darüber hinaus haben wir DISCoVER für mehrere besorgniserregende SARS-CoV-2-Varianten validiert, einschließlich der hoch übertragbaren B.1.1.7-Variante36 (ergänzende Abbildung 4b).

In Point-of-Care-Umgebungen würden Probeninaktivierung und -lyse idealerweise durch eine interne Prozesskontrolle bestätigt (Abb. 5a). Dies ist besonders wichtig für das speichelbasierte Populationsscreening, da die Proben einiger Personen eine hohe Viskosität oder Mucin-Gel-Anteile aufweisen können. Gemäß den Richtlinien der Food and Drug Administration ist eine positive interne Prozesskontrolle erforderlich, um festzustellen, ob eine Probe SARS-CoV-2-negativ ist, und um gleichzeitig die ordnungsgemäße Probenentnahme, Nukleinsäureextraktion, Testeinrichtung und Reagenzienfunktion anzuzeigen („CDC 2019- nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel – Gebrauchsanweisung“; https://www.fda.gov/media/134922/download). Wenn die interne Prozesskontrolle in einer klinischen Probe negativ ist, sollte das Ergebnis als ungültig betrachtet werden, es sei denn, SARS-CoV-2 wird nachgewiesen. In diesem Fall gilt die Probe als positiv. Um dies zu erreichen, haben wir die Amplifikation gemultiplext, indem wir sowohl N-Gen- als auch menschliche RNase-P-Gen-Primer in den rLAMP-Schritt eingefügt haben. Der anschließende Cas13-Nachweis von RNase P in Speichelproben erreichte die Sättigung innerhalb von 5 Minuten (Abb. 5b).

a, Schematische Darstellung des rLAMP-Multiplexings mit Primersätzen für SARS-CoV-2 (N-Gen) und humaner interner Kontrolle (RNase P). b, DISCoVER-Signal von SARS-CoV-2-positiven Speichelproben nach Multiplex-rLAMP. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung mit n = 3 technischen Replikaten. c, Faltungsänderung im DISCoVER-Signal relativ zu NTC bei 30 negativen klinischen Nasenproben nach 5 Minuten der Cas13-Erkennung. d, fache Änderung des DISCoVER-Signals relativ zu NTC bei 33 positiven klinischen Nasenproben nach 5 Minuten der Cas13-Erkennung.

Quelldaten

Als nächstes validierten wir DISCoVER anhand der Gesamt-RNA, die aus Atemwegsabstrichproben von Patienten extrahiert wurde. Übrig gebliebene RNA von 30 negativen Proben und 33 positiven Proben (Ct-Werte 13–35), die zuvor mittels RT-qPCR in einem CLIA-Testlabor37 getestet wurden, wurden als Input für den DISCoVER-Tischtest verwendet. (Abb. 5c,d). Wir konnten 30 von 30 negativen Proben innerhalb von 5 Minuten nach der Cas13-Erkennung korrekt identifizieren: In diesen Proben wurde kein N-Gen nachgewiesen, während das RNase-P-Signal robust nachgewiesen wurde. Wichtig ist, dass wir das N-Gen im gleichen Zeitraum in 31 von 33 positiven Proben nachgewiesen haben. Bei den beiden falsch negativen Proben wurde RNaseP nachgewiesen, das N-Gen jedoch nicht, was auf einen Unterschied in der LOD zwischen den beiden Tests schließen lässt. Auf der Grundlage des klinischen Probendatensatzes berichten wir, dass die Sensitivität von DISCoVER auf extrahierte RNA 93,9 % bei 100 % Spezifität beträgt. Darüber hinaus beobachten wir einen PPV von 100 %, mit einem Kapitalwert von 93,75 %.

Schließlich haben wir ein kompaktes und tragbares Mikrofluidikgerät entwickelt, um den Assay in einer Umgebung durchzuführen, die zu Point-of-Care-Anwendungen führt. Die Chemie wurde so angepasst, dass sie auf einer schwerkraftbetriebenen Mikrofluidikkartusche mit temperaturkontrollierten Reaktions- und Detektionskammern läuft (Abb. 6a). Das Gerät enthält Luftverdrängungspumpen für den kontrollierten Flüssigkeitsfluss, eine Widerstandsheizung für die rLAMP-Kammer und einen thermoelektrischen Kühler/Heizer (TEC) für die Kühlung und Heizung der Cas13-Kammer (Abb. 6b). Die Fluoreszenzdetektion des Assays wurde mit einem kompakten, kundenspezifischen Detektor zur Echtzeit-Probenauslesung durchgeführt.

a, Links: Abbildung des letzten Instruments, in das die Kartusche eingesetzt wird. Der Einschub zeigt ein Bild der gesamten mikrofluidischen schwerkraftbetriebenen Kartusche. Rechts: Bilder der Probendosier- und rLAMP-Reaktionskammer (1), der rLAMP-Dosier- und Cas13-Mischkammer (2) und der Detektionskammer (3). b, Abbildung von vorne (links) und hinten (rechts) der Instrumentenkomponenten, einschließlich Erkennungssystem, Heizungen, luftbetriebenen Ventilen und mechanischen Ventilen. c, Schematische Darstellung der Patronenfunktion. Die Reaktion kann in vier Schritte unterteilt werden: Speicheldosierung (1), Amplifikationsreaktion (2), Nachamplifikationsdosierung + Cas13-Mischung (3) und Cas13-Reaktion in Detektionskammern (4). Die auf der Kartusche gespeicherten Reagenzien werden durch eine proprietäre hydrophobe Lösung getrennt, um einen vorzeitigen Beginn der Reaktionen zu vermeiden. Nach der LAMP-Reaktion kann die Probe in zwei Reaktionen aufgeteilt werden: Der linke Teil der Kartusche setzt die Probe N-Gen-crRNA aus (Schritt 3a), während die rechte Seite der Kartusche als interne Kontrolle nur mit RNase P-crRNA fungiert (Schritt 3b). Speichelproben durchliefen nur Schritt 3a, während klinische Proben die Schritte 3a und 3b durchliefen.

Für den Nachweis positiver oder negativer Speichelproben wurde eine Mikrofluidikkartusche entwickelt (Abb. 6c). In der ersten Iteration des Kartuschen-Assay-Designs wird eine inaktivierte (75 °C für 30 Minuten) positive kommerzielle Speichelprobe auf die Kartusche geladen und aktiv in die rLAMP-Kammer dosiert, wo sie mit N-Gen-Primern und dem rLAMP-Master-Mix gemischt wird. Die Lösung wird dann 30 Minuten lang auf 65 °C erhitzt, während die Cas13-Reagenzien mit dem TEC bei 25 °C gehalten werden. Am Ende der rLAMP-Reaktion öffnet sich das aktive Ventil unter der Kammer und ermöglicht den schwerkraftunterstützten Fluss von 4 μl der verstärkten Lösung in einen Dosierkanal. Nur der linke Kanal (Abb. 6c, Schritt 3a) war offen, sodass Cas13-Reagenzien und ihre auf das N-Gen gerichtete CRISPR-RNA (crRNA) durch den Dosierkanal in die Mischkammer gedrückt werden konnten, wo sie dann auf 37 ° erhitzt wurden C für 10 Min. Der rechte Kanal (Abb. 6c, Schritt 3b) wurde in der späteren Version der Patrone hinzugefügt. Mit der rLAMP-Lösung vermischtes Cas13 wurde in die Detektionskammer gesaugt und die Reaktion wurde mit einem Fluoreszenzdetektor überwacht. Die mikrofluidischen Betätigungszeiten betrugen während des gesamten On-Board-Assays etwa 8 Minuten. Wir demonstrieren den Nachweis einer Verdünnungsreihe von 200 bis 40 Kopien μl-1 genomischer SARS-CoV-2-RNA im gesamten Speichel mit einer Reaktionszeit von Anfang bis Ende (einschließlich Inaktivierungsschritt) von 78 Minuten (Abb. 7a). . Dies weist auf die potenzielle Point-of-Care-Anwendung dieses Mikrofluidiksystems hin, bei der DISCoVER SARS-CoV-2-RNA aus Speichelproben mit attomolarer Empfindlichkeit nachweisen kann.

a, Wärmekarte, die die fache Änderung des DISCoVER-Signals bei negativen und positiven Speichelproben im Verhältnis zum NTC darstellt. b, Wärmekarte, die die Faltungsveränderung in SARS-CoV-2-RNA-positiven und -negativen klinischen Proben aus Nasenabstrichen im Vergleich zu NTC darstellt. Die Ct-Werte für das N-Gen-Target durch qPCR-Nachweis sind auf der Heatmap-Achse aufgeführt. c, Diagramm, das die Rohfluoreszenz über die Zeit für beide Detektionskammern (blau für RNase P und rot für N-Gen) in NTC- (links), negativen (Mitte) und positiven (rechts, Ct 16) Proben zeigt. In jedes Diagramm sind Fluoreszenzbilder der Detektionskammer für NTC-Kartuschen (keine Virusprobe) sowie negative und positive klinische Proben eingefügt (mit RT-qPCR-Ct im Bereich von 16 bis 21). Die linke Detektionskammer ist spezifisch für den N-Gen-Nachweis, während die rechte Kammer spezifisch für RNase P ist. d, Ergebnisse von DISCoVER an Bord von zehn klinischen Speichelproben und drei negativen klinischen Speichelproben. Die Faltzunahme wird über eine leere Patrone berechnet. Ein zweifacher Fluoreszenzanstieg gegenüber leeren Patronen nach 50 Minuten war das experimentell ermittelte Kriterium für positive Ergebnisse. Proben, deren Wert nach 5 Minuten unter diesem Schwellenwert lag, wurden als negativ eingestuft.

