Citraconat hemmt die ACOD1 (IRG1)-Katalyse, reduziert Interferonreaktionen und oxidativen Stress und moduliert Entzündungen und Zellstoffwechsel

Oct 22, 2023

Nature Metabolism Band 4, Seiten 534–546 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Obwohl die immunmodulatorischen und zytoprotektiven Eigenschaften von Itaconat ausführlich untersucht wurden, ist nicht bekannt, ob seine natürlich vorkommenden Isomere Mesaconat und Citraconat ähnliche Eigenschaften haben. Hier zeigen wir, dass Itaconat teilweise intrazellulär in Mesaconat umgewandelt wird und dass die Mesaconatakkumulation bei der Makrophagenaktivierung von der vorherigen Itaconatsynthese abhängt. Bei Zugabe zu menschlichen Zellen in supraphysiologischen Konzentrationen senken alle drei Isomere den Laktatspiegel, wohingegen Itaconat der stärkste Inhibitor der Succinatdehydrogenase (SDH) ist. In mit dem Influenza-A-Virus (IAV) infizierten Zellen verändern alle drei Isomere den Aminosäurestoffwechsel tiefgreifend, modulieren die Zytokin-/Chemokinfreisetzung und reduzieren die Interferonsignalisierung, oxidativen Stress und die Freisetzung viraler Partikel. Von den drei Isomeren ist Citraconat der stärkste Elektrophile und Nuclear Factor-Erythroid 2-Related Factor 2 (NRF2)-Agonist. Nur Citraconat hemmt die Katalyse von Itaconat durch cis-Aconitat-Decarboxylase (ACOD1), wahrscheinlich durch kompetitive Bindung an die Substratbindungsstelle. Diese Ergebnisse zeigen, dass Meaconat und Citraconat immunmodulatorische, antioxidative und antivirale Verbindungen sind und Citraconat der erste natürlich vorkommende ACOD1-Inhibitor ist.

Die kleinen ungesättigten Dicarbonsäuren Itaconsäure, Mesaconsäure und Citraconsäure sind natürlich vorkommende Isomere, die sich lediglich durch die Lage einer Doppelbindung unterscheiden (Abb. 1). Itaconat ist ein wichtiger Metabolit aktivierter Makrophagen und das Produkt des mitochondrialen Enzyms ACOD11,2. Es wird intensiv als Bindeglied zwischen Stoffwechsel und Immunität untersucht, hat immunmodulatorische Eigenschaften (siehe Lit. 3,4) und wurde in menschlichen Bioflüssigkeiten, Zellen und Geweben bei einer Vielzahl von Entzündungs- und Infektionskrankheiten sowie in Nagetiermodellen nachgewiesen menschlicher Krankheiten (zusammengefasst in Lit. 5). Informationen über die Herkunft und den Katabolismus von Mesaconat und Citraconat in Eukaryoten sind spärlich. Aufgrund ihrer hohen strukturellen Ähnlichkeit ist eine gegenseitige Umwandlung der drei Isomere, beispielsweise über endogene Isomerasen, denkbar. Basierend auf Arbeiten zum Itaconat-Metabolismus unter Verwendung isolierter Lebermitochondrien6 haben Nemeth et al. schlugen vor, dass Mesaconat ein Produkt des Itaconat-Katabolismus über Itaconyl-CoA7 sein könnte. Die einzige Studie, die auf einen Biosynthesemechanismus von Citraconat in höheren Organismen hinweist, basiert auf Metabolitenprofilen von Patienten mit Methylmalonazidämie, bei denen postuliert wurde, dass es sich um einen Kataboliten der verzweigtkettigen Aminosäure (BCAA) Isoleucin handelt8. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass erhöhte Mesaconat- oder Citraconatspiegel mit Stoffwechselerkrankungen beim Menschen verbunden sein können (zusammengefasst in Lit. 5). Es bleibt jedoch zu klären, ob diese erhöhten Konzentrationen pathophysiologisch relevant sind oder ob sie lediglich Epiphänomene von Stoffwechselstörungen darstellen. Beim Menschen liegen keine Informationen über die Gewebeverteilung von Mesaconat oder Citraconat vor. Bei einem Screening von Organen gesunder Mäuse haben wir jedoch kürzlich gezeigt, dass Mesaconat in Lymphknoten und Citraconat in Lymphknoten und Milz vorkommt, was die Möglichkeit einer gewissen Funktion bei der Immunität erhöht5.

Ausgewählte TCA-Zwischenprodukte und Laktat wurden durch HPLC-MS/MS nach 6 und 24 Stunden in den in Extended Data Abb. 1 gezeigten Experimenten zur Aufnahme von Itaconat-Isomeren gemessen. Die Konzentrationen werden basierend auf dem berechneten Zellvolumen ausgedrückt. a, PCA zeigt starke Veränderungen aufgrund aller drei Isomere nach 6 Stunden, aber eine relative Normalisierung der Mesaconat- und Citraconat-Effekte nach 24 Stunden. b–d, Das gemessene Isomer ist über jedem Diagramm angegeben, die hinzugefügten Isomere unterhalb der x-Achse. e, Konzentrationen von Laktat und ausgewählten TCA-Zwischenprodukten (Konzentrationen auf der y-Achse angegeben) 6 Stunden nach Zugabe der unter der x-Achse angegebenen Isomere. Alle drei Isomere senken den Laktatspiegel (im Einklang mit der Hemmung der Glykolyse), aber nur Itaconat erhöht den Succinatspiegel, was auf eine Hemmung von SDH schließen lässt. Citra, Citraconsäure; Ita, Itaconsäure; Mesa, Mesaconsäure. n = 3 biologische Replikate, Mittelwerte ± sd Ungepaarter t-Test. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; NS, nicht signifikant.

Die immunmodulatorischen und zytoprotektiven Eigenschaften von Itaconat und chemisch modifizierten Derivaten wie Dimethyl- und 4-Octylitaconat (4-OI) werden intensiv untersucht, um therapeutische Interventionen für entzündliche und degenerative Erkrankungen3,4 und Virusinfektionen9,10 zu entwickeln. Es ist hingegen nicht bekannt, ob exogen appliziertes Mesaconat oder Citraconat von Zellen aufgenommen werden kann und ob sie ähnliche immunmodulatorische, antioxidative oder antiinfektiöse Wirkungen wie Itaconat ausüben. Über die gut dokumentierte Rolle von Itaconat im Immunmetabolismus hinaus wurde eine fehlerhafte Synthese von Itaconat durch ACOD1 mit der Karzinogenese in Verbindung gebracht. Itaconat, das aus peritonealen Makrophagen freigesetzt wird, kann als Wachstumsfaktor für Tumoren dienen, die sich in die Bauchhöhle ausgebreitet haben11, und eine protumorigene Rolle von ACOD1 wurde auch bei Gliomen berichtet12,13. ACOD1-Inhibitoren können daher antineoplastische Eigenschaften haben, es ist jedoch nicht bekannt, ob es endogene Moleküle gibt, die die ACOD1-Aktivität hemmen. In Anbetracht dieser offenen Fragen verwendeten wir eine Kombination aus zellfreien Tests, Zellmodellen, einem IAV-Infektionsmodell und einem Mausmodell einer durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierten Entzündung, um: (1) zu testen, ob es eine gegenseitige Umwandlung zwischen den drei Isomeren gibt; (2) den Einfluss von Mesaconat und Citraconat auf den Zellstoffwechsel, Entzündungen, oxidativen Stress und die Infektiosität von IAV bewerten; und (3) testen, ob eines der drei Isomere die ACOD1-Aktivität hemmt.

Auf der Suche nach den Ursprüngen von Mesaconat und Citraconat haben wir zunächst getestet, ob es zu einer spontanen gegenseitigen Umwandlung zwischen den drei Isomeren kommt und ob ACOD1 auch die Mesaconat- oder Citraconat-Synthese katalysieren kann. In einem zellfreien ACOD1-Enzymtest2 gab es keine Hinweise auf eine Mesaconat- oder Citraconat-Synthese (ergänzende Abbildung 1b) und es gab keine spontane gegenseitige Umwandlung, wenn reine Verbindungen bis zu 24 Stunden lang in RPMI-Medium inkubiert wurden (ergänzende Abbildung 1c – e). . In reinen Beständen der jeweiligen anderen Isomere wurden jedoch biologisch irrelevante niedrige Kontaminationskonzentrationen jedes Isomers festgestellt (ergänzende Abbildung 1g).

Cordes et al. zeigten, dass exogen zugesetztes Itaconat (25 mM) zu intrazellulären Konzentrationen von 14 mM in ruhenden murinen RAW 264.7-Zellen führen kann14. Nachdem wir die ungiftigen Konzentrationen der Isomere bestimmt hatten (ergänzende Abbildung 1h), testeten wir ihre Aufnahme in differenzierte menschliche Makrophagen-ähnliche Zellen (dTHP1). Tatsächlich wurden alle drei Isomere effizient aufgenommen (Extended Data Abb. 1a–f) und es gab keine Hinweise auf eine De-novo-Synthese von Citraconat oder Itaconat. Wenn dem Medium jedoch Itaconat zugesetzt wurde, trat Mesaconat intrazellulär auf. Die Konzentration von Mesaconat in Bezug auf intrazelluläres Itaconat lag zwischen 1,7 % und 8,0 % und korrelierte umgekehrt mit der intrazellulären Itaconatkonzentration (Extended Data, Abb. 1d).

Bemerkenswert ist, dass 24 Stunden nach der Zugabe von Itaconat auch eine kleine Menge Mesaconat in den Überständen auftrat, was mit der Sekretion von intrazellulär erzeugtem Mesaconat übereinstimmt (Extended Data, Abb. 1g). Wir haben daher getestet, ob endogen synthetisiertes Itaconat auch zu einer Mesaconatakkumulation führen würde. Tatsächlich führte die LPS/Interferon-γ (IFN-γ)-Stimulation von dTHP1-Zellen zu einer Mesaconat-Akkumulation, die nach Itaconat ihren Höhepunkt erreichte (Extended Data Abb. 2a–d), wohingegen weder Itaconat noch Mesaconat in ACOD1-/−-dTHP1-Zellen nachweisbar waren, die mit stimuliert wurden LPS/IFN-γ. Citraconat wurde in keinem Zelltyp nachgewiesen. Eine offensichtliche Umwandlung von Itaconat in Mesaconat wurde auch in der Milz von Mäusen während eines 72-stündigen Verlaufs einer LPS-induzierten systemischen Entzündung festgestellt (Extended Data, Abb. 2e – h). Allerdings betrug die fraktionierte Umwandlung von Itaconat zu Mesaconat nur etwa 4 %, was viel weniger ist als in dTHP1-Zellen. Um zu testen, ob die Umwandlung von Itaconat in Mesaconat auch in Zellen stattfinden kann, die ACOD1 nicht physiologisch exprimieren, haben wir die respiratorische Epithelzelllinie A549 mit einem Vektor transfiziert, der menschliches ACOD1 (hACOD1) oder murines ACOD1 (mACOD1) konstitutiv exprimiert; Erweiterte Daten Abb. 2i– l). Im Gegensatz zu der in dTHP1-Zellen beobachteten Verzögerung kam es zu einem parallelen Anstieg von Itaconat und Mesaconat, wobei Mesaconat 4–5 % (hACOD1) und 2,5–2,7 % (mACOD1) in Bezug auf Itaconat, aber absolute Mesaconatkonzentrationen betrug waren in Zellen, die mACOD1 exprimierten, viel höher, die weitaus höhere Mengen an Itaconat produzieren als das menschliche Enzym2 (Extended Data Abb. 2j, k). Citraconat wurde nicht nachgewiesen. Itaconat kann SDH hemmen und dadurch den Succinatspiegel erhöhen15. Tatsächlich reichert sich Succinat deutlich in Zellen an, die mACOD1 exprimieren (Extended Data, Abb. 2i). In hACOD1-transfizierten Zellen wurde ein geringerer Anstieg des Succinats beobachtet, jedoch nur bei Itaconatkonzentrationen, die höher waren als die Succinat-Ausgangswerte. Zusammengenommen sind die in den erweiterten Datenabbildungen gezeigten Ergebnisse. 1 und 2 deuten darauf hin, dass Citraconat einen Itaconat-unabhängigen Ursprung hat, während Mesaconat über einen enzymvermittelten Prozess aus Itaconat entsteht, der physiologisch zumindest in Milz und Makrophagen abläuft, aber nicht streng zelltypabhängig ist.