Quelldaten

Als nächstes optimierten wir das Kartuschendesign, indem wir den Nachweis von N-Gen und RNase P während des rLAMP-Schritts multiplexten, um eine interne Prozesskontrolle hinzuzufügen (Schritt 3b in Abb. 6c). Multiplex-rLAMP wurde durchgeführt, bevor die amplifizierte Reaktion in zwei Cas13-Nachweiskammern aufgeteilt wurde, die jeweils eine einzelne crRNA enthielten, die entweder auf das N-Gen (linke Kammer, Schritt 3a) oder das RNase P-rLAMP-Amplifikat (rechte Kammer, Schritt 3b) abzielte (Abb. 6c). .

Anschließend haben wir die RNAs von drei negativen und drei positiven (Ct 16–21) respiratorischen klinischen Proben auf dem vollständigen DISCoVER-Gerät erneut getestet (Abb. 7b). Wir haben SARS-CoV-2 in allen drei positiven Proben korrekt nachgewiesen (Abb. 7c, unten) und bei allen drei negativen Proben nur das RNase-P-Signal nachgewiesen (Abb. 7c, Mitte). Zunächst wurden NTC-Kartuschen ohne Virusprobe verwendet, um die Grundlinienfluoreszenz zu bestimmen, sodass wir die fache Änderung einer positiven Probe gegenüber der Grundlinie bestimmen konnten (Abb. 7c, oben).

Um die Robustheit und Reproduzierbarkeit dieses Systems zu demonstrieren, haben wir zusätzlich 25 künstliche Proben auf dem DISCoVER-Gerät laufen lassen (20 künstliche positive Proben mit 500 Kopien μl–1 und 5 erwartete negative Proben mit 0 Kopien μl–1) (Erweiterte Daten, Abb. 2). ). Um eine robuste Prozesskontrolle über künstlich hergestellte Proben aus kommerziellen Speichelproben zu ermöglichen, haben wir die Multiplex-Amplifikation Off-Board und On-Board optimiert, indem wir im rLAMP-Schritt menschliche ACTB (β-Actin)-Genprimer anstelle von RNase P-Primern verwendet haben (Extended Data Abb . 2a,b). Für die künstlich hergestellten Speichelproben konnten wir den Inaktivierungsschritt bei 95 °C auf 5 Minuten verkürzen und eine vereinfachte Kartusche ohne Dosierschritt entwerfen (Extended Data Abb. 2c), um die gesamte Testzeit einschließlich Probe auf etwa 50 Minuten zu verkürzen Inaktivierung38 und mikrofluidische Aktivierungszeit. Proben mit einem On-Board-Signal, das sich mindestens zweifach gegenüber dem Hintergrund änderte, wurden als positiv bezeichnet, und Proben, die diesen Schwellenwert nicht erreichten, wurden als negativ angesehen (Erweiterte Daten, Abb. 2d). Anschließend validierten wir das Gerät anhand von zehn natürlichen, vor Ort gesammelten klinischen Speichelproben von Personen, die mittels RT-qPCR positiv auf COVID-19 getestet wurden, und drei natürlichen klinischen Speichelproben von Personen, die negativ getestet wurden (Abb. 7d und Ergänzungstabelle 5). Aufgrund von Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien für vor Ort gesammelte Speichelproben wurde die Probeninaktivierungszeit auf 20 Minuten bei 95 °C verlängert, wodurch sich die Gesamttestzeit für diese Validierung auf 63 Minuten erhöhte. Alle 13 vor Ort gesammelten klinischen Speichelproben und 25 künstlich hergestellten kommerziellen Proben wurden mit attomolarer Empfindlichkeit auf einem vollautomatischen Mikrofluidiksystem mit minimaler Benutzerinteraktion korrekt erkannt (Zusatzvideo).

Wir haben einen RNA-Extraktions-freien Nachweis-Workflow entwickelt, der den attomolaren Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in nicht extrahiertem Speichel demonstriert. Der DISCoVER-Assay kombiniert einen 30-minütigen rLAMP-Schritt, gefolgt von T7-Transkription und Cas13-basierter Detektion, wodurch ein Schnelltestprotokoll mit attomolarer Empfindlichkeit und hoher Spezifität entsteht. Da jedes modifizierte LAMP-Produkt als Substrat für die Transkriptionsinitiierung dienen kann, wird das maximale Cas13-Signal aufgrund der schnellen Erzeugung nanomolarer Substratkonzentrationen in weniger als 5 Minuten erreicht (ergänzende Abbildung 3). Die Kombination empfindlicher Nukleinsäureamplifikation mit CRISPR-vermittelter Spezifität und Programmierbarkeit bietet das Potenzial, eine flexible Diagnostik für den Nachweis vielfältiger Krankheitserreger zu ermöglichen.

Wir haben das DISCoVER-System zunächst an unextrahiertem Speichel demonstriert, mit dem Ziel, die wichtigsten Schritte für eine Point-of-Care-Diagnose zu ermöglichen. Da ein speichelbasierter Test möglicherweise kein medizinisches Personal für die Probenentnahme erfordert, ist er NP-Tupfern vorzuziehen, und der erhöhte Komfort der Probenentnahme wird wahrscheinlich Anreize für die Compliance und die Verpflichtung des Patienten zu häufigen Tests bieten. Es hat sich auch gezeigt, dass Speichel eine zuverlässige Probenmatrix für asymptomatische Tests im Rahmen der Gemeinschaftsüberwachung ist, da Speichelproben vergleichbare Virustiter wie NP-Abstriche aufweisen11. Um die Probenahme-Lieferkette zu diversifizieren, kann DISCoVER auch auf andere Proben wie NP-Abstriche und selbst verabreichte Nasenabstriche angewendet werden.

Im Vergleich zu anderen CRISPR-Nachweismethoden wie DETECTR und STOPCovid V2 verwendet DISCoVER keinen Probenextraktions- oder Reinigungsschritt39,40, wodurch die Abhängigkeit von kommerziellen RNA-Extraktionskits entfällt und gleichzeitig eine vergleichbare Empfindlichkeit erhalten bleibt. Die hier verwendete direkte Lysemethode nutzt gängige Reagenzien für die chemische Reduktion und Ionenchelatbildung, die einfach, allgemein und kostengünstig erhältlich und bei Raumtemperatur stabil sind. DISCoVER behält die attomolare Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen CRISPR-basierten Nachweistests bei, die die Extraktion und Reinigung viraler RNA umfassen20,39,41.

Wir validieren außerdem die Fähigkeit von DISCoVER, mehrere Varianten von SARS-CoV-2 zu erkennen, insbesondere die besorgniserregende Variante B.1.1.7, die aufgrund ihrer potenziell erhöhten Übertragbarkeit von breitem medizinischem Interesse ist36. Durch die zusätzliche Entwicklung mutantenspezifischer DISCoVER-Sondensätze könnte es möglich sein, eine besorgniserregende Variante selektiver gegenüber einer anderen zu erkennen. Hier haben wir die Pan-SARS-CoV-2-Überwachung optimiert und Primer verwendet, die darauf ausgelegt sind, möglichst viele SARS-CoV-2-Varianten zu erkennen. Um die DISCoVER-Spezifität weiter zu testen, haben wir einen Test auf Kreuzerkennung viraler genomischer RNA von anderen häufigen Atemwegserregern durchgeführt, darunter Influenza A H1N1 und H3N2, Influenza B und das menschliche Coronavirus OC43. Wir haben keine erkennbare Auswirkung auf die Kinetik oder Spezifität von DISCoVER beobachtet.

Wir demonstrieren auch den Multiplex-SARS-CoV-2-Nachweis mit einer menschlichen internen Kontrolle während der DISCoVER-Amplifikationsphase. Dies könnte für die Mehrfarbendetektion erweitert werden, indem zusätzliche Cas-Enzyme mit orthogonalen Spaltungsmotiven verwendet werden, die jeweils auf spezifische Reporter für unterschiedliche Fluoreszenzkanäle einwirken42. Multiplexing höherer Ordnung kann für Influenza-Typen A und B und andere häufige Atemwegsviren weiterentwickelt werden, deren Nachweis in einem einzigen Test wünschenswert wäre. Die inhärente Fähigkeit der Kernenzyme in DISCoVER, zwischen jeder RNA- und DNA-Sequenz umzuwandeln, bedeutet, dass jeder Krankheitserreger, der durch unser Protokoll inaktiviert und lysiert wird, nachgewiesen werden kann.

Wir validierten DISCoVER an 33 positiven und 30 negativen Patientenproben und berichteten über einen PPV von 100 % und einen NPV von 93,75 % für die aus Nasenabstrichen extrahierte Gesamt-RNA. Wir beobachten eine Spezifität von 100 % und eine Sensitivität von 93,9 % im Vergleich zu qPCR-Tests für Proben mit Ct-Werten zwischen 13 und 35. Schließlich demonstrieren wir die Integration von DISCoVER mit einem Mikrofluidiksystem und einem Detektionsgerät. Mit einfachen Heiz- und Kühlelementen und Luftverdrängungspumpen kann die schwerkraftbetriebene Mikrofluidikkartusche den DISCoVER-Arbeitsablauf sowohl an künstlichem positivem Speichel als auch an Patientenproben in <50 Minuten durchführen, einschließlich Inaktivierung, mit einer Echtzeit-Fluoreszenzanzeige. Die weitere Entwicklung und der Einsatz dieser Baugruppe zeigt Potenzial für ein Point-of-Care-System, das die häufige molekulare Diagnostik vor Ort erheblich erleichtern wird.