Zusätzlich zur Hemmung von SDH kann Itaconat den zentralen Glukosestoffwechsel von der aeroben Glykolyse auf den Pentose-Phosphat-Shunt verlagern16. Wir haben daher die Auswirkungen der Zugabe steigender Konzentrationen der drei Isomere auf Laktat, Succinat und andere ausgewählte Zwischenprodukte des Tricarbonsäurezyklus (TCA) untersucht. Wie im Diagramm der Hauptkomponentenanalyse (PCA) in Abb. 1a gezeigt, unterschieden sich die Auswirkungen der Isomere 6 Stunden nach der Zugabe deutlich und waren für Itaconat am größten. Bemerkenswert ist, dass die Veränderungen aufgrund von Itaconat nach 24 Stunden weiter zunahmen, während sich die Veränderungen aufgrund von Mesaconat und Citraconat zu normalisieren begannen (Abb. 1a). Alle drei Isomere reduzierten die Laktatkonzentration nach 6 Stunden deutlich (Abb. 1e), aber der Effekt ließ nach 24 Stunden nach (Extended Data Abb. 3a). Bemerkenswerterweise kam es zu beiden Zeitpunkten nach der Zugabe von Itaconat zu einem einzigartigen dosisabhängigen Anstieg des Succinats, was mit der SDH-Hemmung übereinstimmt, während nach der Zugabe von Mesaconat oder Citraconat die Succinatspiegel nur nach 24 Stunden leicht anstiegen. Bei Verwendung des Succinat/Fumarat-Verhältnisses als Maß für die SDH-Hemmung war jedoch auch eine schwache Hemmung bei hohen Mesaconat-Dosen nach 6 Stunden (Extended Data Abb. 3h) und eine sehr schwache Hemmung (ungefähr 2 % der Hemmung durch Itaconat) erkennbar Mesaconat und Citraconat nach 24 Stunden. Die viel größere Anreicherung von Succinat aufgrund der Itaconat-Zugabe wurde auch in zwei Experimenten mit IAV-infizierten Zellen bestätigt (Extended Data Abb. 3i, j).

Es wurde argumentiert, dass Itaconat SDH durch kovalente Alkylierung von SH-Gruppen im aktiven Zentrum (SDHA) hemmt17. Allerdings war die Bildung von Michael-Addukten mit Glutathion (Extended Data Abb. 4a–c) tatsächlich am effizientesten mit Citraconat (das SDH nicht hemmt) und war im Vergleich zu Itaconat bzw. Mesaconat 8- bzw. 48-fach höher (Ergänzende Abb . 2a–d und Ergänzungstabelle 1). Tatsächlich identifizierten Berechnungen mit dem niedrigsten unbesetzten Molekülorbital und dem Elektrophilieindex (ω)18 Citraconat als das stärkste und Mesaconat als das schwächste Elektrophil (Extended Data Abb. 4d und Ergänzungstabelle 1).

Angesichts der Diskrepanz zwischen der Elektrophilie (SH-Alkylierungsfähigkeit) und der SDH-inhibitorischen Aktivität der Verbindungen verwendeten wir Strukturmodelle, um alternative Bindungsmodi zu testen. Tatsächlich wurde die kovalente Bindung an die nächstgelegenen Cysteinreste als Hauptinhibitionsmodus für Itaconat sowohl in menschlichem als auch in Schweine-SDHA als unplausibel erachtet (ergänzende Abbildung 2e, f). Angesichts der strukturellen Ähnlichkeit von Itaconat mit Succinat und substratähnlichen Inhibitoren wie Oxalacetat könnte Itaconat über einen kompetitiven Mechanismus auf die Succinat-Bindungsstelle abzielen. Das Andocken der drei Isomere an das aktive Zentrum von menschlichem und Schweine-SDHA ergab, dass Itaconat voraussichtlich über elektrostatische Wechselwirkungen mit günstigen Bindungsenergien ähnlich wie Oxalacetat an der Succinat-Bindungsstelle bindet (Extended Data Abb. 4e, f und ergänzende Abb. 2h). ). Mesaconat und Citraconat zeigen aufgrund der durch die erweiterte Konjugation verliehenen Starrheit und Planarität nur wenige Kontakte. Bemerkenswert ist, dass Mesaconat ein Analogon des Succinat-Oxidationsprodukts Fumarat ist und es plausibel ist, dass es Wechselwirkungen mit SDHA eingeht (Extended Data Abb. 4g, h und Supplementary Abb. 2i), wohingegen die cis-Konfiguration von Citraconat ungünstig zu sein scheint zum Binden (Ergänzende Abbildung 2j). Ein In-vitro-SDH-Aktivitätstest unter Verwendung von Rindermitochondrien (deren aktives Zentrum in menschlichem SDH zu 100 % konserviert ist) bestätigte eine starke SDH-Hemmung durch Itaconat und im Wesentlichen keine durch Citraconat, zeigte jedoch einen mäßigen Grad der Hemmung durch Mesaconat (Extended Data Abb. 4i). ). In Übereinstimmung mit aktuellen biochemischen Erkenntnissen19 deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Itaconat SDHA über direkte nichtkovalente Wechselwirkungen mit dem aktiven Zentrum hemmt. Der geringe Grad der SDH-Hemmung durch Mesaconat in unseren zellbasierten Experimenten kann auf einen geringeren zytoplasmatisch-mitochondrialen Eintritt zurückzuführen sein oder darauf, dass seine Hemmungsstärke nicht ausreicht, um unter Steady-State-Bedingungen deutliche Unterschiede hervorzurufen.

Itaconat-Derivate werden als antivirale Verbindungen und Zusatzbehandlungen zur Modifizierung der Wirtsreaktionen bei Virusinfektionen untersucht9,10. Wir infizierten daher dTHP1- und A549-Zellen mit IAV und behandelten sie mit ungiftigen Konzentrationen der drei Isomere, bestimmt durch den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay ( Ergänzende Abbildung 1h). Die Analysen wurden zum Zeitpunkt der maximalen intrazellulären Reaktion auf die Infektion durchgeführt, d. h. 12 Stunden nach der Infektion (pi) (dTHP1) und 24 Stunden nach der Infektion (A549)20. Wie primäre menschliche Makrophagen unterstützen dTHP1-Zellen eine unproduktive IAV-Infektion, die eine virale RNA-Replikation und eine starke intrazelluläre Reaktion aufweist, jedoch nicht die Freisetzung von Nachkommen-Virionen. Bei diesem Zelltyp führten die Behandlungen nicht zu einer nennenswerten Verringerung der Synthese viraler Hämagglutinin (HA) Messenger-RNA (mRNA) (Extended Data Abb. 5a). Im Gegensatz dazu unterstützen A549-Zellen eine produktive Infektion durch die Freisetzung neuer Virionen. Wie erwartet gab es nach 24 h pi hohe zelluläre Mengen an HA-mRNA und hohe IAV-Titer in den Kulturüberständen. Die Zugabe der Isomere hatte keinen Einfluss auf die HA-mRNA-Spiegel, aber bemerkenswerterweise reduzierten alle drei die Virustiter in den Überständen stark (Itaconat, 30-fach; Mesaconat, 36-fach; Citraconat, 53-fach) (Extended Data Abb. 5b, c). ). Somit besitzen alle drei Isomere Anti-IAV-Eigenschaften, die offenbar die Produktion oder Freisetzung neuer Viruspartikel beeinträchtigen, vermutlich durch Störung eines posttranskriptionellen Prozesses.

Um nach metabolischen Korrelaten ihrer antiviralen Wirkungen zu suchen und einen umfassenderen Überblick über die gemeinsamen und einzigartigen Wirkungen der drei Isomere auf den Zellstoffwechsel zu erhalten, verwendeten wir dann dieses IAV-Infektionsmodell in einer gezielten Analyse von Aminosäuren und verwandten Metaboliten. Der Einfluss von IAV auf den Aminosäurestoffwechsel war in dTHP1-Zellen schwach, aber alle drei Isomere führten zu ausgeprägten Veränderungen im Aminosäurestoffwechsel in den infizierten Zellen, die sich von den Veränderungen aufgrund von 4-OI (das zum Vergleich herangezogen wurde) unterschieden und ebenfalls auftraten zwischen den Isomeren unterschiedlich sein (Extended Data Abb. 5d). In A549-Zellen war der Einfluss der Infektion viel stärker, aber die Isomere führten zu weiteren Veränderungen in den Aminosäure-bezogenen Metabolitenpopulationen (Extended Data, Abb. 5e). Der größere Einfluss der Infektion auf den Aminosäurestoffwechsel in A549-Zellen zeigte sich darin, dass 21 Analyten unterschiedlich häufig vorkamen (17 davon waren reduziert), wohingegen nur ein Analyt (Cys) in THP1-Zellen signifikant verändert war (Extended Data Abb. 5f). Ebenso veränderte die Infektion die Werte von 12 Metabolitenindikatoren in A549-Zellen, jedoch nur zwei in dTHP1-Zellen (Extended Data Abb. 5g). Die Behandlung von IAV-infizierten dTHP1-Zellen mit den Isomeren führte zu 24 signifikant veränderten Analyten, von denen 19 verringert waren (ergänzende Abbildung 3a, b). Einige Effekte wurden eindeutig mit einem Isomer in Verbindung gebracht, andere wurden jedoch von zwei oder allen dreien gemeinsam. Beispielsweise erhöhten alle drei Isomere die vorhergesagte Prolylhydroxylase-Aktivität (eine enzymatische Aktivität, die für die Destabilisierung des durch Hypoxie induzierbaren Faktors 1α [HIF-1α] wichtig ist), aber Itaconat und Citraconat hatten die größten Auswirkungen auf die Prolin- und trans-4-Hydroxyprolin-Spiegel (ergänzende Abbildung). . 4j–l). Mesaconat bewirkte die meisten signifikanten Veränderungen; Insbesondere wurden die Aminosäurespiegel erheblich gesenkt, was in allen Aminosäureunterklassen deutlich zu erkennen war (Ergänzende Abbildungen 3c und 4b, c). In A549-Zellen führten die Behandlungen zu weniger signifikanten Veränderungen, wahrscheinlich aufgrund der stärkeren Auswirkungen der Infektion (ergänzende Abbildung 3e – h). Dies wird durch Arg, His, Lys und Trp veranschaulicht, vier Aminosäuren, die für die Replikation des Influenzavirus wichtig sind und bei einer produktiven Influenzavirusinfektion typischerweise reduziert werden21. All dies wurde in infizierten A549-Zellen signifikant reduziert, aber (im Gegensatz zu dTHP1-Zellen) führten die Behandlungen nicht zu einer nennenswerten weiteren Reduktion (ergänzende Abbildung 4d – g). Dennoch waren in A549-Zellen unterschiedliche und gemeinsame Wirkungen der Isomere erkennbar. Beispielsweise erhöhten alle drei Isomere den Kynureninspiegel (Kyn) und die vorhergesagte Aktivität von IDO1, einem potenziell immunsuppressiven Enzym, das für die Umwandlung von Trp in Kyn und die Erzeugung von NAD+ als Endprodukt des Trp-Kyn-NAD+-Wegs verantwortlich ist (Ergänzung). Abb. 4h, i), wohingegen Itaconat bevorzugt die Thr-, Ala-, Ser-, Asp- und asymmetrischen Dimethylargininspiegel erhöhte (ergänzende Abb. 4m – q). Polyamine spielen eine wichtige Rolle bei Virus-Wirt-Interaktionen in mehreren, meist posttranskriptionellen Schritten22. Die drei gemessenen Polyamine waren Zwischenprodukte des Spermidin/Spermin-N1-Acetyltransferase-Signalwegs, und ihr Abbau kann die Replikation des RNA-Virus hemmen23. Tatsächlich neigten alle drei Isomere dazu, die Polyaminspiegel in infizierten A549-Zellen zu senken, obwohl eine Signifikanz bei P <0, 05 nur im Fall des Vorläufers Ornithin erreicht wurde (ergänzende Abbildung 4t – y). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass supraphysiologische Konzentrationen (die eine pharmakologische Anwendung nachahmen) der Itaconat-Isomere tiefgreifende Auswirkungen auf den Aminosäurestoffwechsel in IAV-infizierten Zellen haben, die sich je nach Isomer, Zelltyp und Art der Infektion (produktiv versus nicht-infiziert) erheblich unterscheiden können. produktiv) und kann funktionell mit antiviralen Netzwerken wie dem Polyaminweg zusammenhängen.

Da Citraconat das stärkste Elektrophil der drei Isomere ist, verglichen wir anschließend die Fähigkeit der Isomere, den KEAP1-NRF2-Signalweg zu aktivieren24. Citraconat übte die stärkste stabilisierende Wirkung auf NRF2 in HaCaT-Keratinozyten aus und induzierte am stärksten mRNA, die für das Mitglied B10 der Aldo-Keto-Reduktase-Familie 1 (AKR1B10, ein durch NRF2 induzierter nachgeschalteter Faktor) kodiert (Abb. 2a – c). In NRF2–/– HaCaT-Zellen war die AKR1B10-mRNA-Expression zu Studienbeginn geringer und es gab nur bei höheren Citraconatkonzentrationen eine signifikante Induktion, mit einer geringeren Faltungsänderung als in Wildtyp-Zellen (Abb. 2d). Bei der Untersuchung von 14 potenziell NRF2-regulierten Genen25 bewirkte Citraconat die insgesamt stärkste Induktion in Wildtyp-Zellen, wohingegen die Expression der meisten Ziele zu Studienbeginn und nach der Stimulation in NRF2–/–-Zellen geringer war (Extended Data Abb. 6a,b) . Die IFN-γ-Stimulation von Wildtyp-HaCaT-Zellen führte zu einer deutlichen Herunterregulierung der SLC7A11-mRNA, die durch Citraconat im Wildtyp, nicht jedoch in den NRF2–/–-Zellen gerettet wurde (Abb. 2e). In ähnlicher Weise erhöhte die Anwendung von Citraconat in IAV-infizierten dTPH1-Zellen die Expression von SLC7A11-, GCLM- und ME1-mRNA, wohingegen Mesaconat keine Wirkung hatte (Extended Data Abb. 6c – e). Diese induzierenden Effekte waren mäßig, was mit der Klassifizierung der Isomere als mäßige Elektrophile übereinstimmt (Ergänzungstabelle 1). Itaconat kann den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) senken14. Wir verglichen die Anti-ROS-Aktivität der drei Isomere in IAV-infizierten dTHP1-Zellen. Die Infektion führte zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl mitochondrialer ROS-positiver Zellen, der durch Itaconat und Citraconat deutlich umgekehrt wurde, wohingegen die ROS-Reduktion durch Mesaconat nur geringfügig signifikant war (Abb. 2f).

a–d, Citraconat ist der stärkste NRF2-Agonist. a,b, Stabilisierung des NRF2-Proteins in Wildtyp-Zellen. Western Blot (3 h nach der Stimulation) von zwei unabhängigen Experimenten (a) und kombinierte densitometrische Messungen der Banden bei 110–120 kDa entsprechend NRF2 (b) (n = 2). c,d, Expression der NRF2-induzierbaren AKR1B10-mRNA in Wildtyp- und NRF2–/–-Zellen 16 Stunden nach der Stimulation. Die Zellen wurden 6 Stunden lang mit Itaconat-Isomeren vorbehandelt oder unbehandelt gelassen und dann 10 Stunden lang mit IFN-γ (300 U ml−1) in Gegenwart oder Abwesenheit der Isomere stimuliert (n = 6, Mittelwert ± Standardabweichung). e, Citraconat rettet die SLC7A11-mRNA-Unterdrückung durch IFN-γ in Wildtyp-, aber nicht in NRF2–/– HaCaT-Zellen (RT–qPCR). f, Citraconat übt ähnliche antioxidative Wirkungen wie Itaconat aus. dTHP1-Zellen wurden mit IAV infiziert und ROS wurden 12 h pi gemessen (Itaconat-Isomere = 25 mM, 4-OI = 125 µM). g–n, Gemeinsame und unterschiedliche immunmodulatorische Wirkungen der Isomere und 4-OI. dTHP1-Zellen wurden mit IAV in Abwesenheit oder Anwesenheit von Itaconat, Mesaconat, Citraconat (variable Konzentrationen) oder 4-OI (125 µM) infiziert, und entzündungsbedingte Moleküle wurden nach 12 Stunden pi g,h gemessen. CXCL10-mRNA-Spiegel in Zellpellets und CXCL10-Protein im Überstand. i, Differenzielle Wirkungen auf entzündungsbedingte Polypeptide in Zellkulturüberständen (27-Plex-Assay; separates Experiment von g, h; Isomerkonzentrationen = 20 mM, 4-OI = 125 µM.) PCA basierend auf Konzentrationen von 25 Zielen, die die Qualität bestanden haben Bewertung. c–i, n = 3 biologische Replikate, Mittelwert ± sd j,k, Itaconat-Isomere reduzieren die STAT1-Phosphorylierung. A549- und dTHP1-Zellen (ein repräsentativer Blot von zwei Replikaten) wurden mit Itaconat-Isomeren (25 mM) oder 4-OI vorbehandelt, 2 Stunden lang mit IAV infiziert und 10 Stunden (dTHP1) bzw. 22 Stunden (A549) (Anti-P -STAT1-Immunoblot). l–n, Citraconat reduziert IAV-induzierte IFN-Reaktionen im menschlichen Lungengewebe. Lungenexplantate wurden mit IAV (2 × 105 FFU ml–1) in Gegenwart oder Abwesenheit von Itaconat, Citraconat und 4-OI in den angegebenen Konzentrationen (mM) infiziert. Die Expression der Ziel-mRNAs wurde 24 h pi gemessen (fünf Explantate, drei Stücke pro Explantat, Gesamt-n = 15, Median, Interquartilbereich). Citra, Citraconsäure; Ita, Itaconsäure; Mesa, Mesaconsäure. *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleichstest, außer l–n (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test mit Bonferroni-Korrektur).

Quelldaten

Itaconat hat starke immunmodulatorische Eigenschaften3,4 und wir haben daher getestet, ob Mesaconat und Citraconat auch Entzündungsreaktionen modifizieren. In IAV-infizierten dTHP1-Zellen reduzierten alle drei Isomere die mRNA, die für den CXC-Motiv-Chemokinliganden 10 (CXCL10) kodiert, wohingegen die Reduktion des CXCL10-Proteins in Zellüberständen durch Itaconat und Citraconat stärker war (Abb. 2g, h). Itaconat und Citraconat reduzierten die Interleukin-6 (IL-6)-mRNA, keiner beeinflusste die IL-1β-Transkription und nur Mesaconat und Citraconat reduzierten die Tumornekrosefaktor-α (TNFα)-mRNA (Extended Data Abb. 6f – h). In einem unabhängigen Experiment führte die IAV-Infektion zu einer erheblichen Neuprogrammierung der Zytokin-/Chemokinpopulationen in Überständen, die durch die Zugabe von 4-OI stark moduliert wurde, jedoch weniger durch die drei Isomere (Abb. 2i). Dennoch wurden gemeinsame und einzigartige Effekte der drei Isomere beobachtet (Extended Data Abb. 6i – q). Auch hier reduzierten nur Itaconat und Citraconat die CXCL10-Proteinspiegel signifikant. Alle drei Isomere reduzierten die Konzentrationen von IL-1β und Makrophagen-Entzündungsprotein-1β (CCL4), während nur Mesaconat IL-2 und Tumornekrosefaktor-α reduzierte. Bemerkenswert ist, dass alle drei Isomere die Konzentrationen des Chemokins CCL5 (RANTES) erhöhten, wohingegen nur Itaconat und Citraconat die IL-8-Konzentrationen deutlich erhöhten. Diese Analyse ergab, dass: (1) 4-OI die stärkste „normalisierende“ Wirkung auf die Zytokin-/Chemokinfreisetzung aus infizierten dTHP1-Zellen ausübte; (2) exogen angewendetes Mesaconat und Citraconat besitzen gemeinsame und einzigartige immunmodulatorische Eigenschaften (von denen einige mit Itaconat geteilt werden); und (3) die möglichen funktionellen Konsequenzen können teilweise auf Unterschiede bei der Rekrutierung zusätzlicher Entzündungszellen zurückzuführen sein. Um zu testen, ob die beobachtete Verringerung der CXCL10-mRNA- und -Proteinspiegel auf eine verminderte kanonische IFN-Signalübertragung vom Typ I zurückzuführen ist, untersuchten wir die Auswirkungen der Isomere auf den Signalwandler und den Aktivator der Transkriptions-1-Phosphorylierung (STAT1) in dTHP1- und A549-Zellen. Eine IAV-Infektion erhöhte die Konzentrationen an nichtphosphoryliertem und phosphoryliertem STAT1 erheblich, und alle drei Isomere verringerten die Konzentrationen an phosphoryliertem, aber nicht nichtphosphoryliertem STAT1 (Abb. 2j, k). Mesaconat hatte eine etwas schwächere Wirkung auf dTHP1-Zellen, wohingegen 4-OI bei beiden Zelltypen mit Abstand am stärksten war. Das Anti-IFN-Potenzial von Citraconat wurde auch in ex vivo kultiviertem menschlichem Lungengewebe überprüft. Eine IAV-Infektion führte zu dem erwarteten Anstieg der viralen HA-, IFIT1- und CXCL10-mRNA. Obwohl es keine signifikante Verringerung der viralen HA-RNA-Spiegel gab, reduzierte Citraconat sowohl die IFIT1- als auch die CXCL10-Expression signifikant (Abb. 2l–n).

Von mehreren Verbindungen mit Ähnlichkeit zu cis-Aconitat erwies sich nur Citraconat als ACOD1-Inhibitor. Bemerkenswerterweise hatte es keinen Einfluss auf die Aktivität von Aspergillus ACOD1, aber 10 mM Citraconat verringerten die Aktivität von menschlichem und murinem ACOD1 um etwa 90 % (Abb. 3a – c und erweiterte Daten Abb. 7a, b). Die ACOD1-Hemmung durch Citraconat wurde auch in ACOD1-exprimierenden A549-Zellen nachgewiesen. Tatsächlich kam es in Gegenwart von Citraconat zu einer dosisabhängigen Abnahme der Itaconat-Akkumulation (Abb. 3d). Dies war nicht auf eine verminderte Expression von ACOD1 zurückzuführen, da die mRNA-Spiegel davon nicht betroffen waren (Abb. 3e). Die Citraconatkonzentration im Medium, die zu einer halbmaximalen Hemmung der ACOD1-Aktivität (IC50) führte, betrug 50 µM (ergänzende Abbildung 5d, e). Der Vergleich des Pharmakophor-Fingerabdrucks der drei Itaconat-Isomere mit dem von cis-Aconitat zeigte, dass Citraconat den höchsten Tanimoto-Koeffizienten aufweist, also die größte Ähnlichkeit mit cis-Aconitat (Extended Data Abb. 7c). Dies deutet darauf hin, dass es das aktive Zentrum von ACOD1 bindet und als Substratanalogon fungiert. Tatsächlich wurde durch Strukturmodellierung vorhergesagt, dass es in ähnlicher Weise wie cis-Aconitat (Abb. 3f – h und erweiterte Daten Abb. 7d, e) günstig an das aktive Zentrum von menschlichem ACOD12 und dem murinen Homologen 2 bindet, wohingegen das nichtplanare Itaconat und das trans-Isomer Mesaconat weisen niedrigere Bindungsenergien auf und passen weniger optimal (Extended Data Abb. 7f).

a–c, Zellfreier Assay. Rekombinantes hACOD1 wurde mit steigenden Konzentrationen an Substrat (cis-Aconitat) und Inhibitor (Citraconat) inkubiert und die Itaconat-Akkumulation wurde mittels HPLC gemessen. n = 3 unabhängige Tests, Mittelwert ± Standardabweichung. Die Linie stellt eine Kurvenanpassung an die Michaelis-Menten-Gleichung mit einem kompetitiven Inhibitor dar. b, Lineweaver-Burk-Diagramm der in a gezeigten Daten (Mittelwert ± Standardabweichung). c, Zusammenfassung der Enzym- und Inhibitionskinetik basierend auf a (hACOD1) und den in Extended Data Abb. 7a,b gezeigten Daten (mACOD1). d,e, Zellbasierter Assay. A549-Zellen wurden mit einem hACOD1 überexprimierenden Plasmid transfiziert und mit steigenden Konzentrationen an Citraconat inkubiert. Die intrazellulären Citraconat- und Itaconat-Konzentrationen wurden mittels HPLC-MS/MS gemessen. Die Zugabe von Citraconat führt dosisabhängig zu einer verringerten Itaconat-Akkumulation (d), was nicht auf eine verminderte hACOD1-Transkription zurückzuführen ist (e). n = 3 biologische Replikate (d), n = 6 biologische Replikate (e), Mittelwert ± sd f–g, Mutmaßlicher Bindungsmodus von Citraconat (gelb) im aktiven Zentrum von hACOD1 (PDB-ID: 6R6U)2. f, Die C1- und C4-Carboxylgruppen von Citraconat werden durch ein Netzwerk elektrostatischer Anziehung optimal im aktiven Zentrum verankert; das heißt, Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrücken (gestrichelte Linien) mit den Resten His159, Lys207, Lys272 und Leu278. Elektrostatische Proteinoberfläche am aktiven Zentrum: positiv (blau), negativ (rot) und neutral (weiß). g, Zweidimensionale Ligandenwechselwirkungen. h, Molekulare Modellierung von Itaconat (gelb) im Vergleich zu cis-Aconitat (magenta), die weniger Wechselwirkungen zwischen den beiden Carboxylgruppen von Itaconat und den basischen Resten des aktiven Zentrums von hACOD1 zeigt, hauptsächlich aufgrund seiner nichtplanaren und flexiblen Struktur. CI, Konfidenzintervalle; Citra, Citraconat.