Für das Lachnospiraceae-Bakterium ND2006 Cas12a (LbCas12a) wurden crRNA und Aktivator-DNA über Integrated DNA Technologies (IDT) synthetisiert. Der Nachweis mit Cas12a wurde unter Verwendung von 1× NEB 2.1-Puffer (B7202S), 100 nM LbCas12a-Protein, 100 nM crRNA und unterschiedlichen Konzentrationen (100 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM und 10 pM) doppelsträngiger DNA durchgeführt Aktivator und 200 nM DNaseAlert (IDT). LbCas12a und crRNA wurden in 10-facher Konzentration im Molverhältnis 1:1 vorgemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie der Reaktion hinzugefügt wurden. Die Reaktion wurde auf 37 °C erhitzt und in 15-s-Intervallen mit einem Multimode-Mikroplattenlesegerät Tecan Spark detektiert. Zur Hintergrundsubtraktion wurden die Fluoreszenzwerte der Reaktion ohne Aktivator zu jedem Zeitpunkt von den Fluoreszenzwerten der Probenreaktionen subtrahiert. Die maximale Fluoreszenz wurde durch Mischen von DNase I und 200 nM DNaseAlert mit 1× NEB 2.1-Puffer erreicht. Dieser gesättigte maximale Fluoreszenzwert wurde in zwei Hälften geteilt; Die Zeit bis zum Erreichen dieser halbmaximalen Fluoreszenz wurde für jede Aktivatorkonzentration berechnet.

Für Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) wurden die crRNA und der Aktivator kommerziell von Synthego synthetisiert. Der Nachweis mit Cas13a wurde unter Verwendung von 1× Cas13-Reaktionspuffer, 100 nM LbuCas13a-Protein, 100 nM crRNA, unterschiedlichen Konzentrationen (100 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM und 10 pM) einzelsträngiger RNA und 200 nM durchgeführt Cas13-Reporter (IDT). LbuCas13a und crRNA wurden in 10-facher Konzentration im Verhältnis 1:1 vorgemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie der Reaktion hinzugefügt wurden. Der Rest der Reaktion und die Zeit bis zur Halbmaximumfluoreszenz wurden wie oben beschrieben durchgeführt oder analysiert. Die maximale Fluoreszenz wurde durch Mischen von RNase A und 200 nM Cas13-Reporter mit 1x Puffer erreicht. Der 5× Cas13-Reaktionspuffer (pH 6,8) besteht aus 100 mM HEPES-Na pH 6,8 (Sigma), 250 mM KCl (Sigma), 25 mM MgCl2 (Sigma) und 25 % Glycerin (Thermo Fisher).

Die Expression und Reinigung von Leptotrichia buccalis Cas13a (LbuCas13a) wurde wie zuvor beschrieben24 mit Modifikationen durchgeführt, die hier zusammengefasst sind: His6-MBP-TEV-markiertes Cas13a wurde in Escherichia coli Rosetta2 (DE3) hergestellt, das in TB bei 37 °C gezüchtet wurde. Bei einer OD600 von 0,6–0,8 wurden die Kulturen 15 Minuten lang auf Eis gekühlt, bevor sie mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid induziert und über Nacht bei 16 °C exprimiert wurden. Zellpellets mit einer Größe von etwa 10 ml in einem 50-ml-Falcon-Röhrchen wurden in jeweils 100 ml Lysepuffer resuspendiert. Lösliches His6-MBP-TEV-Cas13a wurde durch Zentrifugation bei 15.000 g geklärt, dann auf eine 5-ml-HiTrap-NiNTA-Säule (GE Healthcare) geladen und über einen linearen Imidazol-Gradienten (0,01–0,3 M) mittels schneller Proteinflüssigkeitschromatographie (ÄKTA Pure) eluiert. . Nach Dialyse über Nacht und TEV-Verdau wurde LbuCas13a durch Ionenaustausch und Entfernung von MBP gereinigt (5 ml HiTrap SP, MBP-Falle HP, GE Healthcare). Schließlich wurde eine Größenausschlusschromatographie (S200 16/60, GE Healthcare) mit 1 mM TCEP als Ergänzung zum Gelfiltrationspuffer durchgeführt und die Peakfraktionen wurden gepoolt, konzentriert und in PCR-Röhrchen aliquotiert und dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Die Expression und Reinigung des Lachnospiraceae-Bakteriums ND2006 Cas12a (LbCas12a) wurde wie zuvor beschrieben mit der Zugabe von 1 mM EDTA zum Dialysepuffer durchgeführt, um eine Proteinausfällung während der His-Tag-Entfernung durch TEV-Protease zu verhindern43.

LAMP- und rLAMP-DNA-Amplifikationsreaktionen wurden mit 2× LAMP-Mastermix (NEB, E1700), 0,4 µl LAMP-Farbstoff (NEB, E1700), 2 µl 10× Primer-Mix (IDT; 16 µM FIP/BIP, 4 µM FLoop/ BLoop und 2 μM F3/B3) und 7,6 μl Probe. Acht Mikroliter Probe wurden Reaktionen zugesetzt, bei denen kein Farbstoff zugesetzt wurde. Für multiplexiertes LAMP wurde 1 μl RNase P-Primer mit T7-Promotor auf dem BIP 5'-Primer zu der 20 μl-Reaktion gegeben. Der Nachweis wurde 30–60 Minuten lang bei 65 °C in einem CFX96 Touch Real-Time PCR-Gerät (Bio-Rad) oder einem QuantStudio 3 Real-Time PCR-System (Thermo) durchgeführt. Die Zeit bis zum Erreichen des Schwellenwerts wurde im Analysemodus „Einzelschwellenwert“ berechnet. LOD für LAMP wurde als die Konzentration bestimmt, bei der bei mindestens 95 % der Proben eine Amplifikation beobachtet wurde. LAMP-Amplifikationsreaktionen für klinische Proben wurden mit 2× LAMP Mastermix, 2 µl 10× N-Gen-Primer-Mix, 1 µl RNase P-Primer-Mix und 5 µl Probe in einer 20 µl-Reaktion durchgeführt.

Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (Twist Bioscience, SKU 102024) wurde als Vorlage verwendet, um das Primer-Screening durchzuführen und LOD-Bereiche festzulegen. Das zu verwendende Template-Volumen und die endgültige Template-Konzentration in der Reaktion wurden auf der Grundlage der vom Anbieter angegebenen Anfangskonzentration von 106 Kopien µl−1 berechnet.

Der Restriktionsverdau von rLAMP-DNA-Produkten wurde an 3 µl amplifiziertem rLAMP-Produkt unter Verwendung von 2 µl AfeI (NEB R0652L), 2 µl 10× CutSmart-Puffer und 13 µl Wasser durchgeführt. Diese 20 µl der Reaktion wurden 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzt. Unverdaute und verdaute rLAMP-Produkte wurden mit 4 µl 1 U µl−1 RQ DNase I und 1 µl 10× Reaktionspuffer (Promega, M6101) behandelt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzt und 1 µl STOP-Lösung (Promega M6101) wurde zugegeben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 65 °C. rLAMP-Produkte wurden mit 15 % TBE-Harnstoff-Gelen (Thermo Fisher, EC68855BOX) analysiert.

SARS-CoV-2-negativer Speichel (Lee Biosolutions, 991-05-S-25) wurde verwendet, um die Kompatibilität des Speichels mit dem DISCoVER-Workflow zu überprüfen. Alle Speichelproben wurden laut Anbieter vor November 2019 entnommen. Wenn virale synthetische RNA verwendet wurde, wurde Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (SARS-CoV-2-Isolat Wuhan-Hu-1) in den kommerziellen Speichel gegeben und als Vorlage für Scheinproben verwendet. Zur LOD-Bestimmung wurden SARS-CoV-2-Virussamen in einen negativen Speichelhintergrund unter BSL-3-Eindämmung versetzt und als Vorlage für Scheinproben verwendet.

Handelsüblicher Speichel wurde mit Lysereagenzien gemischt und unter Verwendung eines Heizblocks 30 Minuten lang auf 75 °C oder 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Twist Synthetic RNA wurde nach Abschluss der Hitzeinaktivierung des Speichels hinzugefügt. Virales Saatgut wurde vor der Hitzeinaktivierung in der BSL3-Anlage mit Speichel versetzt. Inaktivierungsreagenz 1 war 2,5 mM TCEP/1 mM EDTA in 1-facher Konzentration beim Mischen mit Speichel. Inaktivierungsreagenz 2 war 100 mM TCEP/1 mM EDTA in 1-facher Konzentration beim Mischen mit Speichel. Das inaktivierende Reagenz 3 war Quickextract DNA (Lucigen QE09050), das inaktivierende Reagenz 4 war Quickextract RNA (Lucigen QER090150) und das inaktivierende Reagenz 5 war RNA/DNAShield (Zymo 76020-420).

Vor Ort gesammelte, klinische Speichelproben aus der Salinas Valley Farmworkers-Studie wurden in einem auf 95 °C eingestellten Perlenbad 20 Minuten lang lysiert. Laut Ref. 37, die Inaktivierungszeit, die für künstlich hergestellte Proben aus kommerziellem Speichel verwendet wird, kann hier ebenfalls verwendet werden, wir konnten dies jedoch aufgrund von Einschränkungen, die von der UC Berkeley Environment, Health, and Safety (EH&S) für klinische Probeninaktivierungsprotokolle auferlegt wurden, nicht testen.

Zur Bestimmung der LOD wurden einmal in Vero-E6-Zellen (ATCC) amplifizierte Virusbestände von SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020; BEI Resources, NR-52281) in Medium (DMEM + 10 % FBS + 1 % Penicillin) verdünnt –Streptomycin), um verschiedene Konzentrationen zu erhalten, mit Speichel versetzt und durch einmalige Zugabe eines Inaktivierungsreagenzes mit niedrigem TCEP/EDTA-Gehalt und Erhitzen der Proben auf 75 °C inaktiviert. Die Virusverdünnungen im Medium wurden durch 30-minütiges Erhitzen auf 75 °C inaktiviert, um den EH&S-Anforderungen (UC Berkeley) zu entsprechen, und RT-qPCR wurde mit dem Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB E3006) und dem E-Gen durchgeführt -Targeting-Primer zur Bestimmung der Endkonzentration viraler RNA. Synthetische genomische RNA-Fragmente (Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2) wurden verwendet, um eine Standardkurve für die Berechnungen zu erhalten. Die Scheinprobe wurde als positiv erkannt, wenn die Faltungsänderung (Verhältnis des Fluoreszenzwerts der Probe zum Fluoreszenzwert der Kontrolle ohne Vorlage) innerhalb von 5 Minuten größer als 2 ist. Der LOD für die Scheinproben wurde als die Konzentration bestimmt, bei der bei mindestens 95 % der Proben ein Nachweis erfolgte.

Aus Atemwegsabstrichproben extrahierte RNA wurde vom klinischen Labor des Innovative Genomics Institute (IGI) bezogen. Diese Proben wurden für SARS-CoV-2-Diagnosezwecke entnommen und zuvor mit ihnen der LuNER-Assay37 durchgeführt. Kurz gesagt wurden von einem Gesundheitsdienstleister Atemwegsproben von Patienten (aus dem Oropharynx, den vorderen Nasenlöchern oder der mittleren Nasenmuschel) entnommen. Die RNA wurde im IGI Clinical Laboratory mithilfe eines automatisierten Arbeitsablaufs auf Basis des MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher A42352) extrahiert und anschließend auf N- und E-Gene sowie RNaseP untersucht. Für die hier beschriebenen Experimente wurden die Proben deidentifiziert und extrahierte RNA mit klinischen Ct-Werten versehen.

Wir haben festgestellt, dass ein zweifacher Wechsel zwischen einem positiven Signal und einer negativen Kontrolle 5 Minuten nach Beginn der Cas13-Erkennung ausreicht, um künstlich positive und erwartete negative Speichelproben zu unterscheiden. Dieser experimentell ermittelte Schwellenwert wurde zur Unterscheidung von positiven und negativen Ergebnissen in klinischen Proben verwendet. Eine Probe gilt als positiv, wenn die Faltungsänderung sowohl des N-Gens als auch des Prozesskontrollsignals innerhalb von 5 Minuten mehr als das Zweifache beträgt. Eine Probe gilt als positiv, wenn das N-Gen innerhalb von 5 Minuten eine zweifache Veränderung zeigt, auch wenn die Prozesskontrolle keine zweifache Veränderung zeigt, da dies auf einen Verlust oder Abbau von menschlichem Zellmaterial im Speichel hinweisen könnte. Eine Probe gilt als negativ, wenn die Prozesskontrolle innerhalb von 5 Minuten eine >2-fache Veränderung zeigt, während kein N-Gen-Signal erscheint. Wenn sowohl das N-Gen als auch die Prozesskontrollfaltenänderung unter 2 liegen, gilt der Test als ungültig.

Bei der Entwicklung eines LbuCas13a-Leitfadens für SARS-CoV-2 wurden Sensitivität, Spezifität und vorhergesagte Sekundärstruktur priorisiert. Innerhalb der N-Set-1-Amplikonregion des SARS-CoV-2-Referenzgenoms (wuhCor1) wurden 26 mögliche Spacer mit 20 Nukleotiden identifiziert, die sowohl auf den Vorwärts- als auch auf den Rückwärtsstrang abzielen. Die Empfindlichkeit wurde bestimmt, indem die verfügbaren SARS-CoV-2-Genome von GISAID paarweise mit dem Referenzgenom abgeglichen wurden und die Anzahl der Fehlpaarungen zwischen der Probe und dem Referenzgenom für jeden Kandidaten-Spacer berechnet wurde. Anschließend wurde der Prozentsatz der von jedem Spacer erkannten SARS-CoV-2-Genome berechnet, der nicht mehr als eine Fehlpaarung aufwies, und Spacer, die weniger als 99 % der SARS-CoV-2-Genome übereinstimmten, wurden verworfen. Um die Spezifität sicherzustellen, wurden Kandidaten-Spacer, die als empfindlich eingestuft wurden, mit anderen Referenzgenomen menschlicher Coronaviren abgeglichen, insbesondere SARS, MERS, 229E, NL63, OC43 und HKU1. Spacer, die mit zwei oder weniger Fehlpaarungen zu einem dieser anderen Coronaviren passten, wurden verworfen. Die verbleibenden Spacer wurden ebenfalls am menschlichen Transkriptom ausgerichtet, was wiederum zwei Fehlpaarungen ermöglichte, und Spacer mit Ausrichtung wurden verworfen, um sicherzustellen, dass der Leitfaden nicht zu menschlichen Transkripten außerhalb des Ziels komplementär war. Um sicherzustellen, dass die Spacer-Sequenzen die Bindung von Cas13a an das direkte Wiederholungsgerüst ermöglichen, wurde die verkettete Wiederholungs- und Spacer-Sequenz mit RNAfold gefaltet und auf korrekte Haarnadelstruktur in der direkten Wiederholung und Einzelsträngigkeit in der Spacer-Sequenz untersucht. Von fünf möglichen SARS-CoV-2-Spacern, die unsere Sensitivitäts-, Spezifitäts- und Strukturkriterien erfüllten, wurde einer für die Verwendung als Leit-RNA ausgewählt. Ein Kontrollleitfaden, der auf RNase P abzielt, wurde nach denselben Kriterien ausgewählt, um eine Übereinstimmung von SARS-CoV-2- und menschlichen Transkripten zu vermeiden und eine ordnungsgemäße RNA-Struktur sicherzustellen. Im Validierungsexperiment (Abb. 7d und Erweiterte Daten, Abb. 2d) wurde die Multiplex-Amplifikation aufgrund der unterschiedlichen Speichelzusammensetzung zwischen kommerziellen und klinischen Proben Off-Board und On-Board durch die Verwendung menschlicher ACTB-Genprimer im rLAMP optimiert Schritt statt RNase P-Primer. ACTB-Guides wurden unter Verwendung derselben Pipeline wie N-Set 1 und RNase P ausgewählt.

Die Transkription wurde am amplifizierten rLAMP-Produkt unter Verwendung von 2 µl 1 mg ml−1 T7-Polymerase, 4 µl 100 mM NTP-Mischung (NEB N0450), 1 µl 200 mM DTT, 4 µl 5× Transkriptionspuffer, 2 µl … durchgeführt LAMP-Produkt und 7 µl Wasser. Diese 20 µl der Reaktion wurden 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzt. Der 5-fache Transkriptionspuffer besteht aus 150 mM Tris-Cl, pH 8,1 bei Raumtemperatur, 125 mM MgCl2, 0,05 % Triton X-100 (Sigma Aldrich, X100) und 10 mM Spermidin und wird bei –20 °C gelagert.

Der Cas13-Nachweis wurde als 20-µl-Reaktion unter Verwendung von 2 µl 1:100 verdünntem Transkriptionsprodukt von LAMP, 1 µl 5× Cas13-Reaktionspuffer, 2 µl 2 µM Cas13-Reporter, 2 µl 10× Ribonukleoprotein (RNP) und 13 µl durchgeführt 1× Cas13 Reaktionspuffer. Das 10-fache RNP wurde im Verhältnis 2:1 von Cas13:crRNA mit einer Endkonzentration von Cas13 von 20 nM hergestellt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor es der Reaktion hinzugefügt wurde. Diese 20-µl-Reaktion wurde auf 37 °C erhitzt und alle 30 s im TECAN Spark-Multimode-Mikroplattenlesegerät unter Verwendung des FAM-Kanals (Anregung 485 nm, Emission 535 nm) abgelesen.

Ein Eintopfverfahren für T7 und Cas13 wurde durchgeführt, indem 2 µl 1 mg ml−1 T7-Polymerase, 20 mM NTP-Gemisch, 10 mM DTT und 25 mM MgCl2 mit dem Cas13-Reaktionsgemisch kombiniert wurden. Zwei Mikroliter einer 1:100-Verdünnung des rLAMP-Produkts werden für 20 µl einer Eintopf-T7-Cas13-Reaktion verwendet. Zum Testen klinischer Proben werden 2 µl des 1× rLAMP-Produkts für 20 µl der Eintopf-T7-Cas13-Reaktion verwendet.

Synthetische virale RNA von Influenza A H1N1 (Twist Bioscience, SKU 103001), Influenza A H3N2 (Twist Bioscience, SKU 103002), Influenza B (Twist Bioscience, SKU 103003) und humanem Coronavirus OC32 (Twist Bioscience, SKU 103013) wurde inaktiviert Speichel (Lee Biosolutions, 991-05-S-25), mit und ohne Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2. rLAMP und Eintopf-T7-Transkription wie oben beschrieben wurden mit der N-Gen-crRNA durchgeführt.

Synthetische virale RNA der SARS-CoV-2-Variante B.1.1.7_710528 Control 14 (Twist Bioscience, SKU 103907) und der SARS-CoV-2-Variante B.1.1.7_601443 Control 15 (Twist Bioscience, SKU 103909) wurde in inaktivierten Speichel gegeben (Lee Biosolutions, 991-05-S-25). rLAMP und Eintopf-T7-Transkription wie oben beschrieben wurden mit der N-Gen-crRNA durchgeführt.

Ein Prototyp eines Instruments wurde von Wainamics Inc. entworfen und hergestellt. Das Instrument wurde speziell entwickelt, um die Machbarkeit des Systems zu demonstrieren, und verfügt über Funktionen, die einen einfachen Übergang zu einem herstellbaren Endverbrauchsinstrument ermöglichen würden. Eine Kombination aus handelsüblichen Komponenten, kundenspezifischen Komponenten (entworfen in SolidWorks), einer kundenspezifischen elektronischen Platine auf Basis eines Teensy 3.2-Mikrocontrollers und kundenspezifischer Software (in C geschrieben) wurde zusammengefügt, um einen Prototyp eines Instruments herzustellen. Das System sollte die Machbarkeit des Tests an Bord eines Prototyps eines thermoplastischen Geräts auf automatisierte Weise demonstrieren. Es wurde darauf geachtet, dass alle Designelemente auf gängige Massenfertigungsverfahren (z. B. Stanzen, Spritzgießen usw.) übertragbar sind.