Um die zelluläre Kinetik der Auswirkungen der ACOD1-Hemmung in einem klassischen Modell der Makrophagenaktivierung zu untersuchen, führten wir ein 36-stündiges Zeitverlaufsexperiment zur LPS/IFN-γ-Aktivierung von dTHP1-Zellen in Gegenwart von zwei verschiedenen Citraconatkonzentrationen und gemessenen Konzentrationen durch von TCA-Zwischenprodukten, Itaconat und Mesaconat. PCA zeigte relativ milde Auswirkungen einer 6-stündigen Vorbehandlung mit Citraconat auf nicht stimulierte Zellen, jedoch eine fortschreitende TCA-Neuprogrammierung während der LPS/IFN-γ-Stimulation (Abb. 4a). Bemerkenswert ist, dass Citraconat-Behandlungen dazu neigten, die durch LPS/IFN-γ verursachten Veränderungen umzukehren, was größtenteils (aber nicht ausschließlich) auf die Verhinderung der Itaconat- und Mesaconat-Akkumulation zurückzuführen war. Insbesondere in unbehandelten stimulierten Zellen akkumulierte Itaconat schnell und erreichte nach 12 Stunden seinen Höhepunkt, wohingegen 1 mM Citraconat Itaconat im Wesentlichen verhinderte und die Mesaconat-Akkumulation stark reduzierte (Abb. 4b, c). Die hemmende Wirkung von Citraconat hielt über 36 Stunden an, was mit den konstanten intrazellulären Citraconatspiegeln über den gesamten Zeitverlauf übereinstimmte (Abb. 4d). Unerwarteterweise ging der Mangel an Itaconat-Synthese zu frühen Zeitpunkten nicht mit einem Anstieg der cis-Aconitat-Spiegel einher, was möglicherweise auf die verringerte Verfügbarkeit seines Vorläufercitrats zurückzuführen ist (Abb. 4g, i). Beide Citraconatkonzentrationen reduzierten den Laktatspiegel; Insbesondere führte die Konzentration von 0,1 mM zu einem moderaten Rückgang der Succinatspiegel und des Succinat/Fumarat-Verhältnisses, was auf einen leichten Anstieg der SDH-Aktivität aufgrund der Linderung der SDH-Hemmung durch endogenes Itaconat schließen lässt. Der gemessene IC50-Wert von intrazellulärem Citraconat für die ACOD1-Katalyse (ergänzende Abbildung 5a – c) stimmte gut mit den im zellfreien Assay gemessenen Werten überein (Abb. 3c).

dTHP1-Zellen wurden mit LPS (200 ng ml–1) und IFN-γ (400 U ml–1) für die angegebenen Zeiten in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,1, 1, 5, 10 und 25 mM Citraconat stimuliert. Als zusätzliche Kontrolle dienten nicht stimulierte dTHP1-Zellen, die 6 Stunden lang behandelt wurden. Itaconat-Isomere, Laktat und die gleichen TCA-Zwischenprodukte wie in Abb. 1 wurden mittels LC-MS/MS gemessen. Konzentrationen von 0,1 und 1 mM Citraconat im Medium führten zu einer starken ACOD1-Hemmung bei physiologisch plausiblen intrazellulären Citraconat-Konzentrationen und wurden daher für die in a–l gezeigten Analysen verwendet. Die mit den Konzentrationen von 5–25 mM erhaltenen Daten wurden zusätzlich zur Berechnung der IC50-Werte verwendet. a, PCA basierend auf allen Analyten außer Citraconat. b–e, Zeitlicher Verlauf der Konzentrationen von Itaconat (b), Mesaconat (c), Citraconat (d) und Succinat/Fumarat-Verhältnis (e). f–l, Konzentrationen von Laktat und ausgewählten TCA-Zwischenprodukten. m–o, ACOD1-Hemmung durch Citraconat hat keinen starken Einfluss auf die Entzündung in durch LPS-IFN-γ aktivierten dTHP1-Zellen. Versuchsaufbau identisch mit a–l. Die Konzentrationen der angegebenen mRNAs wurden 12 Stunden nach der Stimulation mittels RT-qPCR gemessen. m, CXCL10-mRNA. n, IL-6-mRNA. o, IL-1β-mRNA. Citra, Citraconsäure; Ita, Itaconsäure. b–o, n = 3 biologische Replikate, Mittelwert ± Standardabweichung *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett.

In Anbetracht der Tatsache, dass die ACOD1-Hemmung auf wesentlich niedrigere Citraconatkonzentrationen zurückzuführen ist als die immunmodulatorischen Wirkungen (0,03–1 mM gegenüber 10–25 mM), haben wir dann getestet, ob die niedrigere Konzentration zu einem entzündungsbedingten Phänotyp führen würde, der wahrscheinlich auf eine pharmakologische Aufhebung zurückzuführen wäre der endogenen Itaconatsynthese. Zu diesem Zweck haben wir dTHP1-Zellen mit LPS/IFN-γ aktiviert, was zu einer maximalen Aktivierung und einer viel höheren ACOD1-Expression führt als eine Infektion mit Viren wie IAV. Obwohl die LPS/IFN-γ-Stimulation zu einer starken Hochregulierung von IL-1β, IL-6 und CXCL10-mRNA führte, hatte die Behandlung mit 1 mM Citraconat oder 1 mM Itaconat (verwendet als Kontrolle, die ACOD1 nicht hemmt) keinen Einfluss auf CXCL10 und IL -1β-mRNA in nennenswertem Ausmaß. Im Gegensatz dazu verringerte die 25-mM-Konzentration beider Isomere die IL-6-mRNA-Spiegel (Abb. 4m–o). Somit hatte die pharmakologische Hemmung der endogenen Itaconsäuresynthese durch niedrig dosiertes Citraconat keinen großen Einfluss auf den Entzündungsphänotyp maximal aktivierter dTHP1-Zellen, wohingegen bei der höheren (immunmodulatorischen) Konzentration eine Verringerung der IL-6-mRNA beobachtet wurde. In einem separaten Experiment haben wir dann getestet, ob niedrige/hohe Konzentrationen der beiden Isomere die Mitochondrienatmung beeinflussen würden. Itaconat bei 25 mM, aber nicht Citraconat, reduzierte die maximale Atmung und die Reservekapazität von nicht stimulierten dTHP1-Zellen oder dTHP1-Zellen, die mit LPS/IFN-γ stimuliert wurden (Extended Data Abb. 8), was mit einem verringerten Fluss durch die Elektronentransportkette vereinbar war SDH-Hemmung und stimmte gut mit unserer Beobachtung überein, dass Citraconat SDH nicht hemmt (Extended Data Abb. 4). Die LPS/IFN-γ-Stimulation reduzierte die Basalatmung, die maximale Atmung und die freie Atemkapazität, und 1 mM Citraconat normalisierte tendenziell die maximale Atmung und freie Atemkapazität, während 25 mM Citraconat tendenziell nur die freie Atemkapazität normalisierte. Die Wirkung von niedrig dosiertem Citraconat könnte durch ein Modell erklärt werden, bei dem die ACOD1-Hemmung zu einer verringerten endogenen Itaconat-Akkumulation führt, was wiederum den Elektronenfluss erhöht, indem es die Itaconat-vermittelte SDH-Hemmung aufhebt.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Meaconat und Citraconat bisher unterschätzte nahe Verwandte von Itaconat sind, die biologisch relevante, einzigartige und gemeinsame Wirkungen auf Stoffwechsel, Entzündungen und Virusinfektionen haben. Die grafische Zusammenfassung und die erweiterte Datentabelle 1 fassen die wichtigsten Merkmale der drei Isomere zusammen und vergleichen sie. Die beobachteten Wirkungsunterschiede sind wahrscheinlich auf Unterschiede in den elektrostatischen Wechselwirkungen, sterischen Eigenschaften und der Elektrophilie zurückzuführen, die wiederum durch die Nukleophilie potenziell Partner-Michael-Donoren beeinflusst werden könnten. Die ausgeprägten Unterschiede zwischen den drei Isomeren bei der Hemmung von ACOD1 (Citraconat) oder SDH (Itaconat) veranschaulichen die Auswirkungen elektrostatischer und sterischer Unterschiede, und die größere Fähigkeit von Citraconat, NRF2 zu induzieren, ist wahrscheinlich auf seine stärkere Elektrophilie zurückzuführen. Letzteres könnte auch seine größere Wirkung auf die IAV-Produktion aus A549-Zellen erklären, da gezeigt wurde, dass die Hemmung über den Exportin-1-Weg durch Verbindungen, die auf einem Itaconat-Rückgrat basieren, den Export von viralem Ribonukleoprotein in das Zytoplasma durch SH-Alkylierung eines kritischen Cys-Rests hemmt9 . Citraconat kann daher aufgrund seiner größeren Fähigkeit, diesen Rest zu alkylieren, die stärkste Verringerung der IAV-Replikation in A549-Zellen bewirken. Es wurde vermutet, dass Itaconat durch die Hemmung von SDH26 eine antivirale Wirkung ausübt, es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die SDH-Hemmung bei der Anti-Influenza-Wirkung der drei Isomere eine Rolle spielt, da Citraconat (das SDH nicht hemmt) die IAV-Replikation am effizientesten hemmte .

Wir haben Citraconat als ersten endogenen ACOD1-Inhibitor identifiziert, die physiologischen Konsequenzen auf der Ebene des Organismus sind jedoch noch unbekannt. Bei gesunden Mäusen fanden wir zuvor die höchsten Citraconatspiegel in Lymphknoten5. Obwohl die Zelltypen, die Citraconat enthalten, unbekannt sind, ist es verlockend zu spekulieren, dass es Immunprozesse in Lymphknoten modulieren könnte, indem es ACOD1 hemmt. Da es keine Hinweise darauf gibt, dass Citraconat in myeloischen Zellen vorkommt, müsste eine solche ACOD1-Hemmung wahrscheinlich auf parakrinem Weg erfolgen. Auch seine Rolle als endogener NRF2-Agonist bedarf weiterer Untersuchungen, insbesondere weil die Zelltypen, die Citraconat in vivo beherbergen, nicht bekannt sind. Da Citraconat in aktivierten dTHP1-Zellen nicht nachgewiesen wurde, halten wir es für unwahrscheinlich, dass es eine wichtigere Rolle bei der NRF2-Signalübertragung in Makrophagen spielt als Itaconat. Unsere Ergebnisse untermauern ein zuvor formuliertes Modell, dass Mesaconat von Itaconat abgeleitet ist6,7 (siehe auch den Begleitartikel von He et al.27), aber über den/die physiologischen Ursprung(e) von Citraconat beim Menschen kann nur spekuliert werden. Wir zeigen, dass es nicht von Itaconat oder Mesaconat abgeleitet ist. Basierend auf Studien an Patienten mit Methylmalonazidurie wurde vermutet, dass es sich um ein Derivat des BCAA Isoleucin über Tiglyl-CoA8 handelt. Der BCAA-Metabolismus ist eine entscheidende Komponente der Energie- und Immunhomöostase, und Citraconat könnte daher Teil des regulatorischen Netzwerks sein, das den BCAA-Metabolismus steuert. Insgesamt scheint Citraconat das Isomer mit dem größeren Potenzial für die translationale Arzneimittelentwicklung zu sein. Seine vielfältigen Eigenschaften wie entzündungshemmende, antioxidative und antivirale Eigenschaften machen es zu einem besonders attraktiven Rückgrat für die Entwicklung pharmakologisch optimierter Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, die durch Entzündungen, Virusinfektionen oder beides ausgelöst werden. Die pharmakologische Relevanz der ACOD1-Hemmung durch Citraconat muss in vivo noch untersucht werden. Unsere Studien mit niedrig dosiertem (1 mM) Citraconat legen nahe, dass die Aufhebung der endogenen Itaconatsynthese möglicherweise keinen großen Einfluss auf die maximale Aktivierung menschlicher Makrophagen hat, zumindest in Bezug auf CXCL10-, IL-6- und IL-1β-mRNA. Die meisten Arbeiten zur Rolle von endogenem Itaconat wurden an Mäusen durchgeführt, und es wurden sowohl hyper- als auch hypoinflammatorische Phänotypen von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen von ACOD1-/-Mäusen beschrieben28,29. Darüber hinaus ist murines ACOD1 viel aktiver als das menschliche Enzym, was zu fünf- bis zehnfach höheren Itaconatspiegeln in aktivierten Makrophagen im Vergleich zu Menschen führt1,2. Es ist daher möglich, dass ACOD1 bei der Regulierung von Entzündungen beim Menschen eine weniger wichtige Rolle spielt als bei Mäusen. Darüber hinaus können sich die Folgen der ACOD1-Hemmung möglicherweise erst auf der Ebene des Organismus vollständig manifestieren und sind in Zellmodellen möglicherweise nicht erkennbar. Tatsächlich haben wir kürzlich herausgefunden, dass sich die CXCL10-Expression in IAV-infizierten Makrophagen aus dem Knochenmark zwischen Wildtyp- und ACOD1–/–-Mäusen nicht unterschied, wohingegen die histologisch beurteilte Lungenentzündung bei ACOD1–/–-Mäusen signifikant höher war10. Im Gegensatz zu Entzündungen hatte niedrig dosiertes Citraconat eine deutliche Wirkung auf die Zwischenprodukte des TCA-Zyklus und neigte dazu, die Mitochondrienatmung in mit LPS/IFN-γ stimulierten dTHP1-Zellen zu verbessern. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Akkumulation von Itaconat mit einer Immunlähmung korreliert, wie sie beispielsweise bei Sepsis auftritt30. Citraconat-Derivate können sich daher bei der Behandlung von Patienten mit Sepsis im Endstadium oder anderen Szenarien, die durch eine Erschöpfung der angeborenen Immunität gekennzeichnet sind, als nützlich erweisen. Darüber hinaus könnte sich Citraconat angesichts der protumorigenen Wirkung von ACOD1 als nützliches Gerüst für die Entwicklung von ACOD1-Inhibitoren für die Krebstherapie erweisen.