Maßgeschneiderte Komponenten für das Prototypsystem wurden unter Verwendung gängiger Fertigungsmethoden hergestellt, darunter kommerzielle CNC-Bearbeitung (Computer Numerical Control, CNC) (Protolabs) von Aluminium- und Delrin-Komponenten, Fused Deposition Modeling (FDM), 3D-Druck (Dremel 3D45) und Stereolithographie (SLA) 3D Drucken (Formlabs Form3). Die verwendeten kommerziell erhältlichen Komponenten bestanden aus einer Norgren Kloehn V6c Spritzenpumpe mit Acht-Wege-Drehventil, Burkert Typ 6724 Drei-Wege-Magnetventilen und einem Temperaturregler von Laird Thermal Systems (TC-XX-PR-59), der eine TEC-Einheit von Marlow Industries steuerte (NL2064T-11AB), Steuerlüfter (Sunon Fans MF25101V1-1000U-A99) und Widerstandsheizpatronen (E3D, 12 V 40 W). Eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche auf einem Windows 10-PC ermöglichte es dem Benutzer, verschiedene Funktionen des Systems und der Kartusche zu steuern (d. h. Werte aktivieren, durch die Pumpe in die Kartusche verdrängte Luftvolumina steuern, Durchflussrate der verdrängten Luft steuern, Heizungstemperaturen steuern, usw). Die Skriptaufzeichnung ermöglichte es dem Benutzer, Gerätesystemskripte zu generieren und aufzuzeichnen, die zur automatischen Ausführung des Assays auf der Kartusche verwendet wurden, um Präzision und Konsistenz über alle Kartuschen-Assay-Läufe hinweg sicherzustellen.

Die Fluidbetätigungszeit wurde mit ca. 8 Minuten gemessen. Ein Schlüsselelement des Instruments ist ein maßgeschneiderter Verteiler, der im eingerasteten Zustand eine luftdichte Abdichtung zur Kunststoffkartusche bildet und so die Betätigung der Flüssigkeit in der Kartusche ermöglicht. Der Verteiler besteht aus sieben Anschlüssen, die über handelsübliche Ventile mit einer einzigen kundenspezifischen Spritzenpumpe verbunden sind. Die Anschlüsse werden durch in den Verteiler eingebaute Dichtungen an der Kartusche abgedichtet. Auf der Kunststoffkartusche ist jeder der Anschlüsse durch eine hydrophobe Membran vom Instrument isoliert, die den Durchgang von Luft, aber nicht von wässrigen Flüssigkeiten ermöglicht, und schützt so das Instrument vor Kontamination durch Testreagenzien oder Speichel. Wenn an den entsprechenden Verteileranschlüssen Überdruck oder Unterdruck angelegt wird, drückt oder zieht der Druck die Flüssigkeit in der Kartusche, je nach Durchflussrate und verdrängtem Luftvolumen. Die Ventile am Verteiler können auch in die Atmosphäre entlüften, sodass sich der Druck in der Kartusche ausgleichen kann. Das verdrängte Luftvolumen und die Pumpendurchflussraten werden angepasst, um eine gründliche Durchmischung der Reagenzien und einen minimalen Restvolumenverlust in den Kanälen zu ermöglichen.

Der gesamte Prototyp des Instruments ist etwa 12 Fuß breit, 18 Fuß tief und 12 Fuß hoch. Ein kundenspezifisches Instrument mit kundenspezifischer Elektronikplatine, kundenspezifischem Verteiler mit eingebauten Pumpen und Ventilen und kundenspezifischer Optik könnte nur 8‘ × 9‘ × 9‘ groß sein.

Die Widerstandsheizung und der TEC werden durch Messen der während des Betriebs im Inneren der Kartusche erreichten Temperaturen mithilfe einer Kartusche mit eingebetteten Thermoelementen eingestellt. Aufgrund von Wärmeübertragungsverlusten durch den Kunststoff ist die eingestellte Temperatur in der Regel 5–8 °C höher als die tatsächliche Temperatur im Inneren der Kartusche. Die Sollwerte für die Heizungen werden entsprechend mit passendem Offset eingestellt. Für die im klinischen Test verwendete Kartusche wurde die Heizung der LAMP-Reaktionskammer auf 72 °C und die Cas13-Detektionskammer auf 39 °C eingestellt.

Die Patrone wurde von Wainamics Inc. in SolidWorks entworfen. Prototypenpatronen wurden unter Berücksichtigung der Herstellbarkeit entwickelt und hergestellt. Lasergeschnittene Polymethylmethacrylatschichten unterschiedlicher Dicke (0,25–1 mm, Clarex Precision von Nitto Jushi Kogyo Co.) wurden mit PCR-kompatiblen Haftklebstoffen (Adhäsive Research AR90880 und AR92712) zusammenlaminiert, um die gewünschten Kanalgeometrien zu erreichen. Alle Kanalgeometrien wurden so konzipiert, dass sie leicht auf Massenfertigungstechniken wie Spritzguss und Rotationsstanzen übertragen und reproduziert werden können. Jede Schicht wurde mit einem CO2-Laser (BossLaser) geschnitten und die gesamte Kartusche wurde von Wainamics Inc. von Hand zusammengebaut. Hydrophobe Membranen (Sterlitech PTFE029025) wurden verwendet, um den Durchgang von Gas und nicht von Flüssigkeit zu ermöglichen und eine Kontamination des Prototypinstruments zu verhindern. Zur Herstellung betätigbarer Patronenventile zur Steuerung des Lösungsflusses wurde eine Silikonkautschukplatte (McMaster-Carr 1460N11) verwendet.

Zur Temperaturkalibrierung wurde eine Kartusche mit Thermoelementen (Omega Engineering) verwendet, die in thermisches Epoxidharz (McMaster-Carr, Nr. 7548A11) eingebettet waren. Die Leistungseinstellungen für Widerstandsheizungen und TEC wurden manuell anhand der Messwerte der Temperaturkalibrierungspatrone angepasst. Ein Temperaturkalibrierungslauf unter Verwendung der Rückmeldung einer thermischen Testkartusche ist in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt. Die Differenz zwischen der eingestellten Temperatur und der aufgezeichneten Temperatur nimmt bei höheren Temperaturen zu (nicht stabil). Daher ist es wichtig, das System zu kalibrieren, indem die eingestellte Temperatur überprüft wird, die erforderlich ist, um mit der erforderlichen Reaktionstemperatur übereinzustimmen.

Aufgrund von Reagenzienverlusten entlang der Kanäle wurden mehrere Kalibrierungsexperimente durchgeführt, um korrekte Reaktionsvolumina sicherzustellen (Ergänzungstabelle 3). Um den Volumenverlust zwischen dem „Startreservoir“ und der „Zielkammer“ zu messen, lautete das Versuchsprotokoll wie folgt: Ein bestimmtes Volumen an Fluoreszenzfarbstoff wurde in das Startreservoir geladen. Andererseits wurde eine bekannte Menge PBS mit 0,1 % Tween-20 in die „Ziel“-Kammer gegeben. Die experimentelle Fluidsequenz wurde durchgeführt, um den Farbstoff vom Reservoir in die Kammer fließen zu lassen. Nach dem Mischen wurde der verdünnte Farbstoff in der Kammer entnommen und seine Fluoreszenz mit einem Plattenlesegerät beurteilt. Auf dem Plattenlesegerät wurde gleichzeitig eine bekannte Titration des Farbstoffs ausgewertet, um die Kalibrierungskurve zu erstellen. Durch den Vergleich der aus der Kartusche entnommenen Farbstofffluoreszenz mit der Kalibrierungskurve konnten wir das Volumen des nach dem Fluidfluss zurückgewonnenen Farbstoffs und die in den Kanälen verlorene Farbstoffmenge ableiten. Für visuelle Fluidtestzwecke wurde eine Lösung von 100 nM Fluorescein (Sigma F6377) in 1 × PBS (Sigma P5493) mit 0,1 % Tween-20 (Sigma P1379) verwendet. FamT10 (IDT) in 1× PBS in verschiedenen Konzentrationen (0 nM bis 200 nm) wurde auch als Kalibratorlösung zur optischen Charakterisierung der Kartusche mit dem Detektionssystem verwendet.

Für die Abbildung der 40-μl-Probenvolumina in den Reaktionskammern benötigen wir ein relativ großes Sichtfeld (FOV) und eine bescheidene numerische Apertur (NA), die eine ausreichende Tiefenschärfe ermöglichen, ohne dass sich Bilder benachbarter Probenvertiefungen überlappen. Um dies in einem relativ kostengünstigen, kompakten Gerät zu erreichen, haben wir ein maßgeschneidertes System mit einem Paar Okularen (Edmund Optics, PN#66-208 und 66-210) entwickelt, was ein System mit einer NA von 0,09 und einem Sichtfelddurchmesser von 12,0 mm ergab. und Vergrößerung von 0,54 (gewählt, um die Sensorgröße der Thorlabs CS165MU1-Kamera an das Sichtfeld anzupassen; eine Probenahme bei ≥ Nyquist ist in dieser „Lichteimer“-Anwendung nicht erforderlich) (Ergänzungstabelle 4). Das Gesamtsystem ist kompakt und hat eine nominelle Spurlänge (Probe bis Kamera) von ca. 75 mm. Die Fluoreszenzfilter stammten von Chroma Technologies, ET470/40x, T495lpxr und ET535/70m, mit Anregung durch eine 965 mW, 470 nm LED (Thorlabs M470L4 angetrieben durch eine LEDD1B), was ein Maximum von ~225 mW in die Probe mit 12 mm Durchmesser lieferte FOV in einer Kohler-Geometrie mit Auflichtbeleuchtung. Die benutzerdefinierte Steuerung der Bildgebungshardware wurde in MATLAB (2020a) implementiert, wobei Thorlabs-Treiber und SDK (ThorCam) zur Steuerung der Kameraerfassung sowie serielle Kommunikation mit einem Arduino Bluefruit Feather-Board verwendet wurden, um die LED-Beleuchtung synchron mit der Kamerabilderfassung elektronisch auszulösen.

Die Multiplex-Kartusche verfügt über zwei Detektionskammern sowohl für das N-Gen als auch für die interne Kontrolle (RNaseP oder ACTB). Jeden Tag wurden vor der Durchführung des Assays mit Speichelproben eine mit Puffer gefüllte Leerkartusche sowie ein fluoreszierender Objektträger zur Korrektur des Hintergrunds bzw. der Gleichmäßigkeit der Beleuchtung abgebildet. In jeder Kammer wurde ein Bereich von Interesse (ROI) (150 × 400 Pixel) ausgewählt, und die leere Patrone wurde mit der gleichen Verstärkung und Belichtungszeit wie nachfolgende Experimente (2 dB und 150 ms) abgebildet. Die in jedem ROI gemessene Intensität wurde verwendet, um die Beispielbilder auf den Hintergrund zu normalisieren. Um die Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung zu korrigieren, wurde ein sauberer fluoreszierender Objektträger mit einer Verstärkung von 1 und einer Belichtung von 0,1 s abgebildet.

Sowohl die Hintergrund- als auch die Beleuchtungsgleichmäßigkeitskorrektur wurden mithilfe einer prospektiven Korrekturmethode44 durchgeführt. Kurz gesagt, die gemessenen Intensitäten für jedes Pixel x der Reaktionskammern stehen in Beziehung zu den tatsächlichen Intensitäten durch

wobei S ein linearer Skalierungsfaktor ist, der Bildverzerrungen aufgrund ungleichmäßiger Beleuchtung modelliert; B ist ein beleuchtungsabhängiges Hintergrundsignal, das Streuung und Hintergrundfluoreszenz aus den Probenkammern erklärt; und D ist ein additiver Nulllichtterm, der auf Kameraversatz und thermisches Rauschen mit festem Muster zurückzuführen ist. S, B und D wurden anhand von Bildern einer leeren Patrone und eines gleichmäßig fluoreszierenden Objektträgers bestimmt, die vor den Experimenten zu Beginn jedes Tages aufgenommen wurden. Experimentelle Bilder wurden gemäß Gleichung (1) verarbeitet, um korrigierte Probensignale abzurufen. Ein benutzerdefiniertes MATLAB-Skript wurde entwickelt, um die Beleuchtungs- und Erkennungsparameter Belichtungszeit, Verstärkung, Zeitintervall zwischen jeder Bildaufnahme und Gesamtzahl der aufzunehmenden Bilder zu steuern. Das Skript ermöglichte auch eine Live-Vorschau der Kartusche für eine optimale Ausrichtung und Auswahl der ROIs in den Reaktionskammern. Sobald der Assay gestartet wurde, löste das Skript auch automatisch die Bildaufnahme aus, während das Reaktionsgemisch in die Detektionskammern gepumpt wurde. Zu diesem Zeitpunkt zeigte das Skript zu jedem Zeitpunkt aufgenommene Bilder und die entsprechende mittlere Intensität der ausgewählten ROIs während des Experiments an.

Zunächst wurde ein Proof-of-Concept-System mit einem einzigen Reaktionskanal für den Nachweis positiver oder negativer N-Gene entwickelt. Kommerzieller Speichel (Lee Biosolutions, 991-05-S-25), versetzt mit Twist Synthetic SARS-CoV-2-RNA als positive Probe oder mit Wasser als negative Probe, wurde auf diesem System zur Instrumentenkalibrierung und schnellen Ergebnissen verwendet. Wie in Abb. 5 dargestellt, kann die Reaktion in vier Schritte unterteilt werden: (1) Speicheldosierung, (2) LAMP-Reaktion, (3) LAMP-Dosierung + Cas13/N-Gen-cRNA-Mischung und (4) Cas13-Reaktion in der Detektionskammer. Aufgrund von Reagenzienverlusten entlang der Kanäle wurden wie zuvor beschrieben mehrere Kalibrierungsexperimente durchgeführt, um korrekte Reaktionsvolumina sicherzustellen (wie hier angegeben; Ladevolumina finden Sie in der Ergänzungstabelle 3). Im Schritt 1 (oberer Teil) werden 16 μl Speichel aktiv per Spritzenpumpe in den Dosierkanal gesaugt. Die Spritzenpumpe kann dann den Primer (4 μl) und den Mastermix (20 μl), getrennt durch eine proprietäre hydrophobe Lösung (35 μl), aktiv durch den Dosierkanal in die LAMP-Mischkammer drücken. Weitere 50 μl Luft (bei 250 μl min−1) werden in die Kammer gedrückt, damit Luftblasen die LAMP-Reaktion durchmischen können (Schritt 2). Die Widerstandsheizung wird eingeschaltet, um die LAMP-Kammer 30 Minuten lang auf 65 °C zu erhitzen und die Reaktion ablaufen zu lassen. Gleichzeitig wird der TEC auf 25 °C eingestellt, um Cas13, T7-Mix, Fluoreszenzlöscher (FQ) und crRNA-Reagenzien bei Raumtemperatur zu halten. Nach der LAMP-Reaktion (Schritt 3) öffnet sich das untere aktive Ventil und die Schwerkraft lässt 4 μl des LAMP-Produkts durch den linken Dosierkanal fließen. Die Spritzenpumpe drückt aktiv 32 μl T7mix + FQ mit 4 μl Cas13 + N-Gen-cRNA durch die Dosierkanäle in die linke Mischkammer. Zum Mischen werden zusätzlich 50 μl Luft in beide Kammern gedrückt. In Schritt 4 werden 45 μl der Lösung aktiv in die jeweiligen Detektionskammern gesaugt. Der TEC wird auf 37 °C aufgedreht und alle 15 s werden 15–30 min lang Fluoreszenzbilder aufgenommen.

Nachdem die Kartusche positive und negative Speichelproben erkannt hatte, haben wir eine neue Kartusche für den klinischen Nachweis extrahierter RNA entwickelt. Bei diesen Proben handelte es sich um übrig gebliebene klinisch extrahierte Proben aus dem Testlabor der Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA). Da wir nur auf 5 μl pro klinischer Probe zugreifen konnten, wurde die Speicheldosierflüssigkeit (Schritt 1 in Abb. 5c) nicht verwendet. Stattdessen wurde die klinische Probe direkt in die LAMP-Kammer geladen. Die Reaktion kann in die drei folgenden Schritte von Abb. 5c unterteilt werden: (2) LAMP-Reaktion, (3) LAMP-Dosierung + Cas13/crRNA-Mischung und (4) Cas13-Reaktion in Detektionskammern. Wir haben auch Schritt 3 und Schritt 4 gemultiplext, sodass der linke Teil der Kartusche die Probe N-Gen-crRNA aussetzt (Schritt 3a), während die rechte Seite der Kartusche als interne Kontrolle mit RNase P-crRNA fungiert (Schritt 3b). zeigen, dass in der Probe genügend Zellmaterial vorhanden war. Nachfolgend berichten wir über Reaktionsvolumina; Die Ladevolumina finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. In Schritt 2 werden die 5 μl der klinischen Probe direkt in die LAMP-Kammer geladen. Die Spritzenpumpe kann dann den Primer (4 μl) und den Mastermix (20 μl), getrennt über eine proprietäre hydrophobe Lösung (35 μl), aktiv in die LAMP-Mischkammer drücken. Weitere 50 μl Luft werden in die Kammer gedrückt, damit Luftblasen die LAMP-Reaktion durchmischen können. Die Widerstandsheizung wird eingeschaltet, um die LAMP-Kammer 30 Minuten lang auf 65 °C zu erhitzen und die Reaktion ablaufen zu lassen. Gleichzeitig wird der TEC auf 25 °C eingestellt, um Cas13- und crRNA-Reagenzien auf Raumtemperatur zu halten. Schritt 3 teilt die LAMP-Probe in zwei Reaktionen auf: Der linke Teil der Kartusche setzt die Probe N-Gen-crRNA aus (Schritt 3a), während die rechte Seite der Kartusche als interne Kontrolle nur mit RNase P-crRNA fungiert (Schritt 3b). ). Nach der LAMP-Reaktion öffnen sich die beiden unteren aktiven Ventile und die Schwerkraft treibt 4 μl des LAMP-Produkts dazu, durch den linken und rechten passiven Dosierkanal zu fließen. Die Spritzenpumpe drückt aktiv 32 μl T7-Mix + FQ mit 4 μl Cas13 + crRNA (N-Gen im linken Reservoir und RNase P im rechten Reservoir) durch die Dosierkanäle in die jeweilige N-Gen- (links) und RNase P-Kammer (rechts). Zum Mischen werden zusätzlich 50 μl Luft in beide Kammern gedrückt. Zu diesem Zeitpunkt werden 45 μl der Lösung aktiv in die jeweiligen Detektionskammern gesaugt (Schritt 4). In der linken Kammer wird das LAMP-Produkt mit Cas13 und dem N-Gen gemischt, während in der rechten Kammer, der internen Kontrolle, LAMP mit Cas13 und RNase P-crRNA gemischt wird. Der TEC wird auf 37 °C aufgedreht und alle 15 s werden 15–30 min lang Fluoreszenzbilder aufgenommen.