Unsere Ergebnisse zu Mesaconat ergänzen die im Begleitpapier von He et al.27 berichteten Ergebnisse. Mithilfe einer durch stabile Isotope unterstützten Stoffwechselflussanalyse zeigen diese Autoren, dass Mesaconat tatsächlich ein Katabolit von Itaconat ist. Sie berichten über immunmodulatorische Wirkungen von Mesaconat in murinen Makrophagen, die weitgehend Nrf2-unabhängig zu sein scheinen, und sie zeigen positive Wirkungen von Mesaconat in einem Mausmodell der LPS-induzierten Sepsis. Darüber hinaus zeigen sie, dass Itaconat ein viel stärkerer SDH-Hemmer ist als Mesaconat. Ihre Ergebnisse unterscheiden sich jedoch von unseren darin, dass sie bei der Analyse ganzer Zellen eine gewisse SDH-Hemmung durch Mesaconat feststellen. Die Unterschiede zwischen den Beobachtungen von He et al. und von uns kann auf Unterschiede in den verwendeten Arten und Tests zurückzuführen sein. Dennoch deuten die Ergebnisse beider Arbeiten zusammengenommen darauf hin, dass die SDH-Hemmung durch Mesaconat wahrscheinlich keine starken biologischen Auswirkungen hat.

hACOD1 (Aminosäuren 4–461) und macOD1 (Aminosäuren 4–462) wurden in Escherichia coli produziert, wie zuvor beschrieben2 gereinigt und in GF-Puffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 10 % v/v Glycerin, 150 mM NaCl) gelagert ). Die Tests wurden dreifach durchgeführt. Enzyme in 46,6 µl GF-Puffer (30 µg mACOD1 oder 90 µg hACOD1) oder 46,6 µl GF-Puffer ohne Enzym wurden mit 3,3 µl 15 oder 150 mM cis-Aconitat (pH 6,5) gemischt, was zu endgültigen cis-Aconitat-Konzentrationen führte 1 oder 10 mM. Die Tests (50 μl) wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und dann auf Eis gestellt. Zur Extraktion organischer Säuren wurden dann 800 µl Extraktionslösungsmittel (Acetonitril/Methanol 1:1) zur Reaktion gegeben und das resultierende Volumen in ein frisches Röhrchen überführt. Die nun leeren Reaktionsröhrchen wurden mit Wasser (150 µl) gespült, das anschließend zu den Röhrchen mit dem Aktivitätstest in Extraktionslösungsmittel gegeben wurde, was zu einem Endvolumen von 1000 µl führte. Die Proben wurden 30 s lang gemischt und bei –80 °C gelagert.

Eine Reihe von Carbonsäuren (Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Citraconsäure, (2E)-2-Ethylbut-2-endisäure (EN300-234639, Enamin), DL-Isocitronensäure und Transaconitsäure) wurden untersucht als potenzielle Inhibitoren. Die Säuren wurden in Wasser gelöst und neutralisiert. Enzymtests wurden in Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, mit 2 mM cis-Aconitat und 10 mM des potenziellen Inhibitors durchgeführt. Pro 150-µl-Assay wurde die Enzymmenge verwendet, die etwa die Hälfte des Substrats decarboxylieren würde (20 µg Aspergillus ACOD1, Aminosäuren 12–490, 24 µg hACOD1 und 5 µg mACOD1). Itaconat wurde mithilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wie unten beschrieben quantifiziert.

Mensch, Maus und Aspergillus ACOD1 wurden wie zuvor beschrieben2 hergestellt und in GF-Puffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 10 % v/v Glycerin, 150 mM NaCl) gelagert. Lösungen des Inhibitors (Citraconsäure; Acros) und des Substrats (cis-Aconitsäure; Sigma-Aldrich), beide pH 6,5 (NaOH), wurden bei –20 °C gelagert. Für den Test wurden 125 μl 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, auf Eis mit 5 μl Enzym, 10 μl Citraconat (oder 10 μl Wasser) und 10 μl cis-Aconitat gemischt. Die Endkonzentrationen des Inhibitors betrugen 50, 100 und 200 µM. Die folgenden Kombinationen aus Enzymmenge und Substratkonzentration wurden verwendet: 2 µg hACOD1 oder 0,4 µg mACOD1 mit 0,1, 0,2 oder 0,5 mM Substrat; 3 µg hACOD1 oder 0,6 µg MACOD1 mit 1 oder 2 mM Substrat; 5 µg hACOD1 oder 1 µg MACOD1 mit 5 oder 10 mM Substrat. Die Tests wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Der Inkubation bei 37 °C für 10 Minuten folgte unmittelbar eine Hitzeinaktivierung des Enzyms bei 95 °C für 3 Minuten. Der Proteinniederschlag wurde durch einstündiges Zentrifugieren pelletiert. Die Überstände wurden mit 100 μl 100 mM H3PO4 angesäuert. Itaconsäure wurde mittels HPLC gemessen (Shodex RSpak DE-413-Säule, 1 ml min−1 10 mM H3PO4, Injektionsvolumen 10–20 µl, Detektion bei 210 nm). Die resultierenden Kurven wurden mit GraphPad Prism mit der Gleichung v = kcat[S]/(KM(1 + [I]/Ki) + [S]) angepasst (wobei v = Geschwindigkeit, kcat = katalytische Geschwindigkeitskonstante, KM = Michaelis- Menten-Konstante, Ki = Inhibitorkonstante) mit den unabhängigen Variablen Inhibitorkonzentration [I] und Substratkonzentration [S].

Die SDH-Hemmung wurde mit dem MitoCheck Complex II Activity Assay Kit (Cayman) getestet. Das Kit enthält Reagenzien zur Messung der SDH-Aktivität in Mitochondrien des Rinderherzens. Itaconat, Citraconat und Mesaconat wurden mit NaOH (pH 7,4–7,7) neutralisiert und in Konzentrationen von 10 mM, 3 mM, 1 mM, 0,25 mM, 50 µM und 10 µM getestet. Als Positivkontrolle wurde der SDH-Inhibitor Dinatriummalonat verwendet. Der Assay wurde in einer 96-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Hemmung der Mitochondrienkomplexe I, III und IV durch 1 µM Rotenon, 10 µM Antimycin A bzw. 1 mM KCN ​​durchgeführt.

Eine humane akute monozytische Leukämie-Zelllinie (THP1, DSMZ-Nr. ACC 16) wurde in RPMI 1640 (Gibco, Katalog-Nr. 31870-025) kultiviert, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum Advanced (FBS-11A; Capricorn Scientific). und 1 % GlutaMAX-I (100×; Gibco, Katalog-Nr. 35050-038), bei 5 % CO2 und 37 °C. Etwa 5 × 105 Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen (Falcon) ausgesät und dann in adhärente Makrophagen differenziert. Die Zellen wurden mit 125 ng ml-1 Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P8139) 48 Stunden lang in RPMI-Komplettmedium stimuliert, bevor das Medium aufgefrischt wurde. Anschließend ließ man die Zellen einen weiteren Tag lang weiter differenzieren. Die Differenzierung wurde morphologisch mittels Mikroskopie und Durchflusszytometrie hinsichtlich der Expression von CD14 und CD11c verifiziert. Menschliche Adenokarzinomzellen, die Alveolarepithelzellen vom Typ II ähneln (A549, ACC107, erhalten von DSMZ), wurden in DMEM-Medium vermehrt, das mit 10 % FCS und 1 % GlutaMAX-I ergänzt war. Die menschliche Keratinozyten-Zelllinie HaCaT wurde von T. Werfel (Medizinische Hochschule Hannover)31 bereitgestellt und in RPMI 1640 (Gibco, Katalog-Nr. 21875-034), ergänzt mit 10 % FCS, bei 5 % CO2 und 37 °C kultiviert. NRF2–/– HaCaT-Zellen werden in Lit. beschrieben. 32. Alle Zelllinien wurden mit dem Venor GeM Classic Mycoplasma-Nachweiskit für konventionelle PCR (Minerva Biolabs, Katalog-Nr. 11-1100) auf Mykoplasmenkontamination getestet.

dTHP1-Zellen wurden 6 oder 24 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von Itaconat (0,125, 5, 10 und 25 mM), Mesaconat oder Citraconat (5, 10 und 25 mM) in 1 ml RPMI inkubiert. Nach vollständiger Entfernung des Mediums und sorgfältigem Waschen (ein- bis dreimal) der Zellen und Vertiefungsränder mit 1 ml PBS wurden die Zellen mit 1 ml eiskaltem Extraktionspuffer (Acetonitril/Methanol/Wasser, 2:2:1) extrahiert. mit internen Standards gemischt, anschließend 30 s lang gemischt und bei –20 °C für die Kurzzeitlagerung und –80 °C für die Langzeitlagerung aufbewahrt. Für das LPS/IFN-γ-Kostimulationsexperiment wurden dTHP1-Zellen mit 200 ng ml-1 LPS (Sigma, Katalog-Nr. L6511) und 400 U ml-1 menschliches IFN-γ (PeproTech, Katalog-Nr. 300-02) behandelt ) für 0, 6, 12, 18, 24, 30 und 48 Stunden und dann mit 1 ml eiskaltem Extraktionspuffer extrahiert, wie zuvor beschrieben5.

Wir haben ein 2.962 bp großes Fragment (7.347–10.308) gelöscht, das einen Teil von Exon 4 und das gesamte Exon 5 umfasst. THP1-Zellen wurden vorübergehend mit zwei EF1α-Cas9-2A-EGFP/U6-guideRNA-Expressionsplasmiden elektroporiert (1250 V, 50 ms, 1 Puls; 5 × 106 Zellen ml−1, 50 µg ml−1 jedes Plasmid), unter Verwendung des Neon Transfection System (ThermoFisher Scientific)33, eines mit einer Guide-RNA, die gegen ACOD1-Exon 4 (5′-CCATGGATTTTGATGACACG-3′) gerichtet ist. und die andere enthält eine Guide-RNA, die gegen die 3′-untranslatierte Region des ACOD1-Locus (5′-CATGAGCCTCAAGGTTTTAG-3′) gerichtet ist. Die Zellen wurden nach 18 Stunden nach verstärkter grün fluoreszierender Proteinexpression sortiert und mittels begrenzter Verdünnung als Einzelzellkolonien ausgesät. Nach der Expansion wurden ACOD1–/–-defiziente Klone durch genomische PCR und Sanger-Sequenzierung identifiziert. Der Knock-out wurde verifiziert, indem das Fehlen von ACOD1-Protein durch Immunoblot (ergänzende Abbildung 6b) und das Fehlen einer Itaconatsynthese durch Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) bestätigt wurde (erweiterte Daten, Abbildung 2a).

Etwa 5 × 105 dTHP1-Zellen wurden mit dem IVA (H1N1)-Stamm PR8M bei einer Infektionsmultiplizität von 1 infiziert. Im Falle der Behandlungen wurden die Zellen 12 Stunden lang mit pH-angepasstem Puffer, der Itaconat, Mesaconat, Citraconat und enthielt, vorinkubiert /oder 4-Octylitaconat in den in den Abbildungen angegebenen Konzentrationen und wurden dann mit dem Virus 2 Stunden lang in frischem Medium inkubiert, um die Virusbindung und den Eintritt in die Zellen zu ermöglichen. Anschließend wurde das Infektionsmedium durch frisches pH-angepasstes Medium ersetzt, das die Behandlungsverbindung in der angegebenen Konzentration enthielt. Zwölf Stunden nach der Infektion wurden die Zellen in Puffer gewaschen, pelletiert und die RNA für die anschließende Analyse der mRNA-Expression durch quantitative PCR mit umgekehrter Transkription (RT-qPCR) unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführten Primersequenzen extrahiert. Die CXCL10-Konzentrationen in den Zellüberständen betrugen gemessen mit dem Human CXCL10 Standard ABTS ELISA Development Kit (PeproTech, Katalog-Nr. 900-K39). Die Zytokin-/Chemokinkonzentrationen in Überständen wurden unter Verwendung des humanen 27-Plex-Zytokin-Panels (Bio-Rad, Katalog-Nr. 171-A1112) gemessen, wie in Lit. beschrieben. 10, aus der der folgende Text verwendet wurde: „Standardkurven wurden mit acht zweifachen Reihenverdünnungen ausgehend von 32 ng/ml erstellt. 100 μl Testpuffer wurden in jede Vertiefung einer Mikrofiltrationsplatte gegeben, gefolgt von der Zugabe von 50 μl der Perlensuspension. Nach dem Waschen der Perlen mit Testpuffer wurden 50 μl Standard oder die Probe (Überstand) in jede Vertiefung gegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) unter leichtem Schütteln inkubiert. 25 μl Antikörper-Vormischung für den Nachweis wurden hinzugefügt In jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei RT unter leichtem Schütteln. Drei Waschschritte wurden mit 50 μl Testpuffer in jeder Vertiefung durchgeführt, gefolgt von einem 10-minütigen Waschen mit Streptavidin-Lösung bei RT unter Schütteln. Abschließendes Waschen mit 125 μl Die Messung des Testpuffers wurde vor der Quantifizierung mit der BIO-PLEX Manager-Software Version 4 durchgeführt.“ IL-7 und IL-13 wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen, da die Konzentrationen in den meisten Proben unterhalb der Nachweisgrenze lagen.

Wie zuvor beschrieben34, wurden MDCK-II-Zellen (American Tissue Culture Collection, Katalog-Nr. CRL-2936) in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert und über Nacht bei 37 °C in einem angefeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 gezüchtet. Die zu 90 % konfluenten Zellen wurden einmal mit PBS++ (1× PBS mit Ca2+, Mg2+, 0,3 % BSA (Sigma) und Penicillin-Streptomycin (Invitrogen)) gewaschen und die Zellen wurden mit den 10-fachen seriellen Virusprobenverdünnungen infiziert und bei Raum inkubiert Temperatur für 1 Stunde. Das Virusinokulum wurde abgesaugt und 150 µl 1,25 % Avicel mit 1 µg Np-Tosyl-L-phenylalanylchlormethylketon-behandeltem Trypsin pro ml wurden in jede Vertiefung gegeben und 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit PBS++, das 3,7 % Formaldehyd und 1 % Triton X-100 enthielt, fixiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS/Tween-20 (0,05 %) gewaschen und dann mit primärem Antikörper (monoklonales Anti-IAV-NP-Maus-IgG, Hybridomüberstand 1:100 verdünnt; bereitgestellt von S. Ludwig, Universität Münster) bei inkubiert Raumtemperatur für 1 Stunde. Die Zellen wurden dann dreimal gewaschen und mit Ziegen-Anti-Maus-Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem IgG (Invitrogen A16072) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma) wurde als Substrat für die Immunfärbung verwendet und 30–60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach deutlicher Entwicklung der rotgefärbten Herde wurden diese gezählt, um den Virustiter in fokalbildenden Einheiten (FFU) unter Verwendung der Gleichung FFU ml−1 (Stamm) = (1/Virusverdünnung) × (Anzahl der Herde) × zu bestimmen (Verdünnungsfaktor).

Die Verwendung von menschlichem Gewebe wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt (Aktenzeichen 2923-2015) und alle Spender gaben ihre Einwilligung zur Verwendung des Gewebes für Forschungszwecke. Explantiertes Lungengewebe von Patienten mit einer klinischen Indikation für eine Lungentransplantation wurde in Stücke von etwa 30 mg geteilt und im Wesentlichen wie in Lit. beschrieben kultiviert und infiziert. 10. Die Gewebe wurden vor Beginn des Experiments bis zu 20 Stunden lang in RPMI-Puffer aufbewahrt. Gewebestücke wurden 14–19 Stunden lang mit pH-angepasstem Puffer, der die Verbindung oder nur Puffer enthielt, vorbehandelt und dann weitere 24 Stunden lang in RPMI-Infektionsmedium, das IAV (2 × 105 FFU ml–1) und Verbindung oder nur Puffer enthielt, inkubiert. Es wurden jeweils drei Stücke von fünf Spendern (drei Emphyseme, drei idiopathische Lungenfibrose; zwei männlich, drei weiblich; Alter 58–66 Jahre) verwendet.

Die Zellen wurden einmal in eiskaltem PBS gewaschen und in eiskaltem RIPA-Puffer (enthaltend Protease- und Phosphataseinhibitor) lysiert. Nach der Quantifizierung des Proteins durch den Bradford-Assay wurde ein gleiches Volumen 2× Laemmli-Probenpuffer hinzugefügt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 95 °C hitzedenaturiert. Proteinextrakte wurden durch Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine 0,2 µm NC-Nitrozellulose-Blotmembran (GE Healthcare, Katalog-Nr. 10600004) übertragen. Die unspezifische Bindung wurde mit 5 % fettfreier Trockenmilch blockiert und die Banden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz mit primären Antikörpern sichtbar gemacht, die spezifisch für STAT1 (Santa Cruz Biotechnology, Katalog-Nr. sc-345; verdünnt 1:500), Phospho-STAT1 ( Cell Signalling, Katalog-Nr. 9167S; verdünnt 1:1.000), NRF2 (Cell Signalling, Katalog-Nr. 12721S; verdünnt 1:1.000), gefolgt von einer Inkubation mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG–HRP (Southern Biotech, Katalog-Nr. 4030- 05). β-Actin wurde mit HRP-konjugiertem Anti-β-Actin-Antikörper (Abcam, Katalog-Nr. ab49900) oder β-Actin-Antikörper (C4) monoklonalem Maus-Antikörper IgG1 (Santa Cruz Biotechnology, Katalog-Nr. sc-47778) sichtbar gemacht. Membranen wurden unter Verwendung des Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Katalog-Nr. RPN2232) entwickelt. Zur Abbildung der Membran wurde ein iNTAS-Western-Blot-Imager (iNTAS Science Imaging) verwendet.

dTHP1-Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 12 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen wurden 12 Stunden lang mit den Behandlungen vorinkubiert, mit IAV infiziert (Infektionsmultiplizität von 1) und mit frischem Medium, das die Behandlungen enthielt, inkubiert. Die mitochondrialen ROS-Werte wurden 12 Stunden nach der Infektion gemessen. Die Zellen wurden 5 Minuten lang mit Medium inkubiert, das 5 μM MitoSox Red (mitochondrialer Superoxidindikator; ThermoFisher Scientific, Katalog-Nr. M36008) enthielt, und dann mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in kaltem PBS resuspendiert und die mitochondrialen ROS-Spiegel wurden über den Phycoerythrin-Kanal unter Verwendung eines BD LSR-II-Durchflusszytometers gemessen.

HaCaT-Zellen (1,5 × 105) wurden über Nacht in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät und dann 16 oder 17,5 Stunden lang mit den angegebenen Konzentrationen von Itaconat, Mesaconat und Citraconat behandelt. Die Zellen wurden dann in Puffer gewaschen, pelletiert und die RNA wurde für mRNA-Messungen mittels RT-qPCR unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführten Primersequenzen extrahiert. Die NRF2-Stabilisierung wurde durch Immunblot bewertet (siehe oben).

Etwa 2,5 × 104 THP1-Zellen wurden in eine 96-Well-Platte (Falcon) ausgesät und dann in adhärente Makrophagen differenziert. Die Zellen sollten vor Beginn des Tests zu 80–100 % konfluent sein. MTT-Reagenzienstamm (Life Technologies, Katalog-Nr. M6494; 5 mg ml−1 in PBS) wurde 1:10 in RPMI-Komplexmedium bei 37 °C verdünnt. Nach Entfernung des Überstands wurden 50 µl der vorbereiteten Verdünnung zu den Zellen gegeben und 20–60 Minuten bei 37 °C inkubiert, wobei die Farbe der Zellen regelmäßig beobachtet wurde. Nach Abschluss der Färbung wurde das Reagens entfernt und 50 µl Dimethylsulfoxid (Merck) hinzugefügt. Nach 5–15-minütigem Mischen auf einem Schüttler (bis die Lösung homogen war) wurde die Farbänderung mit einem Enzymimmunoassay-Lesegerät (BioTek Synergy 2) quantifiziert, wobei 540/570 nm als Messwellenlänge und 630 nm als Messwellenlänge verwendet wurden Referenzwellenlänge.

Das Mausmodell wurde im Wesentlichen wie in Lit. beschrieben durchgeführt. 35, aus dem Teile des folgenden Textes verwendet wurden: „Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Luxemburg und den entsprechenden Regierungsbehörden genehmigt. Die Tierversuche der vorliegenden Studie wurden gemäß ARRIVE durchgeführt und berichtet.“ (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) Richtlinien zur Verbesserung des Designs, der Analyse und der Berichterstattung von Tierversuchen, zur Maximierung der veröffentlichten Informationen und zur Minimierung unnötiger Studien. Es wurden drei bis vier Monate alte männliche und weibliche C57BL/6N-Mäuse gewonnen von Charles River Laboratories (Frankreich). Die Mäuse wurden in einem 12-stündigen Licht-/Dunkel-Zyklus gehalten, mit sterilem Futter und Wasser nach Belieben. Die Mäuse waren frei von spezifischen Krankheitserregern, wurden in individuell belüfteten Käfigen mit maximal 5 pro Käfig gehalten und bei einer Temperatur von 100 °C gehalten Temperatur von 22 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 %. Sie wurden auf autoklavierter Maiskolbeneinstreu gehalten und mit SAFE Diets gefüttert, die mit mindestens 25 kGy bestrahlt wurden. Das Bewässerungssystem bestand aus Umkehrosmosewasser mit 2 ppm Chlor. Mäuse wurden mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von LPS (4 μg LPS/g Körpergewicht) oder PBS als Vehikelkontrolle behandelt. Mäuse wurden 0, 12, 24 und 48 Stunden nach der LPS-Injektion mit einer Kombination aus Ketamin (100 mg/ml; Nimatek Vet) und Dorben (Medetomidinhydrochlorid; 1 mg/ml; Dorbene Vet) tief anästhesiert. Die Milzen wurden nach transkardialer Perfusion mit eiskaltem PBS präpariert, in eiskaltem HBSS (Gibco/Life Technologies) mit 1 M HEPES (Gibco/Life Technologies) und 0,5 % D-(+)-Glucose (Sigma-Aldrich) gesammelt und dann in flüssigem Stickstoff gelagert.“

Die Messungen wurden gemäß unserem validierten Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Assay (HPLC-MS/MS) durchgeführt5. Kurz gesagt, die Proben wurden in 1.000 µl Extraktionsreagenz (Methanol/Acetonitril/Wasser mit einem Endverhältnis von 2:2:1 v/v/v; versetzt mit 0,1 µM 13C2-Citrat und 13C5-Itaconat, 0,2 µM 13C6-cis) extrahiert -Aconitat und 13C4-Succinat sowie 1 µM 13C3-Lactat als interne Standards). Die Suspensionen wurden in 2-ml-Safe-Lock-Reaktionsröhrchen (Eppendorf, Katalog-Nr. 0030120094) überführt, 30 Sekunden lang gevortext und über Nacht bei –20 °C eingefroren, um die Proteinfällung abzuschließen. Anschließende Probenvorbereitung und HPLC-MS/MS-Assay unter Verwendung einer Kinetex C18-Umkehrphasensäule (Phenomenex, Katalog-Nr. 00D 4462 Y0) auf einem Nexera-Chromatographiesystem (Shimadzu), gekoppelt an ein QTRAP5500-Triple-Quadrupol-/Linear-Ionenfallen-Massenspektrometer (Sciex). ) wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt5.

Zellmetaboliten wurden wie in Lit. beschrieben extrahiert. 36, unter Verwendung von 6 × 106 Zellen pro Probe. Die Konzentrationen von Aminosäuren (n = 20), Aminosäuremetaboliten (n = 30), biogenen Aminen (n = 9), Succinat und Laktat wurden auf einem AB SCIEX 5500 QTrap-Massenspektrometer (Ab Sciex) unter Verwendung des MxP Quant gemessen 500-Kit (Biocrates Life Sciences) gemäß den Protokollen des Herstellers (https://biocrates.com/mxp-quant-500-kit). Verhältnisse und Summen der Analyten („Metabolitenindikatoren“) wurden mit der MetaboIndicator-Software (Biocrates) berechnet.

Die Sauerstoffverbrauchsrate wurde mit einem Seahorse XF-96-Analysegerät (Agilent) und dem Mito-Stresstest-Kit (Agilent, Katalog-Nr. 103015-100) gemäß den Protokollen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, 2,5 × 104 THP1-Zellen wurden auf Zellkultur-Mikroplatten Agilent Seahorse Am Tag des Tests wurde das Zellkulturmedium durch Seahorse 103578-100) und 2 mM Glutamin (Gibco, Katalog-Nr. 35050-038) gemischt und vor dem Test 45–60 Minuten lang in einen CO2-freien Inkubator mit 37 °C gestellt. Nach dem Laden in den Seahorse XF-96-Analysator wurde die sequentielle In-situ-Inkubation der Komponenten wie folgt durchgeführt: Basislinienmessung für 18 Minuten, 1,5 µM Oligomycin (Agilent) für 18 Minuten, 1 µM Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (Agilent) für 18 Minuten min und 0,5 µM Rotenon/Antimycin A (Agilent) für 18 min. Die Daten zur Sauerstoffverbrauchsrate wurden mit der Software Wave v.2.2.1 (Agilent) analysiert.

Itacon-, Mesacon- oder Citraconsäure (13,0 mg, 100 µM) oder Oxalessigsäure (13,2 mg, 100 µM) wurden parallel zu einem Satz von vier 2-ml-Eppendorf-Röhrchen mit reduziertem L-Glutathion (30,7 mg, 100 µM) gegeben. Die Reaktionsmischungen wurden in Milli-Q-Wasser (1 ml) gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Aliquots von 10 µl wurden in LC-MS-Fläschchen überführt, die Milli-Q-Wasser (490 µl), Acetonitril (495 µl) und Diphenhydraminhydrochlorid (5 µl einer 10 µM Lösung in Acetonitril) als internen Standard enthielten. Die Fläschchen wurden verschlossen, gevortext und einer Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-hochauflösenden Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung eines Dionex UltiMate 3000 UHPLC+ fokussierten/Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap LC-MS/MS-Systems (ThermoFisher Scientific) unterzogen. Dieses System besteht aus der Dionex UltiMate 3000 RS-Pumpe, dem RS-Autosampler, dem RS-Säulenkompartiment, dem Diodenarray-Detektor und dem Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer sowie der Standardsoftware Xcalibur v.4.4.16.14 für den Betrieb. Als stationäre Phase wurde eine RP EC 150/2 NUCLEODUR C18 Pyramid, 3 µm (150 mm × 2 mm) Säule (Macherey-Nagel) und ein binäres Lösungsmittelsystem A und B (A = Wasser mit 0,1 % Ameisensäure; Als mobile Phase wurde B = Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure verwendet. In einem Gradientenlauf wurde der B-Prozentsatz von 0 bis 2 Minuten bei einer Anfangskonzentration von 1 % konstant gehalten, dann von 1 % nach 2 Minuten auf 60 % nach 8,5 Minuten und dann auf 95 % nach 9,5 Minuten erhöht und bei gehalten 95 % für 0,4 Min. Das Injektionsvolumen betrug 2 μl und die Flussrate wurde auf 250 μl/min eingestellt. Die Säulentemperatur betrug 40 °C und die Ultraviolettspur wurde bei einer Wellenlänge von 254 nm erfasst. Hochauflösende Massenspektrometriedaten wurden mit einem Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap-System aufgezeichnet. Massenspektren wurden im positiven Modus von 100 bis 1000 m/z aufgenommen. Die MS-Analyse durch beheizte Elektrospray-Ionisation wurde bei einer Sprühspannung von 3800 V und einer Ionentransferrohrtemperatur von 350 °C durchgeführt.