Aufgrund der Schwierigkeit, auf eine große Anzahl klinischer Proben zuzugreifen, haben wir die Robustheit des Systems demonstriert, indem wir Speichel von verschiedenen Personen untersuchten (Lee Biosciences), wobei positive Proben durch Dotieren der Speichelmatrix mit Twist Synthetic SARS-CoV-2-RNA erzeugt wurden. Aufgrund der unterschiedlichen Speichelzusammensetzung der kommerziellen Proben haben wir alternative Prozesskontrollen untersucht (Extended Data Abb. 2a), um das variable RNase P-Signal zu berücksichtigen. Zunächst testeten wir systematisch die Insertion von T7-Promotorsequenzen in verschiedene Regionen von LAMP-Primern für ACTB, sowohl an kommerziellem Speichel als auch an RNA-Extrakt aus HEK 293FT-Zellen (Extended Data, Abb. 2b) und führten ein kleines Führungsscreening durch, um es in das zu integrieren DISCoVER-Pipeline (Extended Data Abb. 2c). Aufgrund der geringeren N-Gensignale in ersten Experimenten im Vergleich zu ACTB haben wir die Multiplex-Amplifikation so optimiert, dass sie aus einer Reaktion mit einem Verhältnis von N-Gen zu ACTB-Primer von 2:1 und der Zugabe zusätzlicher Bst 2.0-Polymerase besteht. Anschließend untersuchten wir 25 einzelne Speichelproben, d. h. 20 Proben als künstlich positive Proben, die genomische SARS-CoV-2-RNA enthielten, und 5 negative Proben (Extended Data Abb. 2d), um die Reproduzierbarkeit und Robustheit dieses Arbeitsablaufs zu demonstrieren.

Das Design der Kartusche wurde vereinfacht, um ein kompakteres Design sowie eine verbesserte Misch- und Volumengenauigkeit zu ermöglichen (Erweiterte Daten, Abb. 2d). Die Reaktion kann in die folgenden Schritte unterteilt werden: (1) LAMP-Reaktion, (2) LAMP-Dosierung + Cas13/crRNA-Mischung und (3) Cas13-Reaktion in Detektionskammern. Schritt 2 und Schritt 3 wurden gemultiplext, sodass der linke Teil der Kartusche die Probe der N-Gen-cRNA aussetzt (Schritt 2a), während die rechte Seite der Kartusche als interne Kontrolle mit ACTB-crRNA fungiert (Schritt 2b), um dies zu zeigen Es war ausreichend Zellmaterial in der Probe vorhanden. In Schritt 1 werden 18 μl Speichelprobe direkt in die Probenkammer geladen. Die Spritzenpumpe könnte eine proprietäre hydrophobe Lösung (30 μl) sowie den Primer (10 μl) und den Mastermix (40 μl), getrennt durch eine weitere hydrophobe Lösung (15 μl), aktiv in die LAMP-Mischkammer drücken. Weitere 50 μl Luft werden in die Kammer gedrückt, damit Luftblasen die LAMP-Reaktion durchmischen können. Die Widerstandsheizung wird eingeschaltet, um die LAMP-Kammer 45 Minuten lang auf 63 °C zu erhitzen und die Reaktion ablaufen zu lassen. Alle 15 Minuten wird etwas Luft durchgedrückt, um die Lösung zu vermischen und das Reaktionsergebnis zu verbessern. Gleichzeitig wird der TEC auf 25 °C eingestellt, um Cas13- und crRNA-Reagenzien auf Raumtemperatur zu halten. Schritt 2 teilt die LAMP-Probe in zwei Reaktionen auf: Der linke Teil der Kartusche setzt die Probe der N-Gen-cRNA aus (Schritt 2a), während die rechte Seite der Kartusche als interne Kontrolle nur mit ACTB-cRNA fungiert (Schritt 2b). . Nach der LAMP-Reaktion öffnen sich die beiden unteren aktiven Ventile und die Schwerkraft treibt 4 μl des LAMP-Produkts dazu, durch den linken und rechten passiven Dosierkanal zu fließen. Die Spritzenpumpe drückt aktiv 40 μl T7-Mix + FQ, 15 μl hydrophobe Lösung und 10 μl Cas13 + crRNA (N-Gen im linken Reservoir und ACTB im rechten Reservoir) durch die Dosierkanäle in das jeweilige N-Gen (links) und ACTB ( rechts) Kammer. Zum Mischen werden zusätzlich 50 μl Luft in beide Kammern gedrückt. Zu diesem Zeitpunkt werden 45 μl der Lösung aktiv in die jeweiligen Detektionskammern gesaugt (Schritt 3). In der linken Kammer befindet sich das LAMP-Produkt gemischt mit Cas13- und N-Gen-crRNA, während in der rechten Kammer, der internen Kontrolle, ebenfalls das LAMP-Produkt, jedoch gemischt mit Cas13- und ACTB-crRNA, vorhanden ist. Der TEC wird auf 37 °C aufgedreht und alle 10 s werden 30 min lang Fluoreszenzbilder aufgenommen. Die Faltungsänderung wurde zwischen 5 und 10 Minuten bestimmt, um das Testergebnis abzurufen (Abb. 5g und erweiterte Daten, Abb. 2d).

Vor Ort gesammelte klinische Speichelproben wurden von Erwachsenen im Alter von 18 Jahren oder älter entnommen, die in Kalifornien lebten und einen COVID-Test (Antigen-, PCR- oder transkriptionsvermittelter Amplifikationstest) in der Clinica de Salud del Valle de Salinas oder einen anderen Test im Salinas Valley erhielten Standort (UC Berkeley IRB-Protokollnummer 2021-04-14268). Zu den Teilnehmern, deren Proben in dieser Arbeit besprochen werden, gehörten sowohl landwirtschaftliche als auch nichtlandwirtschaftliche Arbeitnehmer. Auch schwangere Frauen waren zur Teilnahme eingeladen. Das Screening und die Einschreibung erfolgten persönlich in den Kliniken, die COVID-19-Tests durchführen, sowie telefonisch für Patienten, die kürzlich in der Clinica de Salud del Valle de Salinas positiv getestet wurden. Bei der gesamten Rekrutierung und Datenerfassung trugen Forschungs- und Klinikpersonal Masken und Handschuhe. Für die persönliche Entnahme stellten die Feldforscher den Teilnehmern einen Behälter mit offenem Mund zur Verfügung und forderten sie auf, bis zu einer vorher festgelegten Markierung von etwa 3 ml hineinzuspucken. Anschließend erhielt der Teilnehmer einen Deckel für den Behälter, ein Desinfektionstuch und ein Papiertuch. Anschließend wurde der Teilnehmer gebeten, den Behälter fest zu verschließen und die gesamte Außenseite des Behälters mit dem Tuch abzuwischen. Der Feldforscher, der Handschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung trug, nahm den Behälter entgegen, beschriftete ihn mit einem Aufkleber mit der Identifikationsnummer des Teilnehmers und dem Entnahmedatum und stellte ihn in eine Kühlbox mit Eisbeuteln. Für die Rekrutierung von COVID-positiven Personen zu Hause riefen die Feldforscher positiv getestete Patienten an und ermittelten deren Interesse an der Teilnahme an einer Forschungsstudie. Anschließend lieferte der Feldforscher ein Probenentnahmeset zum Haus des Teilnehmers. Das Kit enthielt visuelle und schriftliche Anweisungen zur Probenentnahme sowie einen vorbeschrifteten Behälter mit offenem Mund. Der Feldforscher führte den Teilnehmer telefonisch durch die Probenentnahme. Nach Abschluss der Untersuchung holte der Feldforscher das Kit vom Teilnehmer ab und legte die Speichelprobe in eine Kühlbox mit Eisbeuteln. Die Proben wurden dann bis zum Transport zur UC Berkeley auf Trockeneis bei –80 °C gelagert und anschließend erneut bei –80 °C aufbewahrt. Alle Proben wurden unter der ethischen Aufsicht des UC Berkeley Committee for Protection of Human Subjects gesammelt.

Als wir für den Test bereit waren, wurden alle 66 Proben, die uns aus der Studie zur Verfügung standen, aufgetaut und 20 Minuten lang bei 95 °C gemäß den EH&S-Richtlinien der Universität in BSL-2 hitzeinaktiviert, obwohl 5 Minuten für die Speichelinaktivierung ausreichten37. Da die Speichelproben selbst zuvor nicht getestet wurden, wurde für jede Probe eine RT-qPCR durchgeführt, um ein Positivitätsprofil des Probensatzes zu erhalten. RT-qPCR wurde mit dem Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB E3006) an N-Gen-Targeting-Primern durchgeführt, um die Endkonzentration viraler RNA zu bestimmen, und ACTB-Targeting-Primern als Prozesskontrolle. Aus den 66 gescreenten Proben wurden 13 Proben (10 positiv, 3 negativ) mit einem Bereich von Ct-Werten (Ergänzungstabelle 5) ausgewählt, um sie auf dem DISCoVER-Mikrofluidikgerät laufen zu lassen, um die Fähigkeit des Geräts zu validieren, bereits bestätigte negative und positive Proben zu unterscheiden durch einen Goldstandard-Assay in RT-qPCR. Jede dieser Speichelspenderproben wurde im Mikrofluidiksystem gemäß dem im Arbeitsablauf für künstliche Proben beschriebenen Protokoll analysiert und auf die gleiche Weise analysiert, wobei ein zweifacher Fluoreszenzanstieg gegenüber Hintergrundkartuschen als Indikator für Positivität für jedes Ziel beobachtet wurde (Abb . 5g).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle verwendeten Nukleinsäuresequenzen sind im Manuskript oder in den Zusatzinformationen angegeben. Als Quelldaten werden die Rohdaten der klinischen Proben bereitgestellt. Alle im Rahmen dieser Studie generierten Rohdaten und analysierten Datensätze stehen auf begründete Anfrage für Forschungszwecke bei den entsprechenden Autoren zur Verfügung. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der zur Steuerung der Bildgebungshardware verwendete Code ist als Zusatzinformation verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken allen Mitgliedern der Laboratorien Hsu, Savage, Fletcher und Doudna für ihre Unterstützung und Beratung sowie AJ ​​Ehrenberg, E. Charles und B. Thornton für hilfreiche Diskussionen. Wir danken M. Ott und R. Kumar für ihre Hilfe bei der Koordinierung der Sammlung natürlicher Speichelproben. Diese Arbeit wurde von der Shurl & Kay Curci Foundation, anonymen Spendern, Emergent Ventures, den National Institutes of Health (NIH) und DARPA unter der Auszeichnung N66001-20-2-4033 unterstützt. Die geäußerten Ansichten, Meinungen und/oder Erkenntnisse sind die der Autoren und sollten nicht als offizielle Ansichten oder Richtlinien des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung interpretiert werden. Wir danken dem NIH für seine Unterstützung (PDH R01GM131073, DP5OD021369 und DFS R01GM127463). JAD ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute (HHMI). AF wurde durch ein NSF Graduate Research Fellowship unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid.

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid, Sungmin Son, Abdul Bhuiya, Maria Diaz von Leon Derby, Andrew R. Harris, Liana F. Lareau, Daniel A. Fletcher und Patrick D. Hsu

Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Sita S. Chandrasekaran, Shreeya Agrawal, Alison Fanton, Aditya R. Jangid, Noam Prywes, Maria Lukarska, Dylan CJ Smock, Gavin J. Knott, Qi Dang, Eli Dugan, Shin Kim, Tina Y. Liu, Jennifer R. Hamilton, Henry Lin-Shiao, Elizabeth C. Stahl, Connor A. Tsuchida, Peter Giannikopoulos, Matthew McElroy, Shana McDevitt, Arielle Zur, Iman Sylvain, Alison Ciling, Madeleine Zhu, Clara Williams, Alisha Baldwin, Erica A. Moehle, Liana F. Lareau, Jennifer A. Doudna und Patrick D. Hsu

University of California, Berkeley–University of California, San Francisco Graduate Program in Bioengineering, Berkeley, CA, USA

Sita S. Chandrasekaran, Alison Fanton, Bérénice Charrez, Abdul Bhuiya und María Díaz de León Derby

Wainamics Inc., Pleasanton, CA, USA

Arthur M. Escajeda, Roger Mcintosh, Huyen Tran und Ming X. Tan

Abteilung für Physik und Astronomie, San José State University, San José, CA, USA

Neil A. Switz

Abteilung für Molekulare Biophysik und integrierte Biobildgebung, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA

Maxim Armstrong und Jennifer A. Doudna

Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Maria Lukarska, Dylan CJ Smock, Gavin J. Knott, Erik Van Dis, Eli Dugan, Shin Kim, Tina Y. Liu, Sarah A. Stanley, Jennifer A. Doudna und David F. Savage

Abteilung für Infektionskrankheiten und Vakzinologie, School of Public Health, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Scott B. Biering & Eva Harris

Zentrum für Computational Biology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Amanda Mock

Monash Biomedicine Discovery Institute, Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Monash University, Clayton, Victoria, Australien

Gavin J. Knott

Zentrum für Umweltforschung und Gemeindegesundheit (CERCH), School of Public Health, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Katherine Kogut und Brenda Eskenazi

School of Public Health, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Sarah A. Stanley

Howard Hughes Medical Institute, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Jennifer A. Doudna

Fakultät für Chemie, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA

Jennifer A. Doudna

Gladstone Institute of Data Science and Biotechnology, Gladstone Institutes, San Francisco, CA, USA

Jennifer A. Doudna

Arc Institute, Palo Alto, CA, USA

Patrick D. Hsu

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SSC, SA, AF, ARJ konzipierten und führten Experimente durch, analysierten die Daten und erstellten das Manuskript. PDH konzipierte das Projekt, entwarf Experimente, übernahm die Gesamtaufsicht für diese Arbeit und verfasste das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren. DFS und JAD lieferten experimentellen Input, redigierten das Manuskript und betreuten diese Arbeit gemeinsam. BC stellte mikrofluidisches Fachwissen zur Verfügung und redigierte das Manuskript. AME, HT, RM und MXT haben die mikrofluidische Kartusche und das Diagnoseinstrument entworfen und gebaut. SS, AB, NAS, MA, ARH und MDdLD entwarfen und bauten das in das Mikrofluidikgerät integrierte optische Instrument, redigierten unter der Aufsicht von DAFNP das Manuskript und trugen zusammen mit ML zum experimentellen Design bei. QD führte Standardquantifizierungsexperimente durch. DCJS, TYL und GJK reinigten Proteine ​​für Tests und stellten zusammen mit ED und SK biochemisches Fachwissen zur Verfügung. AM entwickelte Berechnungsmethoden für die Leit-RNA-Auswahl mit LFL, und SBB und EVD führten BSL-3-Arbeiten unter Aufsicht von EH und SAS durch. Das IGI Testing Consortium (JRH, EL-S., ECS, CAT, PG, MM, SM, AZ, IS, AC, MC und CW) führten diagnostische qPCR-Tests der Atemwegsabstrichproben durch. EAM, KK und BE koordinierten die Entnahme der Speichelproben in der Landarbeiterstudie im Salinas Valley.

Korrespondenz mit Jennifer A. Doudna, David F. Savage oder Patrick D. Hsu.

Die Regenten der University of California und Wainamics haben Patente im Zusammenhang mit dieser Arbeit angemeldet. PDH ist Mitbegründer von Spotlight Therapeutics und Moment Biosciences, Mitglied des Vorstands und des wissenschaftlichen Beirats und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Vial Health und Serotiny. DFS ist Mitbegründer von Scribe Therapeutics und Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Scribe Therapeutics und Mammoth Biosciences. JAD ist Mitbegründer von Caribou Biosciences, Editas Medicine, Scribe Therapeutics und Mammoth Biosciences. JAD ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Caribou Biosciences, Intellia Therapeutics, eFFECTOR Therapeutics, Scribe Therapeutics, Mammoth Biosciences, Synthego, Algen Biotechnologies, Felix Biosciences und Inari. JAD ist Direktor bei Johnson & Johnson und hat Forschungsprojekte, die von Biogen, Pfizer, AppleTree Partners und Roche gesponsert werden. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Biomedical Engineering dankt Jin Wang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

FIP- und BIP-Primer binden, unterstützt durch F3- und B3-Primer für XX, an die Ziel-DNA bei F2c und B2c und fügen dem Amplifikat komplementäre DNA-Regionen hinzu (F1c und B1c). Ihre Komplementarität zu F1 und B1 führt zu Schleifenstrukturen, die die weitere FIP- und BIP-Bindung an den Schleifen (F2c und B2c) und die Verlängerung erleichtern und das Ziel durch die Bildung langer Konkatemer verstärken. Floop- und Bloop-Primer können zusätzlich an die Schleifen binden und diese verlängern, wodurch die Amplifikation weiter erhöht wird. Die Zugabe des T7-Promotors am 5'-Ende des Schleifenprimers stellt ein Substrat für die Transkription der T7-Polymerase bereit, was zu einem RNA-Produkt führt, das invertierte Wiederholungen des Zielamplikons enthält.

(a) Screening von Prozesskontroll-Primersätzen an handelsüblichen Speichelproben. (b) Screening der T7-Promotorpositionen auf dem ACTB-Primersatz auf RNA-Extrakt und kommerziellen Speichelproben. (c) Schematische Darstellung des Kartuschendesigns. Die Reaktion kann in drei Schritte unterteilt werden: 1. Amplifikationsreaktion; 2. Nachverstärkungsmessung + Cas13-Mischung; 3. Cas13-Reaktion in Detektionskammern. Die auf der Kartusche gespeicherten Reagenzien werden durch eine proprietäre hydrophobe Lösung getrennt, um einen vorzeitigen Beginn der Reaktionen zu vermeiden. Nach der LAMP-Reaktion wird die Probe in zwei Reaktionen aufgeteilt: Der linke Teil der Kartusche setzt die Probe N-Gen-crRNA aus (Schritt 2a), während die rechte Seite der Kartusche nur als interne Kontrolle mit ACTB-crRNA fungiert (Schritt 2b). ). (d) Ergebnisse von DISCoVER an Bord von 25 einzelnen Speichelproben (20 Proben mit genomischer SARS-CoV-2-RNA bei 500 cp/μL, 5 erwartete negative Proben). Ein 2-facher Fluoreszenzanstieg gegenüber leeren Patronen nach 10 Minuten war das experimentell ermittelte Kriterium für positive Ergebnisse. Proben, deren Wert nach 10 Minuten unter diesem Grenzwert lag, wurden als negativ eingestuft.

Ergänzende Tabellen, Abbildungen und Videounterschrift.

Sequenzen für LAMP, rLAMP, RT-qPCR und Cas13.

Demonstration des DISCoVER-Workflows.

MATLAB-Skript zur Steuerung der Bildverarbeitungshardware.

Quelldaten für Abb. 5c,d und 7d.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chandrasekaran, SS, Agrawal, S., Fanton, A. et al. Schneller Nachweis von SARS-CoV-2-RNA im Speichel über Cas13. Nat. Biomed. Eng 6, 944–956 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

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Eingegangen: 01. Dezember 2020

Angenommen: 30. Juni 2022

Veröffentlicht: 11. August 2022

Ausgabedatum: August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00917-y

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