Alle Rechenarbeiten wurden mit Molecular Operating Environment (MOE), v.2020.09, Chemical Computing Group ULC, 910–1010 Sherbrooke St. W. Montreal, Quebec, H3A 2R7, Kanada, durchgeführt. Das Berechnungsverfahren wurde mit geringfügigen Änderungen aus einem gemeldeten Protokoll37 übernommen.

Die zweidimensionalen Strukturen von Itaconsäure, Mesaconsäure und Citraconsäure wurden mit ChemDraw Professional 19.0 skizziert und in das MOE-Fenster importiert. Die Verbindungen wurden einer Energieminimierung bis zu einem Gradienten von 0,001 kcal mol−1 Å2 unter Verwendung des MMFF94x-Kraftfeld- und R-Feld-Solvatisierungsmodells unterzogen und dann als mdb-Datei gespeichert. Der vorherrschende Protonierungsstatus der Verbindungen in wässrigem Medium bei pH 7 wurde über die Berechnung | berechnet Molekül | Wash-Befehl im Datenbank-Viewer-Fenster. Röntgenkristallstrukturen von menschlichem SDHA im Komplex mit dem Cofaktor Oxalacetat (PDB-ID: 6VAX)38, mitochondrialem Atmungskomplex II vom Schwein, enthaltend Oxalacetat (PDB-ID: 3SFD)39, menschlichem ACOD1 (PDB-ID: 6R6U)2 und Maus-ACOD1 (PDB ID: 6R6T)2 wurden für die molekularen Docking-Studien verwendet. Das Potenzial wurde auf Amber10:EHT als Kraftfeld und R-Feld zur Solvatation eingestellt. Das Hinzufügen von Wasserstoffatomen, das Entfernen von Wassermolekülen mit einer Entfernung von mehr als 4,5 Å vom Liganden oder Rezeptor, die Korrektur von Bibliotheksfehlern und die Minimierung der gebundenen Energie der Bindungsstelle wurden über das QuickPrep-Modul durchgeführt.

Die Bindungsstelle wurde auf Dummy-Atome festgelegt, die mit dem Site-Finder-Befehl identifiziert wurden. Die Aminosäurereste, die die Bindungsstelle von Oxalacetat/Succinat im aktiven Zentrum der SDHA-Untereinheit abgrenzen, wurden ausgewählt. Für ACOD1 wurde die Bindungsstelle anhand der mutmaßlichen aktiven Stelle2 definiert. Die Docking-Platzierung erfolgte über einen Dreiecks-Matcher mit einer Option zur induzierten Anpassungsverfeinerung. Die erste Bewertungsfunktion war Alpha HB mit 1.000 Posen, gefolgt von einer Verfeinerungsbewertung London dG mit 10 Posen.

Im Datenbank-Viewer-Fenster wurden molekulare Deskriptoren für alle Einträge berechnet, indem das Berechnungsfeld aktiviert und die Option „Deskriptoren berechnen“ ausgewählt wurde. Die Energien (eV) des niedrigsten unbesetzten Molekülorbitals und des höchsten besetzten Molekülorbitals wurden unter Verwendung des semiempirischen Hamilton-Operators Austin Model 1 (AM1) mit dem in MOE enthaltenen Quantenchemieprogramm MOPAC v.7.0 berechnet.

In der Datenbank mit den Dicarboxylaten wurde für alle Einträge der zweidimensionale Fingerabdruck BIT_MACCS (166 öffentliche MDL MACCS-Strukturschlüssel, bitgepackt) berechnet. Succinat wurde als Abfragestruktur ausgewählt und an das MOE-Fenster gesendet. Im Datenbank-Viewer-Fenster wurde die Ähnlichkeitssuche durch Auswahl von „Berechnen |“ durchgeführt Fingerabdruck | Suchbefehl. Das Fingerabdrucksystem wurde auf BIT_MACCS und den Tanimoto-Koeffizienten (TC) als Ähnlichkeitsmetrik eingestellt. Die TC-Werte reichen von 0 (keine Ähnlichkeit) bis 1 (vollständige Ähnlichkeit). Die Ähnlichkeitssuche für cis-Aconitat wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, wobei piDAPH3 (3-Punkt-Pharmakophor basierend auf der 3D-Konformation unter Berücksichtigung der atomaren Eigenschaften des Pi-Systems, des Donors und des Akzeptors) als Fingerabdruck und cis-Aconitat als Abfragestruktur verwendet wurde.

Die Signifikanz von Unterschieden zwischen mehr als zwei Gruppen wurde mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und anschließendem Dunnett-Mehrfachvergleichstest bewertet. Der ungepaarte t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz von Unterschieden zwischen zwei Gruppen mit n = 4 oder n = 3 zu bewerten, der Mann-Whitney-U-Test zum Vergleich der Mediane nicht normalverteilter Daten, wenn n ≥ 7. Wir haben eine Anpassung für das Testen mehrerer vorgenommen Hypothesen, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Die Signifikanz wurde als P-Wert oder Falscherkennungsrate ≤ 0,05 unter Verwendung der folgenden Symbole definiert: * ≤ 0,05, ** ≤ 0,01, *** ≤ 0,001 und **** ≤ 0,0001. In den zellulären Experimenten bezieht sich n immer auf biologische Replikate, zum Beispiel Zellen derselben Linie, die in einer separaten Vertiefung kultiviert wurden, aber denselben experimentellen Manipulationen unterzogen wurden wie die anderen Replikate. Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwerte angezeigt, wobei Fehlerbalken den SD-Wert angeben und statistische Analysen mit GraphPad Prism v.9.3.1 (GraphPad-Software) durchgeführt wurden. Für PCA wurden die Werte log2-transformiert und dann mit MetaboAnalyst v.5.0 (https://www.metaboanalyst.ca) analysiert. Venn-Diagramme wurden mit jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html) gezeichnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Die Quelldaten, die der Aminosäureanalyse zugrunde liegen, sind in der erweiterten Datenabbildung 5 und den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 3 und 4 sind in „Supplementary Data 1“ verfügbar. Die Rohdaten, die der in Abb. 2 gezeigten Multiplex-Zytokin-/Chemokin-Analyse und den „Extended Data“ in Abb. 6 zugrunde liegen, sind in „Supplementary Data 2“ verfügbar. Die Daten, die die anderen Darstellungen in diesem und anderen Aufsätzen unterstützen Die Ergebnisse dieser Studie sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir danken Annette Garbe und Tarequl Nishad Islam für die fachkundige technische Unterstützung und Djalil Coowar für die Überwachung der Tierpflege. Wir danken der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren für die Unterstützung durch das Projekt Aging and Metabolic Programming (AMPro), der Initiative Personalisierte Medizin (iMed) der Helmholtz-Gemeinschaft, dem Impuls- und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft und dem Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung Bildungspreis (BMBF) COVID-Protect (01KI20143C) (an FP). Zusätzliche Unterstützung kam vom Partnerstandort Gießen des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung (DZIF) (an SP) und der Alexander von Humboldt-Stiftung (an MS).

Open access funding provided by Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH (HZI).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: WAM Elgaher, M. Winterhoff, K. Büssow.

Forschungsgruppe Biomarker für Infektionskrankheiten, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig, Deutschland

F. Chen, M. Winterhoff, FH Waqas, N. Sahini, L. Czichon und F. Pessler

Forschungsgruppe Biomarker für Infektionskrankheiten, TWINCORE Zentrum für experimentelle und klinische Infektionsforschung, Hannover, Deutschland

F. Chen, M. Winterhoff, FH Waqas, N. Sahini, L. Czichon und F. Pessler

Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung Saarland – Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Saarbrücken, Deutschland

WAM Elgaher & AKH Hirsch

Abteilung Struktur und Funktion von Proteinen, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig, Deutschland

K. Bussow, E. Graner & W. Blankenfeldt

Neuroimmunologische Gruppe, Abteilung für Krebsforschung, LIH Luxembourg Institute of Health, Luxemburg, Luxemburg

Y. Pires-Afonso & A. Michelucci

Fakultät für Naturwissenschaften, Technologie und Medizin, Universität Luxemburg, Esch-Belval, Luxemburg

Y. Pires-Afonso

Abteilung für Molekulare Medizin, University of Dundee, Dundee, Großbritannien

L. Casares Perez & L. de la Vega

Fraunhofer-Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM), Hannover, Deutschland

W. Zobl & S. Schuchardt

Institut für Klinische Chemie und Klinische Pharmakologie, Universitätsklinikum Bonn, Bonn, Deutschland

T. Zillinger

Institut für Immunologie, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland

T. Zillinger

Institut für Medizinische Virologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, Gießen, Deutschland

M. Shehata & S. Pleschka

Nationales Forschungszentrum, Gizeh, Ägypten

M. Shehata

Partnerstandort des Deutschen Zentrums für Infektionsforschung Gießen, Gießen, Deutschland

S. Pleschka

Forschungsschwerpunkt Metabolomics, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland

H. Bähre

Abteilung für Transplantationsimmunologie, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland

C. Falk

Luxembourg Centre for Systems Biomedicine, Universität Luxemburg, Esch-Belval, Luxemburg

A. Michelucci

Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, Technische Universität Braunschweig, Braunschweig, Germany

W. Blankenfeldt

Fakultät für Pharmazie, Universität des Saarlandes, Saarbrücken, Deutschland

AKH Hirsch

Zentrum für Individualisierte Infektionsmedizin, Hannover, Deutschland

F. Peßler

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FC, MW, WAME, WB, AKHH, KB und FP haben die Studie konzipiert und gestaltet. FC, MW, FW, LCP und LdlV führten die zellbasierten Experimente durch. EG und KB führten die In-vitro-Tests durch. KB identifizierte eine ACOD1-Hemmung durch Citraconat. WAME führte Ligand-Target-Modellierung sowie Elektrophilie- und Ähnlichkeitsberechnungen durch. FC, NS und TZ erzeugten die ACOD1-/-Zellen. MW, FC, HB, WAME und SS führten die Massenspektrometrie durch. YP-A., FC und AM entwickelten das LPS-Mausmodell. LC führte das menschliche Lungenmodell durch. MS und SP führten eine Virustitration durch. CF führte die Zytokin-/Chemokin-Tests durch. FC, MW, WAME, KB und WZ analysierten die Daten. FC, MW, WAME, KB und FP haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren lesen die endgültige Fassung des Manuskripts und stimmen seiner Veröffentlichung zu.

Korrespondenz mit F. Pessler.

FP, FC, MW, KB, WB, AKHH und WAME sind Miterfinder eines Patents, das medizinische Anwendungen von Citraconat abdeckt, einschließlich immunmodulatorischer, antioxidativer und antiviraler Verwendung. VERWENDUNG VON CITRACONAT ALS MEDIKAMENT. Patentinhaber: Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung. Erfinder: Pessler F, Chen F, Winterhoff M, Büssow K, Blankenfeldt W, Hirsch AKA, Elgaher WM, PCT/EP2022/060682 (22. April 2022).

Nature Metabolism dankt Luke O'Neill, Ping-Chih Ho, Jan Van den Bossche und Xavier Deup für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin für Handhabung: Isabella Samuelson, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Die Zellen wurden 6 und 24 Stunden lang mit 25 mM des jeweiligen Isomers inkubiert und anschließend wurden die Konzentrationen der drei Isomere mittels HPLC-MS/MS in Überständen und Extrakten gewaschener Zellen gemessen. a–f, intrazelluläre Konzentrationen. Die absoluten Konzentrationen sind in a–c und die Anteile der anderen beiden Isomere in Bezug auf das dem Medium zugesetzte Isomer in d–f dargestellt. Bei Zugabe von Itaconat zum Medium kommt es zu einem dosisabhängigen Anstieg von Mesaconat (g), bei steigenden Itaconat-Konzentrationen kommt es jedoch zu einer Abnahme der Mesaconat/Itaconat-Fraktion (d). Beide Beobachtungen stimmen mit der intrazellulären Umwandlung einer kleinen Fraktion von Itaconat in Mesaconat durch einen sättigbaren, vermutlich enzymatischen Prozess überein. g–i, Itaconatkonzentrationen bleiben in Zellüberständen stabil. Die bekannten Verunreinigungen von Itaconat in Mesaconat und Citraconat werden erneut nachgewiesen (siehe auch ergänzende Abbildung S1c – g). n=3 biologische Replikate, Mittel ±SD.

a–h, die Mesaconat-Akkumulation erreicht ihren Höhepunkt nach der Itaconat-Akkumulation bei LPS-induzierter Entzündung und hängt von der vorherigen Itaconat-Synthese in dTHP1-Zellen ab. a–d, dTHP1-Zellen wurden mit LPS/IFNγ stimuliert und die intrazellulären Konzentrationen der drei Isomere wurden zu den angegebenen Zeitpunkten durch HPLC-MS/MS gemessen. Citraconat wurde nicht nachgewiesen. In ACOD1–/– dTHP1-Zellen wurden weder Itaconat noch Mesaconat nachgewiesen. Die maximale Itaconatkonzentration nach 24 Stunden betrug 460 µmol/L. n=3 biologische Replikate, Mittel ±SD. e–h, Bei C57BL/6N-Mäusen wurde durch intraperitoneale LPS-Injektion eine systemische Entzündung hervorgerufen, und die Konzentrationen der drei Isomere in Milzhomogenaten wurden zu den angegebenen Zeitpunkten durch HPLC-MS/MS gemessen. n=2 Mäuse pro Zeitpunkt. i–l, Mesaconat-Akkumulation in A549-Zellen, die ACOD1 überexprimieren. Menschliches oder murines ACOD1 wurde in A549-Zellen durch vorübergehende Transfektion exprimiert und die Konzentrationen der drei Isomere sowie ausgewählter TCA-Zwischenprodukte und Laktat wurden zu den angegebenen Zeitpunkten mittels HPLC-MS/MS gemessen. Werte

Analyse basierend auf dem in Abb. 1 gezeigten Experiment, zusätzlich mit Angabe des 24-Stunden-Zeitpunkts. Die Konzentration von 0,125 mM Itaconat wurde verwendet, um die maximale Kontamination von Itaconat nachzuahmen, die in 25 mM Mesaconat gefunden wurde. a–g, Konzentrationen der angegebenen Analyten 6 Stunden nach der Behandlung mit 5, 10 oder 25 mM und 24 Stunden nach der Behandlung mit 25 mM. h, Verhältnis von Succinat zu Fumarat, was auf eine SDH-Hemmung hinweist. n=3, Mittelwert ±SD. Ungepaarter T-Test. i,j, Succinatspiegel in IAV-infizierten dTHP1- und A549-Zellen, erhalten im selben Experiment wie in Extended Data Abb. 5d,e gezeigt und einem unabhängigen Experiment. Nur die Zugabe von Itaconat erhöht den Succinatspiegel, und der Effekt ist bei dTHP1 ausgeprägter als bei A549-Zellen. n=4 biologische Replikate, Mittelwert ±SD. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. P-Werte: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001.

a–c, Strukturen der GSH-Addukte der Itaconat-Isomere. d, Rangfolge der drei Isomere hinsichtlich der Elektrophilie. e–h, molekulare Modellierungsvorhersage der nichtkovalenten Bindung von Itaconat und Mesaconat an das aktive Zentrum von SDH. e, 3D-Bindungsmodus von Itaconat (gelb) im Vergleich zu Oxalacetat (magenta) in der Succinat-Bindungsstelle von menschlichem SDHA (PDB-ID: 6VAX)2. Die Bindung wurde vollständig durch ein Netzwerk elektrostatischer Anziehungen erreicht, d. h. Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrücken (gestrichelte Linien) zwischen den C1- und C4-Carboxylgruppen und den Resten des aktiven Zentrums (Thr308, Arg340, His407 und Arg451). Elektrostatische Proteinoberfläche am aktiven Zentrum: positiv (blau), negativ (rot), neutral (weiß). Flavinadenindinukleotid (FAD, grün). f, 2D-Ligandenwechselwirkungen von Itaconat. g, Möglicher Bindungsmodus von Mesaconat (gelb) im Vergleich zu Oxalacetat (magenta). Ähnlich wie bei Itaconat sind die C1- und C4-Carboxylgruppen von Mesaconat die ausschließlichen Einheiten, die für die Bindung über Wasserstoffbrückenbindungen und ionische Wechselwirkungen verantwortlich sind (gestrichelte Linien). Aufgrund seiner starren und planaren Struktur konnten jedoch im Vergleich zu Itaconat nur teilweise Kontakte hergestellt werden. h, 2D-Ligandenwechselwirkungen von Citraconat. i, Vergleich der SDH-Hemmung durch Itaconat, Mesaconat und Citraconat (In-vitro-Test unter Verwendung von Rindermitochondrien). Die SDH-Aktivität wurde in Gegenwart steigender Konzentrationen von Itaconat, Mesaconat, Citraconat und dem Kontrollinhibitor Malonat gemessen (n=3 unabhängige Tests, Mittelwert ±SD). Von den Isomeren war Itaconat der stärkste SDH-Inhibitor, es gab im Wesentlichen keine Hemmung durch Citraconat.

dTHP1- und A549-Zellen wurden unbehandelt gelassen oder mit Itaconat, Mesaconat oder Citraconat (20 mM) oder 4-Octylitaconat (4-OI, 125 µM) inkubiert, mit IAV PR8M (MOI = 1) infiziert und dann mit frischem Medium inkubiert, das enthielt die Behandlungen. Die Replikation wurde in dTHP1-Zellen 12 h pi durch Expression von HA-mRNA (RT-qPCR) und in A549-Zellen 24 h pi durch Messung von HA-mRNA (RT-qPCR) und Virustitern (Foci-Forming-Assay) gemessen. a, HA-mRNA (dTHP1-Zellen). b, HA-mRNA (A549-Zellen). c, IAV-Titer (A549-Zellen). n=4 biologische Replikate, Mittel ±SD. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. P-Werte: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001. Gemeinsame und einzigartige Wirkungen der Itaconat-Isomere auf den Aminosäurestoffwechsel in IAV-infizierten dTHP1- und A549-Zellen. dg, Gleicher Versuchsaufbau wie ac, außer dass 4-OI (125 µM) als zusätzliche Behandlung verwendet wurde. Die Konzentrationen von 20 Aminosäuren, 30 Aminosäuremetaboliten und 9 biogenen Aminen wurden mittels HPLC-MS/MS (MxP Quant 500 Kit, Biocrates) nach 12 Stunden für dTHP1 und 24 Stunden für A549 gemessen (n = 4 pro Gruppe). Zusätzliche Daten, einschließlich Konzentrationen einzelner Analyten und Werte von Metabolitenindikatoren, sind in den ergänzenden Abbildungen S3 und S4 dargestellt. d,e, PCAs basierend auf den 59 Aminosäure-bezogenen Analyten. d: In dTHP1-Zellen führt eine Infektion nur zu geringfügigen Veränderungen, während die drei Isomere ähnliche, aber klar erkennbare Wirkungen ausüben, die sich grundlegend von der Wirkung von 4-OI unterscheiden. e: In A549-Zellen hat eine Infektion einen viel stärkeren Einfluss auf den Aminosäurestoffwechsel. f, Venn-Diagramme, die Analyten zeigen, die in A549- und dTHP1-infizierten und nicht infizierten Zellen unterschiedlich häufig vorkommen (ungepaarter T-Test, FC>1,3, FDR ≤0,05). g, Venn-Diagramme für die Metabolitenindikatoren (66 Summen und Verhältnisse funktionell verwandter Analyten, berechnet mit der Biocrates MetaboIndicatorTM-Software). Quelldatentabelle 1 enthält die Quelldaten zu dg.

a,b, Expression von 14 potenziell NRF2-induzierbaren Genen in WT- und NRF2–/– HaCaT-Zellen 17,5 Stunden nach Verabreichung von Itaconat-Isomeren (20 mM). Der größte Unterschied zwischen der Expression in WT- und KO-Zellen wird bei der Verabreichung von Citraconat beobachtet. c–e, Induktion von SLC7A11-, GCLM- und ME1-mRNA in IAV-infizierten dTHP1-Zellen durch Citraconat, aber nicht durch Mesaconat. Die Zellen wurden 12 Stunden lang mit Itaconat-Isomeren (20 mM) vorbehandelt, 2 Stunden lang mit virushaltigem Medium inkubiert (MOI = 1) und dann weitere 10 Stunden lang mit frischem Medium, das Itaconat-Isomere enthielt, inkubiert. f–q, Immunmodulatorische Wirkungen der Itaconat-Isomere. IAV-Infektionsexperiment identisch mit c–e. f–h, Expression der angegebenen mRNAs in Zellen (RT-qPCR). i–q, Konzentrationen der angegebenen Zytokine/Chemokine in Kulturüberständen (Multiplex-Mikrokügelchen-Assay). Die Quelldatentabelle S2 enthält die Rohdaten zu i–q. aq, n=3 biologische Replikate, Mittelwerte ±SD. P-Werte: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001; einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett.

a,b, Zellfreier Assay. Rekombinantes mACOD1 wurde mit steigenden Konzentrationen an Substrat (cis-Aconitat) und Inhibitor (Citraconat) inkubiert und die Itaconat-Akkumulation wurde mittels HPLC gemessen. n=3 unabhängige Tests, Mittelwerte ±SD. Kinetische Daten zu den in Abb. 3c aufgeführten Werten. Die Linie stellt eine Kurvenanpassung an die Michaelis-Menten-Gleichung mit einem kompetitiven Inhibitor dar. b, Lineweaver-Burk-Diagramm der in a gezeigten Daten. c, Ähnlichkeit mit cis-Aconitat (Tanimoto-Koeffizient) und Bindungsenergien der Itaconat-Isomere an menschliches und murines ACOD1. d, Mutmaßlicher Bindungsmodus von Citraconat (gelb) im aktiven Zentrum von Maus-ACOD1 (PDB-ID: 6R6T)1. Die C1- und C4-Carboxylgruppen von Citraconat binden elektrostatisch über Wasserstoffbrückenbindungen und Ionenkontakte (gestrichelte Linien) an die Reste des aktiven Zentrums (His103, His159, Lys207, Lys272 und Leu278). Elektrostatische Proteinoberfläche am aktiven Zentrum: positiv (blau), negativ (rot), neutral (weiß). e, 2D-Ligandenwechselwirkungen von Citraconat. f, Überlagerung der mutmaßlichen Bindungsmodi von Citraconat (gelb), Itaconat (cyan) und Mesaconat (grün) im Vergleich zu denen des Substrats cis-Aconitat (magenta) im aktiven Zentrum von menschlichem ACOD1 (PDB-ID: 6R6U)1. Nur Citraconat kann den gleichen Bindungsmodus wie cis-Aconitat annehmen, wobei die cis-orientierten Carboxylgruppen vollständig an den Wechselwirkungen mit den Resten des aktiven Zentrums (His159, Lys207, Lys272 und Leu278) beteiligt sind. Im Gegensatz dazu interagieren die Carboxylgruppen von Itaconat und Mesaconat teilweise, was zu einer geringeren Bindungsaffinität führt.

Die LPS/IFNγ-Stimulation und die Behandlung mit Citraconat oder Itaconat (1 mM oder 25 mM) wurden wie in Abb. 4m-o durchgeführt. Die mitochondriale Atmung wurde mittels Seahorse-Assay in nicht stimulierten dTHP1-Zellen oder nach 12 Stunden Stimulation gemessen. ac, Balkendiagramme, die die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) aufgrund der Basalatmung, der maximalen Atmung (a und b) und der freien Atemkapazität (c) zeigen. 25 mM Itaconat reduzierten die maximale Atmung und die freie Atemkapazität in LPS/IFNγ-induzierten dTHP1-Zellen signifikant, während bei 1 mM Citraconat eine Tendenz bestand (p = 0,076 bzw. 0,096), diesen Rückgang zu verhindern, und bei 25 mM eine Tendenz bestand Itaconat zur Normalisierung der freien Atemkapazität (p=0,082). In einem (biologischen Replikat) waren wie folgt: unbehandelt = 5; 1 mM Citra = 4; 25 mM Citra = 3; 1 mM Ita = 4; 25 mM Ita = 4. In bn waren wie folgt: unbehandelt = 5; 1 mM Citra = 5; 25 mM Citra = 3; 1 mM Ita = 4; 25 mM Ita = 4. Die Ergebnisse in c werden aus dem in a und b gezeigten Experiment berechnet und haben daher das gleiche n wie die jeweiligen Behandlungen in a und b. Mittel ±SD; einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest. P-Werte: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001. dh, OCR-Ausgabekurven, die die Grundlage für die in ac dargestellten Diagramme bilden. d, Nicht stimulierte vs. LPS/IFNγ-stimulierte Zellen. e, Citraconat-Behandlung, nicht stimulierte Zellen. f, Citraconat-Behandlung, LPS/IFNγ-stimulierte Zellen. g, Itaconat-Behandlung, unstimulierte Zellen. h, Itaconat-Behandlung, LPS/IFNγ-stimulierte Zellen. Die Ergebnisse in dh werden aus dem in a und b gezeigten Experiment berechnet und haben daher das gleiche n wie die jeweiligen Behandlungen in a und b. Bedeutet ±SD. P-Werte: * ≤0,05, ** ≤0,01, *** ≤0,001, **** ≤0,0001; einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett. Abkürzungen: FCCP = Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon; Oligo = Oligomycin; Rot = Rotenon; AA = Antimycin A.

Ergänzende Abbildungen. 1–6 und Tabellen 1 und 2.

Quelldaten der LC-MS/MS-Aminosäureanalyse in Bezug auf Extended Data Abb. 5 und ergänzende Abbildungen. 3 und 4.

Quelldaten der Mikrokügelchen-Multiplex-Zytokin-/Chemokinanalyse in Bezug auf Abb. 2 und erweiterte Daten Abb. 6.

Quelldaten-Blots für die ergänzende Abbildung 6b.

Unbeschnittene Membranbilder von Immunoblots, Abb. 2a, j und k.

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Chen, F., Elgaher, WAM, Winterhoff, M. et al. Citraconat hemmt die ACOD1 (IRG1)-Katalyse, reduziert Interferonreaktionen und oxidativen Stress und moduliert Entzündungen und Zellstoffwechsel. Nat Metab 4, 534–546 (2022). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00577-x

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Eingegangen: 20. Mai 2021

Angenommen: 20. April 2022

Veröffentlicht: 02. Juni 2022

Ausgabedatum: Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00577-x

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